Anticuerpos y Trasplante. crossmatch. Bioq. Luciana Mas Lab. Histocompatibilidad Hospital Privado. Centro Médico de Córdoba

Anticuerpos y Trasplante crossmatch Bioq. Luciana Mas Lab. Histocompatibilidad Hospital Privado. Centro Médico de Córdoba

Sensibilización Persona que experimenta eventos sensibilizantes, como transfusiones, embarazos o un trasplante anterior riesgo para el desarrollo anticuerpos anti- HLA. 10-30% de los pacientes en lista de espera están sensibilizados BARRERA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS

Sensibilización y trasplante Receptor sensibilizado Receptor no sensibilizado DESENSIBILIZACIÓN TRASPLANTE Plasmaféresis IVIG Rituximab Bortezomib (combinaciones) Elevado Riesgo de Rechazo Baja sobrevida del injerto Anticuerpos anti-hla DS Anticuerpos anti-hla no DS Anticuerpos DS no anti-hla

Crossmatch (XM) Busca anticuerpos anti-hla en el suero del receptor que reaccionen con los Antígenos HLA del donante. Suero del receptor + Células del donante XM + : Presencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante contraindica el trasplante. XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante permite el trasplante.

Crossmatch Objetivos: *Detectar Anticuerpos *Identificar Especificidad Métodos: *CDC (Citotoxicidad Dependiente Complemento) *ELISA *Citometría de Flujo *Luminex

Crossmatch Variantes: *Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre y post tx. CDC, ELISA, CF, LUMINEX *Contra donante vivo (DV) pre y post tx CDC-AHG en LT y LB, CF, LUMINEX *Contra donante cadavérico (DC) CDC-AHG en LT y LB, CF

Métodos

Citotoxicidad dependiente de C (CDC)

Reacción CDC

Score de las reacciones de CDC % cel muertas valor asignado interpretación 0 10 1 negativo 11 20 2 borderline negativo 21 50 4 positivo débil 51 80 6 positivo 80 100 8 positivo fuerte Unreadable 0 sin cel.,contaminación

CDC + Antiglobulina Humana > sensibilidad

Crossmatch: ELISA Ag solubles purificados unidos a los pozos de placas de Terasaki. Cubren todas las especificidades No se requieren cel. viables Detecta sólo IgG Detecta Ac contra Ag de clase I y II Detecta Ac HLA específicos y Ac HLA que no unen complemento (IgG2,IgG4) > sensibilidad, detecta Ac de bajo título Se puede realizar el XM después del trat. con anti-cd3, anti-timogl, anti-cd20 Más objetvo No detecta Ac no HLA específicos

Crossmatch por ELISA

Citometría de Flujo

Fundamento

SSC vs FSC Complejidad interna Granulocitos Monocitos Tamaño Restos celulares Linfocitos

Fluorocromos FITC: Isocianato de Fluoresceína PE: Ficoeritrina PerCP: peridinin chlorophyll protein APC: allophycocyanin

Principio del cross-match Antígeno Superficie celular

Procedimiento Suero del paciente y linfocitos totales del donante. Tratamiento de los linfocitos con Pronasa: eliminar receptores Fc de linf. B que unirían IgG inespecíficamente aumentando el background. Incubación suero- células/ CN-células/ CP- células 45 a temp amb. Marcación con anti IgG humana marcada con FITC 30 a temp amb en oscuridad Marcación con anti CD3 PE, anti CD19 PerCP y anti CD45 APC 20 temp amb oscuridad Adquisición.

XM (+) y XM (-) B+ B- T+ T-

Expresión de resultados y puntos de corte Dot plot : media del suero del paciente / media del control negativo LT y LB > ó = 2 Positivo 1.7-1.9 Cuestionable < 1.7 Negativo

Variantes

Crossmatch contra panel

Crossmatch vs Panel (PRA) % de reactividad del suero del paciente frente a un panel de células (antígenos) Medida del grado de sensibilización *Pacientes bajo riesgo : PRA < 20% *Pacientes elevado riesgo : PRA > 30% *Pacientes hipersensibizados : PRA > 70% Fuerza Especificidad

Crossmatch Contra Panel PRA por CDC. PRA por CF (screening clase I/II). PRA por Luminex (screening clase I/II).

Crossmatch Contra Panel (CDC) Células: cel 1 cel 2 cel 3 cel 4 cel n Suero Receptor: + - - + Reacción: 30/30 = 100% PRA 15/30 = 50% PRA 0/30 = 0% PRA

Crossmatch Contra Panel (CF) Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo. Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-hla Determinación de %PRA e identificación de especificidad de los anticuerpos.

Crossmatch Contra Panel (CF)

Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-hla Mayor sensibilidad FlowPRA ELISA CDC Menor sensibilidad

Crossmatch contra donante

Cross-match pre Tx por CF Técnica de mayor sensibilidad: detecta niveles mínimos de Ac no detectados por CDC. Es indicativo en pacientes con pretx por CDC negativo, con antecedentes de Tx previos, FP histórico positivo, transfusiones, embarazos. Diferencia IgG/IgM anti linfocitos B y linfocitos T del donante.

Crossmatch T y B contra donante Componentes Linfocitos T y B del posible donante Suero del paciente, diluciones, duplicados Tratamiento del suero con DTT AHG Complemento de conejo (activado e inactivado) Controles positivo y negativo Colorantes vitales: carboxifluoresceína diacetada / bromuro de etidio

Alo/Autoanticuerpos? Aloanticuerpos: IgG Autoanticuerpos: IgM DTT: Rompe enlaces disulfuro que unen al pentámero de IgM. Suero + DTT POSITIVO NEGATIVO IgG IgM

Autoanticuerpos Pac.con LES Pac.tratados con antiarrítmicos candidatos a tx cardíaco Pac.tratados con medicación antihipertensiva PRA mayor 80% no específico y reacción fuerte Crossmatch positivo entre hnos idénticos Crossmatch positivo,c/dtt negativo Mayor reactividad al frío Mayor reactividad a los LB

Obtención de células del donante Linfocitos totales: gradiente de ficoll-triyosom Linfocitos T y B: sangre : 10-15% LB, ganglio : 25% LB, bazo: 50% LB Linfocitos T: esféras inmunomagneticas revestidas de ac. monoclonales CD2 o CD8 Linfocitos B: esféras inmunomagnéticas revestidas de ac.monoclonales CD19 o CD20 Monocitos gradiente de percoll

Separación de poblaciones de linfocitos Dispense 2 ml of whole blood into a 5 cc tube. Add 100 µl of Beads. Cap tube and rotate for 3 minutes. Add 2 ml of developer. Cap tube and invert 2-3 times. Uncap tube and place in magnet for 3 minutes Remove supernatant Wash beads by removing tube from magnet and adding 1-2 ml of PBS Place tube on magnet for 1 minute. Remove supernatant. Repeat wash step twice Pure T lymphocytes

Crossmatch T y B contra donante Sin DTT Li T (-) Li B (-) Li T (+) Li B (+) Li T (+) Li B (+) Li T (-) Li B (+) Li T (-) Li B (+) Con DTT (-) (-) (+) (-) (+) Interpretación Ausencia de Anticuerpos Problable Autoanticuerpos (Ig M) Antic. anti clase I o anti clase II IgG (aloanticuerpos) Probable autoanticuerpos (IgM) Ac clase I (no se detecto en los LT) o ac. clase II (DR) (IgG)

Resultados vs. Riesgo Citotoxicidad Citometría Interpretación Riesgo Linf T Linf B Linf T Linf B ++++ Pos Pos Pos Pos No TX alto riesgo de rechazo hiperagudo? Pos Neg Pos Neg Anticuerpos no anti HLA?? Caracterizarlos ++ a +++ Neg Pos Pos Pos Clase I bajo tít. Clase II? Riesgo de rechazo hiperagudo con anti clase II de alto título,riesgo incr rech agudo/acelerado + a ++ Neg Neg Pos Pos Bajo Título clase I y clase II 0 a + Neg Pos Neg Pos Anti clase II y/o muy bajos títulos anti clase I, riesgo increm rechazo agudo 0 Neg Neg Neg Neg Bajo riesgo para el Tx

Seguimiento inmunológico del paciente sensibilizado Pre y Post Trasplante

Paciente sensibilizado Fuentes de sensibilización: - Embarazos - Trasplantes - Transfusiones Nivel de sensibilización: PRA Citotoxicidad Elisa/Luminex El protocolo de monitoreo debe ser coordinado entre el centro de trasplante y el laboratorio de histocompatibilidad

Qué estudiamos en el paciente sensibilizado? Cómo varía el título de anticuerpos Contra qué HLA están dirigidos

Tecnología Luminex

LABScan 100 System

PMT Photo Multiplier Tube/Rep Reporter Laser Classification Laser Avalanche Photo Diodes/CL

Common Laser Lines Excitation FITC uv argon dye diode 350 488 595 635 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 495 Emission 520 nm R-PE PI 480 536 578 nm 613 nm Allophycocyanin Texas Red 650 589 660 nm 615 nm PerCP TM 490 675 nm APC-Cy7 (PharRed) 650 767 nm adapted frpm Purdue University Cytometry Laboratories

Descripción >712nm 575nm 675nm Excitation (Reporter) Excitation (Classification) Emission (Reporter) 532nm Emission (Classification) 635nm

Waste 2-Way Bubble Trap Vent Valve 3-way Valve 2-Way Sheath Valve Cuvette Sample Loop 3-way Valve Sheath Bubble Trap Syringe Sample Probe Luminex Fluidics Sample

LABMAS

Detección de Anticuerpos Sets de microesferas pre-conjugadas con sondas únicas o antígenos

Principio Básico Aloanticuerpo PE anti-igg Antígeno Perla Luminex

Procedimiento: Método Tubo o Placa 20 µl suero 5µl Perlas Clase I y/o II Incubación 30 minutos a TA Lavados x3 Anticuerpo Secundario 30 minutos a TA Lavados x2 LS1+ LS2PRA = 40ul test serum LS1A01 + LS1A02 = 20ul test serum Análisis con LabScan 100

Detección por R-Phycoerythrin Conjugado Anticuerpo PE anti-igg A2 Anticuerpos B27 Perla #26 con los antigenos conjugados. A2 A2 26 A24 A24 B7 B7 B27 B27

Detección por R-Phycoerythrin Conjugado Anticuerpo Positivo Positivo A2 A24 A24 A2 26 Perla #26 Perla #26 B27 B27 B7 B7

LSM - Class I and II Screening

LS12PRA Class I and II PRA and ID.

The cell surface is a jungle!

XM Virtual Los resultados de un crossmatch hoy es posible predecirlo con la posibilidad del conocimiento de las especificidades de los Ac de los pacientes en lista de espera y en caso de un potencial donante tenga algún Ag inaceptable, el paciente con Ac para ese Ag es descartado

XM Virtual

cpra (calculated PRA) Estima el porcentaje de donantes que sería incompatible con el receptor, basado en los antígenos inaceptables que este tenga y en las frecuencias que estos Ag tengan en esa población Ejemplo: un paciente con un PRA de 50% para clase I y 60% para clase II Si consideramos los Ag inaceptables, el cpra va a ser mayor del 80%, ese paciente puede recibir ptos extras por considerarlo hiperinmunizado

cpra (calculated PRA) http://www.unos.org/resources/frm_cpra_calculator.asp?index=78

cpra (calculated PRA)

Acs vs sobrevida del injerto Ac donante específico ( DSA ) anti HLA anti cel endoteliales anti MICA y MICB anti contra antígenos específicos de tejido ABO isoaglutininas Ac No donante específico (NDSA ) anti-hla anti MICA

Anti-HLA Morales Buenrostro et al. Gac Med Mex 2008

Anticuerpos y clínica del tx Po-Chang Lee et al. Transplantation 2009

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Anti-MICA NEJM 357 (13) 2007

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