TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA. DIA 1. 5 de Octubre. Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez) RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

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1 TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA DIA 1. 5 de Octubre Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez) RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

2 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

3 Definición de la Técnica PCR en tiempo real o qpcr o RT-qPCR Termociclador Cebadores A G CU T Taq polimerasa Ácido nucléico Nucleótidos Tampón de reacción UNG ROX (opcional) R Sonda Q Agentes intercalantes con sistema de detección

4 ROX como referente pasivo ROX=6-carboxy-X-rhodamine + ROX - ROX Δ Rn Desv St= ± Desv St= ± Ciclos Ciclos Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.

5 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

6 Terminología asociada a qpcr Escala semi-logarítmica Plató Ex pon en cia l Rn Log Fluorescence al e n Li Baseline Ct value= 15.5 Cycle Number Threshold

7 RT-qPCR vs PCR Convencional RT-qPCR PCR Convencional Semi-cuantitativa: Rango dinámico pequeño 2 logs Baja Precisión; baja resolución y poco Sensible. Manipulación post-pcr. Baja Resolución No-automatización Discriminación basada sólo en tamaño Los resultados no están expresados en números. El BrET no es muy cuantitativo Cualitativa y cuantitativa. A tiempo real (fase exponencial) A tiempo final Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa Plus/Minus Elevado rango dinámico de detección (fase plató) Discriminación Alélica Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-pcr

8 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

9 Diseñando un experimento de qpcr Aplicación Método de Normalización Química de detección: Sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes Intercalantes Fluorocromos unidos a primers Reactivos: Core kit vs Master Mix dntps/dutps y UNG enzyme ROX como referente pasivo Termociclador: Formato Número de canales de detección Software de análisis Duración del programa Precio y flexibilidad de la oferta

10 Aplicaciones RTqPCR 3 oligo 5 oligo Proteína Tejido Target mrna mirna ncrna sirna sarna CNA Validación Microarrays Célula Eucariota RNA Análisis en Células Stem Análisis en célula Única DNA Bacteria Micoplasma Patógenos en la comida Virus SNP CNV Mutaciones Análisis Metilación

11 Estrategias de Normalización qpcr Normalización respecto a la masa total de RNA exraído (chequeo calidad RIN, moleculas/ng RNA) Normalización respecto al volumen/masa de la muestra ( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre) Normalización respecto al número de células ( moléculas/célula) Normalización respecto a un gen endógeno no regulable (GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rrna, ) Normalización respecto a más de un gen endógeno ( 3) genorm (Vandesompele et al Genome Biology) BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004) Normfinder Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology) Genes and Immunity (2005) 6, Review BMC Bioinformatics 2009, 10:110

12 Plataforma de RTqPCR en la UCTS 7000 SDS Formato ROX Química FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX mode 9600 Emulation /Standard Softwares LightCycler 480 Tiras de 8 Tubos Placas-96 Ref. Pasivo 7900HT Fast SDS V1.2.3f2 con RQ study Primer Express 2.0 Microfluidicas (Arrays de baja densidad) Placas-384 ROX Formato 384-p: FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET. Formato LDA: FAM, VIC, ROX Emulation/Standard Fast SDS RQ Manager 1.2 White Plates-384 Ninguno Filtros/canales detección: 500, 533, 568, 610, 640, 670 nm Fast SW 1.5

13 La UCTS dispone de los siguientes reactivos: Química: UNG: Mode: SYBRGreen SondasTaqMann Sí 9600 Emulation/Standard SondasTaqMann Sí Fast

14 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

15 Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qpcr Muestra Preparación Muestra DNA RNA Extracción Ác. Nucléicos cdna Transcripción Reversa (RT) Producto Amplificado PCR a tiempo Real (qpcr )

16 Preparación Material de partida Muestra Preparación Muestra DNA RNA Extracción Ácidos Nucléicos Tipo de muestra Método Extracción NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 cdna Producto Amplificado Transcripción Reversa (RT) PCR a tiempo Real (qpcr )

17 Preparación Material de partida DNA Muestra RNA Preparación Muestra cdna Extracción Ácidos Nucléicos RNA total/mrna/dna Calidad & Cantidad Almacenamiento (-80ºC) NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Producto Amplificado Transcripción Reversa (RT) PCR a tiempo Real (qpcr )

18 Evaluación del RNA RNA Q &Q Pureza (ausencia Integridad de contaminación por DNA y Proteínas y ausencia de inhibidores) ODA260/A280= OD A260/A230=2 SPUD assay (Nolan, 2006) rrna ( 28S:18S=2:1) Número RIN ( 5) Ensayo 3 :5 (alrededor de 1 indica elevada integridad; 5 degradado) Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) PERFECTO BUENO MALO :1 Gel Desnt. Agarosa Cantidad Agilent Bioanalyzer Existen dif. métodos de cuantificación. Generan difs. resultados. Hay que cuantificar muestras comparables entre sí con el mismo método de cuantificación. Expert Rev. Mol. Diagn. 5, (2005)

19 Reacción de Transcripción Reversa (RT) Muestra Preparación Muestra RNA cdna Extracción Ácidos Nucléicos NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Transcripción Reversa (RT) Producto Amplifcado PCR a tiempo Real (qpcr ) One-Step vs Two Step CDNA Priming Pérfil Térmico Consideraciones Experimentales

20 One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR One-Step RT-PCR RNA RT cdna qpcr Producto Amplif. Two-Step RT-PCR RNA cdna RT Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo tubo. AmpErase UNG no se puede usar. Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente. Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación. No es posible la optimización por separado de ambas reacciones. Requiere primer RT específico de secuencia. Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa. Acumulación de dímeros de primers. cdna qpcr Producto Amplif. NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y reacción PCR). Más flexible (El cdna se puede guardar y ser usado más tarde). Permite la optimización por separado de ambas reacciones. Permite el uso de primer RT específico de secuencia, random primers o oligo(dt).

21 Transcripción Reversa: cdna Priming

22 Consideraciones Experimentales de la RT En general, usar el RNA total como molde para la RT. Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis de cdna y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar resultados entre sí. Hacer réplicas Incluir siempre control no-rt Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción. Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al mismo tiempo para evitar la variación entre tandas. Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra control positiva de referencia en todas las tandas. NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

23 qpcr Muestra Preparación Muestra RNA cdna Extracción Ácidos Nucléicos Transcripción Reversa (RT) Producto Amplifcado PCR a tiempo Real (qpcr ) Elección en el software del ensayo a realizar Perfil Térmico Consideraciones Experimentales NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

24 Elección en el software del ensayo a realizar 7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

25 Con Curva Stándard 7000 SDS de ABI Absolute Quantification (Standard Curve) 7900 SDS de ABI Standard Curve (AQ)

26 Elección en el software del ensayo a realizar 7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

27 ddct 7000 SDS Relative Quantification (ddct) Plate Relative Quantification (ddct) Study 7900 SDS Ct (RQ)

28 LightCycler 480 II

29 Perfil térmico clásico qpcr Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG 1.- Activación UNG 2.- Activación Taq y desnaturalización UNG 3.- Desnaturalización del dsdna 4.- Anillamiento y extensión primers

30 Consideraciones qpcr Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo. Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts 35). Si las réplicas difieren 0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos. Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cdna para evitar contaminación cruzada. Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cdna. Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qpcr después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas. Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa. NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad

31 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

32 Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qpcr Producto Amplificado DNA Muestra Preparación Muestra RNA Extracción Ác. Nucléicos cdna Transcripción Reversa (RT) PCR a tiempo Real (qpcr ) Análisis de datos Calidad del Ensayo Métodos de Cuantificación Estadística

33 Calidad del Ensayo Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas) Controles qpcr NEGATIVOS NTC (Non Template Control) NAC (Non Amplif. Control) No RT (No RT control) Detección de dímeros de primers y contaminación Detección de degradación de sondas Detección de contaminación por DNA genómico POSITIVOS Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar. Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos Spiking Control Detecta presencia de inhibidores Curva de Disociación (SYBR Green) Curva Estándar Linealidad de los datos Distancia entre las curvas de amplificación Eficiencia de amplificación

34 Calidad del Ensayo Curva Estándard: R o r 0.99 Slope= Pendiente Eficiencia Amplificación Convertir E en Porcentaje -3,0 (E= 10-1/slope) 2,2 %E= (E-1)100% 115-3,1 2, ,2 2, ,3 2, ,32 2, ,4 2,0 97-3,6 1,9 90-3,7 1, ,8 78 2n=Factor de dilución Factor Dilución n=lg(factor Dil.)/LG(2) 2 1,00 5 2, ,32 OK

35 Métodos de Cuantificación Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa Cantidad de ácido nucléico (número de copias, µg) por cantidad de muestra dada (por célula, por µg de RNA total) Cantidad relativa de ácido nucléico de una muestra A respecto a una muestra B Ejemplo: Niveles de expresión génica en Tumor vs Tejido normal. Ejemplo: medida carga viral A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard: Qty gen problema Muestra Problema = Qty gen EC Calibradora = Qty gen problema Qty gen EC B.- Método Pfaffl: RQ = Ct (Egen diana) dct, gen diana (calibradora muestra (Egen EC) problema) dct, gen EC (calibradora muestra problema) C.- Método (Livak) Doble Delta CT: dct = CT(gen diana) CT(gen EC) Log (Num de copias) ddct = dct(muestra problema) dct (calibradora) RQ= 2 ddct

36 Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC ΔCt= (Ct gen Target Ct gen Endógeno) Slope R2 Y = x R2 = Log Diluciones

37 RTqPCR en tela de juicio Routine lab method s accuracy called into question NATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010 Catherine Shaffer Ejemplos: 1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel disease V Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84 90 Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo. RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic children. S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) ) The mrna of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces flowering. Huang et al. Science 309 September 2005: Breakthrough of the Year 2005, the runners-up. Science 310: Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.

38 Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR

39 MIQE Guidelines

40 Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qpcr Diseñando un experimento de qpcr Etapas en la realización de un experimento de qpcr Evaluación de un ensayo de qpcr Bibliografía muy recomendada

41 Direcciones de interés relacionadas con qpcr qpcr-technical-guide.pdf (Sigma Life Science)

42 Seminario RTqPCR 18 de Octubre en VHIR Prof. Michael Kubista Está entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR

43 Gracias