artículo original/artigo original Caracterización molecular de aislamientos de Escherichia coli productores de diarrea en niños y adultos de la ciudad de Corrientes, Argentina Molecular characterization of diarrheagenic Escherichia coli isolates from children and adults in the city of Corrientes, Argentina Patricia Esquivel 1 Viviana Lifschitz 2 Liliana S. Lösch 3 Marcelo G. Medina 3 Ana M. Pato 4 Adriana Cacciamani 5 Luis A. Merino 6* 1 Magister en Ciencias del Medio Ambiente y la Salud. Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina; 2 Magister en Ciencias del Medio Ambiente y la Salud. Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina y Laboratorio de Microbiología, Hospital J. R. Vidal, Corrientes, Argentina; 3 Magister en Ciencias Médicas Tropicales. Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina; 4 Especialista en Microbiología. Laboratorio de Microbiología, Hospital A. I. de Llano, Ayacucho 3288, Corrientes, Argentina; 5 Bioquímica. Laboratorio de Microbiología, Hospital J. R. Vidal, Necochea 1050, Corrientes, Argentina; 6 Doctor en Bioquímica. Facultad de Medicina, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2001, Corrientes, Argentina. Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21. Conflicto de intereses: ninguno Recibido en 24/6/2009. Aceptado para publicación en 12/4/2010. Resumen El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de Escherichia coli diarreogénicas en la ciudad de Corrientes. De pacientes con diarrea de los cuales no se aisló Salmonella ni Shigella, se seleccionaron aislamientos de E. coli los cuales se estudiaron mediante PCR múltiple usando cebadores que detectan los siguientes genes: elt, est, eae, stx, ipah y aggr. En 40 (31%) muestras provenientes de 129 pacientes se detectaron cepas de E. coli portadoras de algún factor de patogenicidad, siendo la frecuencia global de los tipos patogénicos la siguiente: E. coli enterotoxigénica - ECET (8,5%), E. coli enteroagregativa - ECEA (7,8%), E. coli productora de toxina Shiga - ECTS (7,0%), E. coli enteropatógena - ECEP (4,7%) y E. coli enteroinvasiva - ECEI (3,1%). La prevalencia de E. coli diarreogénicas encontrada en pacientes con diarrea aguda justifica la utilización de métodos de biología molecular para arribar a un correcto diagnóstico etiológico que aporte conocimientos tendientes a tomar medidas de prevención y control de estas patologías. Palabras clave: Escherichia coli, diarrea, factores de virulencia. Abstract The aim of this work was to determine the frequency of diarrheagenic Escherichia coli in the City of Corrientes, Argentina. In patients with diarrhea in which nor Salmonella or Shigella were recovered, the isolates of E. coli were selected to be studied by multiplex PCR using primers that detect the following genes: elt, est, eae, stx, ipah and aggr. Over 129 patients, E. coli strains carrying at least one pathogenicity factor were detected in 40 (31%) samples. The overall incidence of pathogenic types was: enterotoxigenic E. coli - ETEC (8.5%), enteroaggregative E. coli - EAEC (7.8%), Shiga toxin-producing E. coli - STEC (7.0%), enteropathogenic E. coli - EPEC (4.7%) and enteroinvasive E. coli - EIEC (3.1%). The frequency of diarrheagenic E. coli found in patients with acute diarrhea justifies the use of molecular biology methods to achieve at the right etiologic diagnosis, which will provide the knowledge 17
Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21. to take the measures for prevention and control of these diseases. Key words: Escherichia coli, diarrhea, virulence factors. Introducción A pesar de la existencia de estudios que indican que Escherichia coli es un importante agente etiológico de diarrea y representa el mayor problema de salud pública en los países en desarrollo, (1) en los cultivos rutinarios de muestras provenientes de pacientes con diarrea aguda sólo se llega al diagnóstico etiológico en aquellos casos en los cuales el agente involucrado son Salmonella, Shigella o Campylobacter. E. coli presenta un amplio conjunto de serotipos entre los cuales sólo algunos son responsables de causar enteritis en humanos y dado que la mayoría de ellos se encuentran formando parte de la biota habitual del tracto digestivo del hombre, cada vez que se obtiene un aislamiento de esta bacteria a partir de heces diarreicas se hace imprescindible diferenciar aquellos tipos capaces de producir enfermedad entérica de aquellos que sólo se encuentran como comensales. (2) Las cepas diarreogénicas de Escherichia coli se clasifican en Escherichia coli Enterotoxigénica (ECET), Escherichia coli Enteropatógena (ECEP), Escherichia coli Enteroinvasiva (ECEI), Escherichia coli Enteroagregativa (ECEA), Escherichia coli productora de toxina Shiga (ECTS) y Escherichia coli de Adherencia Difusa (ECAD). (1) Datos publicados por diversos autores atribuyen a cada tipo patogénico distribuciones diferentes según la edad de los pacientes y regiones geográficas. (3,4) El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de los diferentes tipos patogénicos de E. coli productores de diarrea obtenidas en la ciudad de Corrientes (Argentina). Materiales y métodos Pacientes: Se incluyeron en el presente trabajo pacientes pediátricos y adultos con cuadro de diarrea aguda, definida como el aumento de la frecuencia, fluidez y/o volumen de las deposiciones, con pérdida variable de agua y electrolitos y cuya duración es menor de 14 días, (5) que asistieron en carácter de ambulatorios entre noviembre de 2005 y noviembre de 2007 a dos centros de salud privados y dos hospitales de la ciudad de Corrientes. Los pacientes adultos y los tutores legales que acompañaban a los niños prestaron su consentimiento escrito para la toma de muestra y fueron informados acerca del uso que se haría de los resultados de los análisis efectuados, según el protocolo aprobado por los Comités de Ética de las instituciones participantes. Determinación del tamaño de la muestra: Durante el año 2005 se notificaron a través de los laboratorios 58 casos de diarrea aguda por cada 100.000 habitantes en la provincia de Corrientes (6) y si se tiene en cuenta que la población de la ciudad de Corrientes, capital de la provincia homónima, es de aproximadamente 330.000 habitantes 7, podría inferirse que en los dos años estudiados debieron notificarse cerca de 380 casos de diarrea aguda en esa ciudad. Si se toma como base los datos de prevalencia de E. coli diarreogénicas en otros países (máxima: 10% y mínima: 1%), (8-10) mediante el programa Epi Info se obtiene que para una población de 380 pacientes con diarrea aguda es necesario estudiar un mínimo de 91 pacientes (Nivel de confianza 99,9%). Recolección y procesamiento de muestras: Las muestras de heces se recolectaron y procesaron por métodos habituales de coprocultivo para la detección de patógenos gastrointestinales. (11) De cada dos casos que arrojaron resultados negativos para Salmonella y Shigella, se seleccionó un cultivo y de éste, se conservaron en agar blando 5 aislamientos identificados bioquímicamente como Escherichia coli. Estas cepas fueron posteriormente resembradas en agar Cisteína Lactosa Deficiente en Electrolitos durante 18 horas a 37ºC. (11) Detección de genes de virulencia: Una colonia de cada aislamiento se resuspendió en 200 ml de Tritón 1% en buffer Tris-EDTA (ph 8,0). Luego de 10 minutos de incubación en baño de agua a 100ºC las muestras fueron centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos y el ADN presente en el sobrenadante fue usado como templado. Este procedimiento es una modificación del propuesto por Toma y cols. quienes parten de bacterias provenientes de un cultivo nocturno en caldo Luria-Bertani y como agente lisante utilizan un buffer conteniendo Tween 20 y proteinasa K. (12) La amplificación mediante PCR se realizó de acuerdo al protocolo estandarizado por Toma y cols. (12) Brevemente, la mezcla de reacción contenía 10 mm de TRIS- HCl (ph 8,3), 50 mm de KCl, 0,1% de gelatina, 1,5 mm de Cl 2 Mg, 2,5 U de Taq ADN polimerasa, 0,2 mm de desoxinucleótidos trifosfato, los cebadores en las concentraciones que se muestran en la tabla 1 y 5 ml del templado. Se utilizaron 6 pares de cebadores que detectan 6 genes codificantes de factores de virulencia correspondientes a 5 tipos patogénicos a saber: ECET (elt y est), ECEP (eae), ECTS (stx), ECEI (ipah) y ECEAg (aggr). El programa de amplificación fue de 30 ciclos de: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 52ºC y 1 minuto a 72ºC más una extensión final de 10 minutos a 72ºC. Como controles positivos se incluyeron cepas de E. coli correspondientes a las diferentes categorías patogénicas y como control negativo se utilizó un aislamiento de E. coli ATCC 25922, carente de los 18
Tabla 1. Características de los cebadores utilizados en la caracterización de aislamientos de Escherichia coli mediante PCR múltiple Cebador Concentración en la mezcla Gen Tamaño banda (Pb) Sequencia (5 to 3 ) SK1 0,125 µm CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC eae 881 SK2 0,125 µm CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG VTcom-u 0,25 µm GAGCGAAATAATTTATATGTG stx 518 VTcom-d 0,25 µm TGATGATGGCAATTCAGTAT AL65 0,5 µm TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG est 147 AL125 0,5 µm CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC LTL 0,25 µm TCTCTATGTGCATACGGAGC elt 322 LTR 0,25 µm CCATACTGATTGCCGCAAT ipaiii 0,125 µm GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC IpaH 619 ipaiv 0,125 µm GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC aggrks1 0,25 µm GTATACACAAAAGAAGGAAGC AggR 254 aggrks2 0,25 µm ACAGAATCGTCAGCATCAGC Abreviaturas: ECET: E. coli Enterotoxigénica, ECEA: E. coli Enteroagregativa, ECTS: Escherichia coli productora de toxina Shiga, ECEP: E. coli Enteropatógena, ECEI: E. coli Enteroinvasiva, ECEH: E. coli Enterohemorrrágica Tipos ECEP y ECEH ECTS ECET ECET ECEI ECEA factores de patogenicidad buscados. De cada producto final de la PCR, 20 ml se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% durante 35 minutos a 75 V. El gel fue teñido durante 10 minutos con bromuro de etidio (0,5 mg/ml) y visualizado con luz UV. El buffer utilizado tanto en la cuba electroforética como en la preparación del gel de agarosa fue TRIS-Acetato-EDTA (TAE). Los patrones de banda obtenidos se analizaron mediante el programa UVITec. Análisis estadístico: El tratamiento estadístico de los datos se llevó a cabo mediante el programa Epi Info 2000 aplicándose la prueba de chi cuadrado para variables cualitativas, considerando el Test Exacto de Fisher para valores menores a 5 y fijándose un valor de p <0,05 para la significación estadística. Resultados Sobre 320 cultivos de materia fecal realizados en los centros participantes, 258 (80%) fueron negativos para Salmonella o Shigella. De éstos, 129 (50%) fueron seleccionados para estudiar los aislamientos de Escherichia coli. Estas muestras correspondieron a 85 pacientes con edades entre 1,2 meses y 14 años y a 44 pacientes con edades entre 16 y 73 años. En 40/129 muestras se detectaron cepas de Escherichia coli diarreogénicas lo que arroja una prevalencia del 31% en pacientes con diarrea aguda cuya etiología por Salmonella o Shigella había sido descartada. Si se considera que solamente se estudió la mitad de los cultivos negativos para esos dos patógenos, la prevalencia global de E. coli diarreogénicas Tabla 2. Frecuencia de los distintos tipos patogénicos de E. coli según el grupo etario de los pacientes estudiados Pacientes < 14 años Pacientes > 14 años Muestras Total n % n % n % Positivas 28 32,9 12 27,3 40 31,0 ECET 7 8,2 4 9,1 11 8,5 ECEA 8 9,4 2 4,5 10 7,8 ECTS 6 7,1 3 6,8 9 7,0 ECEP 3 3,5 3 6,8 6 4,7 ECEI 4 4,7 0 0 4 3,1 Negativas 57 67,1 32 72,7 89 69,0 Totales 85 100 44 100 129 100 Abreviaturas: ECET: E. coli Enterotoxigénica, ECEA: E. coli Enteroagregativa, ECTS: Escherichia coli productora de toxina Shiga, ECEP: E. coli Enteropatógena, ECEI: E. coli Enteroinvasiva. sobre el total de los pacientes incluidos sería del 25%. En la tabla 2 se presenta la frecuencia absoluta y porcentual de los resultados obtenidos según el grupo etario de los pacientes. Con la excepción de ECEI que no se detectó en pacientes mayores de 14 años, se hallaron genes de virulencia correspondientes a todos los tipos patogénicos estudiados en ambos grupos de edades, sin diferencias significativas entre los hallazgos de los diferentes tipos patogénicos y las edades de los pacientes. En aquellas muestras que resultaron positivas para el gen stx también se detectó el gen eae, ambos correspondientes al tipo patogénico ECST. 19
Rev Panam Infectol 2010;12(3):17-21. Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de E. coli diarreogénicas. Calles 2 a 13: cepas provenientes de pacientes con diarrea; calles 14 a 19: Controles positivos (se indican los genes correspondientes a cada banda). Calles 1 y 20: Marcador de pesos moleculares de 100 pb. En la figura 1 se muestran las bandas obtenidas con los productos de amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa para cada tipo patogénico. Discusión Aunque la determinación de la etiología de las diarreas agudas no siempre es indispensable para la instauración de un tratamiento específico, es de fundamental importancia para conocer la epidemiología de los diferentes agentes, para obtener información de utilidad tendiente a establecer conductas desde el punto de vista de la Salud Pública y para encarar el desarrollo de futuras vacunas. Debido a la similitud fenotípica entre los aislamientos de Escherichia coli, la metodología de PCR múltiple ha sido utilizada para identificar y diferenciar cepas patogénicas en numerosos estudios. (13) Con la idea de reunir en una sola reacción el número mínimo de cebadores que permitan caracterizar los cinco tipos patogénicos de E. coli, se diseñaron PCR múltiples con diferentes combinaciones de cebadores, lo cual permite en pocas horas identificarlos. (14) Existen pocos datos acerca de los distintos tipos patogénicos de E. coli en nuestro país debido a que no todos los centros asistenciales poseen capacidad operativa para aplicar la técnica de PCR entre los aislamientos de estos patógenos. En un trabajo realizado en la ciudad de San Luis, los autores encontraron que la prevalencia de ECTS y EIEC fue de 0,6% y de 1,5% para EPEC en coprocultivos donde no se aisló Salmonella o Shigella, cifras muy inferiores a las encontradas en el presente trabajo en la ciudad de Corrientes. (15) El hallazgo del 31% de muestras con algún factor de patogenicidad entre la población estudiada es semejante a los datos encontrados en Finlandia (35%) cuando se estudiaron diarreas del viajero, pero muy superior a lo reportado en ese mismo país cuando se estudiaron residentes que presentaron diarrea aguda (5,5%), lo cual parece lógico si se considera que en los países nórdicos, la mayoría de los casos de diarreas se consideran importados. (4,16) ECST presenta una alta prevalencia en nuestro país y algunos serotipos, especialmente el 0159, se relacionan con el desarrollo de Síndrome Urémico Hemolítico en niños. (17) En el presente trabajo se detectó el gen que codifica para la toxina Shiga en 6 niños y 3 adultos, de los cuales ninguno presentó diarrea sanguinolenta. ECEA es reconocido como un patógeno entérico emergente y estudios previamente publicados destacan su importancia en la diarrea del viajero y lo presentan como la causa del 15% de las diarreas en niños en países en desarrollo y del 4% en los niños de países industrializados; (18) en la serie incluida en este estudio fue el tipo patogénico más frecuente, especialmente entre las muestras pediátricas. Según estudios previos, la frecuencia de aislamiento de ECET en niños con diarrea varía del 10 al 30%, mientras que en adultos su presencia puede ser asintomática y poco frecuente o producir diarrea del viajero; (19) en el presente trabajo este tipo patogénico prevaleció en ambos grupos por lo que debería replantearse su rol como agente etiológico de diarrea en adultos residentes, una vez descartada la presencia de cualquier otro tipo de patógeno entérico u otra causa no infecciosa. La prevalencia de los diferentes tipos de E. coli diarreogénicas presentan variaciones sustanciales entre las diferentes regiones; tal es así que las frecuencias de ECEI, ECTS y ECET en pacientes menores de 14 años encontradas en el presente trabajo son superiores a las reportadas en Vietnam y Dinamarca para el mismo grupo etario. (9,20) Los hallazgos de esta investigación refuerzan la idea de quienes sostienen que, aunque sin gran impacto en el tratamiento sintomático, conocer la verdadera etiología de las diarreas agudas ayuda a delinear estrategias de prevención y control para evitar la aparición de nuevos casos, (21) permite obtener datos para el desarrollo de futuras vacunas, (22) a la vez que refuerza la necesidad de mejorar la vigilancia de las infecciones producidas por estas bacterias. (17) Conclusiones La alta prevalencia de tipos patogénicos de E. coli encontrada en pacientes con diarrea justifica la utilización de métodos de biología molecular para arribar a un correcto diagnóstico etiológico que permita 20
comprender mejor la epidemiología de estos patógenos y contribuir a la implementación de medidas sanitarias de prevención y control. Agradecimientos Los autores desean expresar su agradecimiento a la Fundación Alberto J. Roemmers por el subsidio otorgado para la realización del presente trabajo, al Servicio de Fisiopatogenia del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán por la provisión de las cepas utilizadas como controles y a Gerardo Deluca por su inestimable apoyo técnico. Referencias 1. Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 1998;11:142-201. 2. Campos LC, Franzolin MR, Trabulsi LR. Diarrheagenic Escherichia coli categories among the traditional enteropathogenic E. coli O serogroups - A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004;99:545-552. 3. Kaper JB. Pathogenic Escherichia coli. Int J Med Microbiol 2005;295:355-356. 4. Keskimäki M, Eklund M, Pesonen H, Heiskanen T, Siitonen A y cols. EPEC, EAEC and STEC in stool specimens: Prevalence and molecular epidemiology of isolates. Diag Microbiol Infect Dis 2001;40:151-156. 5. Bernztein R. Herramientas necesarias para enfrentar la diarrea aguda en la APS. Atención Primaria de la Salud 2003;6:4-8. 6. Ministerio de Salud. Presidencia de la Nación. Diarrea sin especificar edad. Boletín Epidemiológico Periódico 2006;32:13. 7. Gobierno de la Provincia de Corrientes. Caracterización socioeconómica. Disponible en htpp://www.corrientes.gov.ar/portal/ files/1_2_1_publicacion.pdf. 8. Knutton S, Shaw R, Phillips AD, Smith HR, Willshaw GA, Watson P, Price E. Phenotypic and genetic analysis of diarrheaassociated Escherichia coli isolated from children in the United Kingdom. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001;33(1):32-40. 9. Nguyen TV, Le Van P, Le Huy C, Nguyen Gia K, Weintraub A. Detection and characterization of diarrheagenic Escherichia coli from young children in Hanoi, Vietnam. J Clin Microbiol 2005;43:755-760. 10. Cohen MB, Nataro JP, Bernstein DI, Hawkins J, Roberts N, Staat MA. Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in acute childhood enteritis: a prospective controlled study. J Pediatr 2005;146(1):54-61. 11. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Diagnostico Microbiologico. 5ª. Edición. 2003. Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires. 12. Toma C, Lu Y, Higa N, Nakasone N, Chinen I, Baschkier A, Rivas M, Iwanaga M. Multiplex PCR assay for identification of human diarrheagenic Escherichia coli. J Clin Microbiol 2003;41:2669-2671. 13. Kimata K, Shima T, Shimizu M, Tanaka D, Isobe J, Gyobu Y y cols. Rapid categorization of pathogenic Escherichia coli by multiplex PCR. Microbiol Immunol 2005;49:485-492. 14. Feng P, Monday SR. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol Cell Probes 2000;14:333-337. 15. Correa S, Brovarone R, Hasuoka R, Rigo H, Foucarde G, Torres J, Miranda M. Prevalencia y caracterización genotípica de factores de virulencia de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) 0157H7 productor de toxina shiga (stx) en pacientes pediátricos con diarrea. Rev Argentina de Microbiol 2007;39(Sup.1):53. 16. Keskimäki M, Mattila L, Peltola H, Siitonen A. Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in Finns with or without diarrhea during a Round-the-World Trip. J Clin Microbiol 2000;38(12):4425-4429. 17. Gómez D, Zotta C, Lavayen S, Chinen I, Carbonari C, Miliwebsky E, Epidemiologia molecular de cepas de Escherichia coli O157:H7 aisladas en diferentes localidades de la provincia de Buenos Aires. Rev Argentina Microbiol 2007;39(Supl. 1):50. 18. Huang DB, Mohanty A, DuPont HL, Okhuysen PC, Chiang T. A review of an emerging enteric pathogen: enteroaggregative Escherichia coli. J Med Microbiol 2006;55:1303-1311. 19. Rodriguez-Angeles, G. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de Escherichia coli. Salud Pública de Méx 2002;44(5):464-475. 20. Olesen B, Neimann J, Bottiger B, Ethelberg S, Schiellerup P, Jensen C et al. Etiology of diarrhea in young children in Denmark: a case control study. J Clin Microbiol 2005;43(8): 3636-3641. 21. Carbonari CC, Chinen I, Miliwebsky E, Deza N, Baschkier A, Manfredi E. Escherichia coli 0145 productor de toxina shiga de origen humano y alimentos aislado en Argentina. Rev Argentina Microbiol 2007;39(Supl. 1):81. 22. Sheikh J, Czeczulin JR, Harrington S, Hicks S, Henderson IR, Le Bouguénec C, Gounon P, Phillips A, Nataro JP. A novel dispersin protein in enteroaggregative Escherichia coli. J Clin Invest. 2002;110(9):1329-37. Correspondencia: Dr. Luis A. Merino Lavalle 2842. 3400, Corrientes, Argentina. e-mail: lamerino@gigared.com 21