Diseño de cebadores para RT qpcr ACTIVIDADES 1 Guías Generales para el Diseño de cebadores para cuantificación de ARNm por RT qpcr con SYBR Green 2 Mostración del diseño de un par de cebadores para cuantificar el factor de transcripción GRF2 de Arabidopsis thaliana 3 Tiempo libre optativo para practica con sus propios diseños Dr. Ramiro Rodriguez rrodriguez@ibr conicet.gov.ar Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario ESPECIFICIDAD EFICIENCIA ESPECIFICIDAD Evitar amplificaciones de ARNm de genes diferentes al de interés Discriminación entre homólogos Discriminar de posibles contaminaciones remanentes de ADN genómico EFICIENCIA Lograr la máxima eficiencia de amplificación Maximizar la detección de los productos de la retrotranscripción 1
Guías Generales para el diseño de cebadores Largo: 18 30 bases Contenido de GC: Ideal 40 60% (30 80%) Especial cuidado en el extremo 3 del cebador Tm: 58 C (57 61 C) Parejo entre los dos cebadores Parejo con cebadores a usar en paralelo Evitar mismatches con el molde, especialmente en el extremo 3 Evitar A o T en el extremo 3 Evitar reducida complejidad de secuencia Evitar estructuras secundarias Evitar hibridación entre cebadores hacia el extremos 3 (no mas de 2 ntds en los últimos 5) Guías Generales para el diseño de cebadores Sitios de hibridación hacia el extremo 3 de la CDS XAAAAAAAAAAAA...A VTTTTTTTTTTT Utilizar intrones para discriminar amplificación de ADN genómico contaminante 2
Guías Generales para el diseño de cebadores AMPLICÓN: Amplicon localizado hacia el extremo 3 del ADNc 100 250 pares de bases de largo Contenido de CG entre 40 50% Evitar estructuras secundarias Diseño de cebadores para RT qpcr PASOS: 1 Obtener las secuencias Secuencia codificante (CDS) y génomica. Definir las posiciones de los intrones Analizar presencia de splicing alternativo. Si lo hay, decidir que versión se desea medir. 2 Analizar presencia de homólogos en el genoma Literatura BLAST contra base de datos de CDS Alineamiento Múltiple de Secuencias 3 Diseño de cebadores asistido por software 4 Análisis informático y experimental de la calidad de los cebadores 3
Diseño de cebadores para RT qpcr HERRAMIENTAS PRIMER3PLUS Diseño automático de cebadores http://www.bioinformatics.nl/cgi bin/primer3plus/primer3plus.cgi CLUSTAL W Alinamientos múltiples de secuencias http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/ BLAST Búsqueda de homólogos http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ IDT SciTools Herramientas para Análisis y Diseño de Cebadores http://www.idtdna.com/scitools/scitools.aspx Sequence Massager Herramientas simples de edición de secuencias 1 Determinación de ESPECIFICIDAD 2 Análisis de EFICIENCIA de amplificación 4
1 Determinación de ESPECIFICIDAD Realizar reacción de amplificación tipo Analizar perfil de la curva de melting y geles de agarosa Optativo: clonado y secuenciación 100 90 80 70 60 BIEN - di / dt (%) 50 40 30 20 10 0-10 -20-30 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 Temperature [ C] Threshold: h 33% 100 90 80 70 60 MAL!! - di / dt (%) 50 40 30 20 10 0-10 -20-30 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 Temperature [ C] Threshold: 33% 2 Análisis de la EFICIENCIA de amplificación Máxima eficiencia redunda en alta exactitud y reproducibilidad. Es la base para usar el método de cuantificación relativa (2 ct ) 5
2 Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) A Pendiente de la curva de amplificación en la zona de amplificación exponencial 1000 Fluorescence (norm) 100 10 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle Threshold: 140 (Noiseband) Baseline settings: automatic, Drift correction ON Ventaja: Cálculo directo tubo por tubo (depende del software) 2 Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) B qpcr con diluciones seriadas al medio del ADNc (o el ARN) Gráfico ct vs. Log(concentración de molde) Eficiencia = 10 (1/pendiente)( ) Ventaja: Permite determinar el rango dinámico cuantitativo de la técnica Pfaffl, 2001 Debernardi, 2008 6
2 Análisis de la EFICIENCIA de amplificación (y de retrotranscripción) B qpcr con diluciones seriadas al medio del ADNc (o el ARN) Gráfico ct vs. Log(concentración de molde) Eficiencia = 10 (1/pendiente)( ) Ventaja: Permite determinar el rango dinámico cuantitativo de la técnica Pfaffl, 2001 Debernardi, 2008 7