ANTECEDENTES Ferritina Ferritina es un heteropolímero compuesto por 24 subunidades de 2 tipos, la subunidad pesada (H) y la ligera (L). En su forma apo (sin Hierro) esta molécula presenta un masa molecular de aproximadamente 450 kda (Theil y col., 1990). Su principal función es almacenar hierro (Fe), siendo capaz de captar hasta 4,500 átomos de este elemento, el cual es utilizado en procesos celulares vitales posteriores, tales como trasporte de oxígeno, transferencia de electrones, fijación de nitrógeno, síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) y producción de hemoproteínas como la hemoglobina, mioglobina y citrocromos. Además al aumentar los niveles intracelulares de fierro, la ferritina cumple la función de destoxificación celular, al secuestrar este elemento y evitar así la producción de especies reactivas de oxigeno, generadas en presencia de Fe libre en el citosol mediante la reacción de Fenton (Worwood, 1990; Harrison y col., 1996; Koorts y col., 2007; Arosio y col., 2008). La ferritina es una proteína altamente conservada evolutivamente, se encuentra expresada tanto en procariotes como en eucariotes. Interesantemente esta biomolécula presenta una gran homología entre los diferentes organismos, por ejemplo, la cadena L en humanos, cerdos, caballos y ratas presenta una similitud de un 85%, mientras que la cadena H presenta un 90% de similitud entre el humano, rata y pollo (Levi y col., 1992; Harrison y col., 1996). Estructura de Ferritina Es una proteína globular, con un diámetro exterior de 124-130 Å e interior de 70-80 Å; posee una masa molecular promedio de 450 kda en su forma apo; en su estado Holo (saturada de fierro) alcanza los 900 kda de masa molecular (Ford y col., 1984; Harrison y col., 1996; Forrellat y col., 2000; Koorts y col., 4
2007) (Figura 1A). Las dos cadenas (H y L) presentan una homología de un 54% entre ellas. La subunidad H tiene una masa molecular de 21,226 Da, conformada por 183 aminoácidos; por otro lado la subunidad L presenta una masa relativa de 20,020 Da constituida por 175 aminoácidos (Uniprot) (Tabla I, A y B) (Harrison y col., 1996: Koorts y col., 2007; Arosio y col., 2008). La ferritina es una molécula muy estable ante condiciones de desnaturalización térmica y química, característica atribuida principalmente a los enlaces iónicos presentes en la subunidad ligera (Santambrogio y col., 1992; Harrison y col., 1996), por tal razón, las isoformas que presentan mayor proporción de cadenas L, como ferritina sérica, son más resistentes a la desnaturalización (Finch y col., 1984; Santambrogio y col., 1992). Almacenamiento de Fe por Ferritina El proceso de captación y almacenamiento de Fe en ferritina ha sido bien caracterizado. Este proceso sucede en tres etapas consecutivas: la primera es la fase más rápida, y se lleva a cabo mediante interacciones electrostáticas del Fe +2 y los ácidos glutámicos de la cara externa de la subunidad H (Harrison y col., 1996; Santambrogio y col., 1996), comenzando inmediatamente después la segunda etapa que consiste en la oxidación del Fe +2 a Fe +3, lo que se realiza en el centro ferroxidasa presente en la subunidad H, pero ausente en la cadena L (Wade y col., 1991; Chasteen y col., 1999). Finalmente la tercera etapa, y la más lenta del proceso, tiene como finalidad la formación del núcleo de Fe, requiriéndose la acción conjunta de las dos subunidades (Arosio y col., 1991; Harrison y col., 1996). Una vez formado el núcleo, el fierro es almacenado como cristales de hidróxido de fosfato férrico [(FeOOH 8 ). FeO. PO 3 H 2 ], y se considera que la relación optima para que la ferritina adquiera la capacidad máxima de almacenamiento, es del 70% de subunidad ligera (Forrellat y col., 2000; Arosio y col., 2008). 5
Figura 1. Aspectos estructurales de la ferritina. A. Ferritina empaquetada en 24 subunidades. B. Cadenas dobladas en 4 α-hélices. (Arosio y col., 2008). 6
Tabla I. Secuencia de aminoácidos de ferritina humana. A. Subunidad ligera (L). B. Subunidad pesada (H). A. 10 20 30 40 50 60 MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSH FFRELAEEKR 70 80 90 100 110 120 EGYERLLKMQ NQRGGRALFQDIKKPAEDEW GKTPDAMKAA MALEKKLNQA LLDLHALGSA 130 140 150 160 170 RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLT NLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD B. 10 20 30 40 50 60 MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS 70 80 90 100 110 120 HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK 130 140 150 160 170 180 LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG APESGLAEYLFDKHTLGDSD NES (Uniprot). 7
Liberación de Fe de la Ferritina Aún no se conoce completamente el proceso de liberación de fierro por ferritina. Estudios in vitro sugieren que la liberación se lleva a cabo a través de los canales presentes en la molécula, mismos que le sirven tanto de entrada como salida. Reportes previos han sugerido que en el proceso de liberación, la reducción del estado férrico a ferroso es la etapa inicial del proceso. Posteriormente, este elemento debe ser transportado hacia el exterior de la proteína a través de una molécula transportadora/acarreadora, como un agente quelante, liberando así al fierro de ferritina (Yang y col., 2000). Otros trabajos sugieren que la subunidad H presenta actividad intrínseca de reductasa, por lo que tiene la capacidad de oxidar y reducir el Fe, según las necesidades de la célula. Estudios in vivo, no han establecido la existencia de un mecanismo de liberación de fierro de ferritina (Thiel, 1990, Harrison y col, 1996). Ferritina sérica. La isoforma de ferritina más estudiada, y por lo tanto mejor caracterizada, es la citosólica, a diferencia de la isoforma sérica, que a pesar de presentar alta semejanza con su homóloga intracelular (alrededor de un 80%), no se ha caracterizado a detalle (Cai y col., 1997, Orino y col., 2008; Arosio y col., 2008; Wang y col., 2010). La función de la ferritina sérica se desconoce, aunque actualmente se utiliza ampliamente como marcador clínico de varias patologías relacionadas con procesos inflamatorios, y en alteraciones en los niveles de Fierro (Harrison y col., 1996; Arosio y col., 2008; Wang y col., 2010). Al igual que la ferritina citosólica, la ferritina sérica está conformada por 24 subunidades, en su gran mayoría cadenas ligeras (23 a 24 subunidades L por molécula), siendo capaz de captar niveles traza de fierro. Interesantemente, la ferritina sérica se encuentra glicosilada con N-oligosacáridos, siendo los monosacáridos manosa, glucosa y ácido siálico las moléculas principales; así mismo, es importante mencionar que el perfil de glicosilación de la ferritina 8
sérica no ha sido caracterizado a detalle (Arosio y col., 1991; Arosio y col., 2008). La concentración fisiológica de ferritina sérica oscila entre 15 y 300 µg/l (Covell y col., 1984; Worwood, 1990). Su origen se desconoce, sin embargo algunos investigadores han propuesto que dicha molécula es un producto de la excreción celular (Arosio y col., 2008), por otro lado, se plantea la hipótesis de que es un producto de liberación originado por la lisis celular de tejidos (Worwood, 1990). Algunos autores han descrito la relación directa de los niveles intracelulares de fierro con los niveles de ferritina sérica (Finch y col., 1984), por otro lado, se ha observado relación entre el nivel de ferritina plasmática y el fierro almacenado, por el grupo de Cazzola y cols., quienes sugieren que la sobrecarga de Fe aumenta la expresión intracelular de subunidad L, siendo este evento directamente proporcional a los niveles de expresión de ferritina sérica (Halliday y col., 1979; Cazzola y col., 1986). Algunas patologías inducen desequilibrio en los niveles de ferritina sérica, como es el caso de la necrosis tisular de algunos órganos (como hígado y bazo), neoplasias, osteoartritis y diabetes mellitus (Hershko y col., 1984; Cazzola y col., 1986; Torti y col., 1994; Arosio y col., 2008). En estas patologías se ha propuesto al incremento en los niveles de Fe como factor de riesgo, sin embargo, se desconoce la posible asociación y/o participación de la ferritina sérica en estos procesos dismetabólicos, así como la función y origen de esta biomolécula (Niitsu y col., 1984; Koorts y col., 2007), siendo por estas razones la importancia de purificar la ferritina sérica para así poder estudiarla a detalle. 9
Técnicas de purificación para ferritina sérica. Son pocos los trabajos que describen métodos para purificar ferritina, siendo el método de referencia el propuesto por Worwood y col. en 1976, el cual consiste en una cromatografía de intercambio iónico, bajo las siguientes condiciones: La muestra se carga en una matriz de Sephadex A-50, equilibrada con buffer veronal (barbital sódico 0.05 M y HCl 0.05 M) a un ph de 6.8. Posteriormente las proteínas se eluyen al aumentar la fuerza iónica, con NaCl, del buffer anterior. La concentración de ferritina se determina espectrofotométricamente a 280 nm o por ensayo inmunoradiométrico. La presencia de ferritina sérica se determina mediante geles de poliacrilamida en condiciones nativas, desnaturalizantes y reductoras. Este método cromatográfico presenta algunas desventajas, como una baja afinidad hacia ferritina sérica, la cual es reflejada en los bajos porcentajes de recuperación proteica (Worwood y col., 1975; Worwood y col., 1976). En 1981, este mismo grupo de investigadores modificó su método para purificar ferritina sérica, proponiendo el procedimiento experimental siguiente: La muestra (2.5 L de suero, en promedio) es pre-tratada con un volumen igual de acetato de sodio 0.05 M, posteriormente se ajusta el ph a 4.8 con ácido acético 1 M, se calienta a 70 C por 10 min, y después de reposar en hielo, se centrifuga a 10,000xg durante 30 min. Al sobrenadante obtenido se ajusta el ph a 6.8 con NaOH 1 M, y se concentra el volumen de muestra mediante centrifugación (membrana Amicon XM 100A). Posteriormente, la muestra se somete a una cromatografía de afinidad con anticuerpos anti-ferritina de bazo de humano (Worwood y col., 1976); la fracción de elución obtenida se concentra de igual forma. Inmediatamente después la fracción de elución se aplica a una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex A-50, y finalmente se somete a una cromatografía de filtración en gel con Sephadex G-200 (Worwood y col., 1981). Los resultados generados por este grupo mostraron alrededor de un 20% de recuperación de ferritina. La pureza se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS- 10
PAGE), en gradiente del 4 al 15%, observándose la presencia de cadenas tanto ligeras como pesadas, siendo esta última apenas detectada. También aparece una tercera banda la cual la denominaron subunidad G, con masa molecular de 23 kda, la cual se encuentra glucosilada (Worwood y col., 1981). Este método se considera el de referencia, y ha sido ampliamente utilizado por diversos investigadores desde su publicación en la década de los ochenta. Cromatografía La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) define a la cromatografía de forma general, como un método empleado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases: una estacionaria, y otra móvil. La fase estacionaria puede ser compuesta de un sólido o un líquido, el cual es soportado en un sólido o en un gel (matriz) (Skoog y col., 2001), y puede ser empaquetada en una columna, extendida en una capa o distribuida como una película, de tal forma que cada componente de la muestra interactúa en forma diferente con la fase móvil. Si las características de ambas fases y la longitud de la columna son las óptimas, se logrará la separación completa de todos los componentes de la muestra (Skoog y col., 2001). La cromatografía presenta algunas ventajas tales como la capacidad de utilizarse desde microescala hasta escalas industriales, la de mantener la muestra en condiciones nativas, además de ser una técnica de bajo costo y ampliamente probada (Hage 1999). Las características de interés de la muestra son directrices para la elección del método cromatográfico a utilizar, con la finalidad de optimizar el proceso de purificación de proteínas. Por ejemplo, si la separación es en base a su masa molecular se utilizará cromatografía de filtración en gel, si se desea separar proteínas con carga se empleará cromatografía de intercambio iónico, si se requiere la separación de biomoléculas hidrofóbicas la cromatografía de hidrofobicidad es la mejor opción. Por otro lado se cuenta con la cromatografía 11
de afinidad, la cual se basa en el bioreconocimiento específico de la molécula de interés (ligando especifico) (Amersham Biosciences, 2001a). Cromatografía de Afinidad Esta cromatografía tiene como fundamento al reconocimiento de biomoléculas de manera específica, característica que se logra incorporando en una matriz cromatográfica, un ligando con alta afinidad y especificidad hacia la proteína de interés, por ejemplo, anticuerpos (Cuatrecasas y col., 1970; Amersham Biosciences, 2001a; Lee y col., 2003). Debido a su alta especificidad, este método de separación es ampliamente utilizado, ya que presenta altos porcentajes de recuperación, además de minimizar pasos para la purificación. Lo anterior implica entonces un óptimo uso del tiempo, y en el caso específico de la cromatografía de afinidad donde se utilizan anticuerpos (monoclonales o policlonales) como ligandos (inmunopurificación), el método cromatográfico se optimiza (Cuatrecasas y col., 1968; Hage y col, 1999; Amersham Biosciences., 2001a; Gottstein y col., 2002). En la cromatografía de afinidad, la selección del anticuerpo es pieza clave para optimizar el método, y la constante de afinidad presente en ellos es la característica más importante para perfeccionar el proceso de purificación de proteínas. La mayor parte de los trabajos enfocados para la purificación de ferritina sérica han sido basados en cromatografía de afinidad, utilizando anticuerpos que reconocen específicamente a ferritina, obteniendo buenos resultados (Lorraine, 1977; Lee y col., 1987; Chou y col., 2001). 12