UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Efecto de hemocianinas de moluscos en la maduración de células dendríticas murinas Memoria para optar al Título de Bioquímico Miguel Ignacio del Campo Zaldívar Departamento de Investigación y Desarrollo, Biosonda S.A. Fundación Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Profesor Patrocinante: Javier Puente Ph.D. Director de Tesis: María Inés Becker Ph.D. Santiago de Chile, Noviembre 2007
RESUMEN Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c + ) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kda hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h.
Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental.
ABSTRACT Hemocyanins, the giant oxygen transporters glycoprotein of some mollusks and arthropods, are powerful immunogens in mammals. They are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccines, and as non specific inmunoestimulant in the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH from the Californian limpet Megathura crenulata has been used for over thirty years for the above purposes. Recently CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod Concholepas concholepas, has proved to be a reliable alternative to KLH. Interestingly, although KLH and CCH differ significantly in their origin and structure, we found that both hemocyanins immunomodulate in a similar way the innate and adaptive arms of immune response. We demonstrated that both hemocyanins increased the activity of NK cells, and induce a Th1 cytokine profile Due the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, our aim is to understand the relationship among the structural features of hemocyanins and their immunomodulatory properties. To this respect, little is known about how hemocyanins maturing DCs and how they specifically modulate their function. We postulated that CCH induce the DC maturation, activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake using diverse microscope methods and flow cytometry, in DCs cultured in vitro, isolated by magnetic sorting of bone marrow precursors from C57BL/6 mice strain. We used a fluorescent conjugate of this protein (CCH-Alexa488) or direct identification with specific antibodies. We found that CCH was quickly internalized by clathrinmediated endocytosis vesicles, and then it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, determined by analyses of MHCI, MHCII and CD86 surface molecules, as well by IL12 secretion and the lost of fagocitic capacity, showed no significant differences up to 72 h with respect to the control DCs, as compare with DCs treated with LPS, used as positive control, which increased these parameters at the 24h. These results were concomitant with the expression of the lysosomes membrane glycoprotein Lamp at the 72h, and the fact that at the same time, whole CCH subunits or their fragments, do not were detected by Western blot, suggesting the total processing of the hemocyanin. Different results were obtained when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an augment in expression of MHCII and CD86 surface molecules was observed, an also an increased in the IL12 and INFγ secretion. These positive results
were improved when both cellular types were in contact, confirming the modulation by CCH of the NK/DC interaction. Following, we studied the importance of the size and the sugar moieties in the immunostimulant effect of CCH, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not affected; on the contrary, the titles of antibodies were increasing against the deglicosilated proteins in comparison to the native ones. These differences not correlated with differences by in the secretion of IL12 in DCs cultured in vitro with the same proteins, indicating again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to known the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model, being established that the protein is slowly processed by the DCs, and that their effect in vitro and in vivo, is mediated by the NK/DC interaction.