ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN 2017
PROCARIOTAS Bacterias Hongos y levaduras EUCARIOTAS Cianobacterias Protistas
BACTERIAS con ESPORAS Espora (en verde) Formas vegetativas (en rojo)
HONGO con ESPORAS Esporas Forma vegetativa
ESTERILIZACIÓN ES EL USO DE AGENTES FÍSICOS O QUÍMICOS CON EL FIN DE DESTRUIR O ELIMINAR LA TOTALIDAD DE LOS MICROORGANISMOS VIABLES PRESENTES EN UN MATERIAL. Destruye FORMAS VEGETATIVAS y ESPORAS.
Por qué es importante el proceso de esterilización? En el laboratorio de Microbiología Pipetas, tubos, pacas de Petri, pinzas etc. que van a ser utilizados en con fines de investigación o diagnóstico. Preparación de medios de cultivo para cultivo y aislamiento de microorganismos a partir de diferentes tipos de muestras o para control de medio ambiente, equipos, personal, medicamentos o cosméticos. Descontaminación del material utilizado Equipos y materiales quirúrgicos de uso medico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.
DESINFECCIÓN ES EL USO DE AGENTES QUÍMICOS PARA ELIMINAR LA INFECTIVIDAD POTENCIAL DE UN MATERIAL (NO IMPLICA LA ELIMINACIÓN DE TODAS LAS FORMAS MICROBIANAS). DESTRUYE LAS FORMAS VEGETATIVAS Y NO ELIMINA LAS ESPORAS.
Términos relacionados con el control microbiano: -Estéril: ausencia absoluta de toda formas de vida microbiana. -Asepsia: conjunto de medidas destinadas a impedir toda contaminación microbiana. -Agente bactericida: agente que mata las bacterias. -Agente bacteriostático: agente que inhibe el crecimiento microbiano. -Agente fungicida: agente que mata los hongos. -Agente fungistático: agente que inhibe el crecimiento fúngico. -Agente virucida: agente que detiene la replicación y la actividad vírica. - Agente virustático: agente que inhibe la replicación vírica.
ESTERILIZACIÓN: Probabilidad de sobrevida de microorganismos: 10-6 SAL: sterility assurence level: nivel de seguridad en esterilización SAL 10-6 Probabilidad de una unidad no-estéril es igual a 1 en 106 unidades procesadas
CINÉTICA DE MUERTE Nt = No e- Kt Ln Nt/No= - K t No/Nt= e- Kt
EFECTO DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS O LA CARGA INICIAL CARGA DE POBLACIÓN ALTA CARGA DE POBLACIÓN BAJA Esto se cumple para el tratamiento con calor como para el tratamiento químico.
CURVAS DE SOBREVIVENCIA Nt/No = e- Kt ln No sobrevivientes = - K t B A D C A: curva logarítmica normal B: esporas C: microorganismos altamente sensibles bifásica, por calor y radiación D: en tratamientos químicos
FACTORES QUE AUMENTAN LA EFICIENCIA DE LOS PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN Presencia de humedad y oxígeno Presencia de sustancias químicas bactericidas FACTORES QUE DISMINUYEN LA EFICIENCIA DE LOS PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN Presencia de microorganismos esporulados Presencia de aceites, ácidos grasos, grasas, y proteínas Altas concentraciones de azúcares
CONDICIONES PREVIAS QUE DEBE CUMPLIR EL MATERIAL PARA UNA EFICAZ ESTERILIZACIÓN LAVADO ENJUAGADO SECADO ENVOLTURA
LAVADO Se realiza con agua y detergente - Reduce la tensión superficial del agua colaborando en la solubilización de las proteínas, la emulsión de grasas y la suspensión de partículas. - El empleo de detergentes enzimáticos es de mayor eficiencia.
Para qué realizamos el lavado? - Para asegurar la eliminación de partículas extrañas - Eliminar la materia orgánica que protege a los microorganismos
ENJUAGADO-SECADO-ENVOLTURA # Cómo se realiza el enjuague? Se debe enjuagar muy bien y con suficiente cantidad de agua corriente potable y agua destilada. # Para qué secamos? Para evitar la contaminación posterior y deterioro del material. # Para qué envolvemos? Para evitar la recontaminación microbiana en el momento de la salida de la cámara de esterilización, durante el transporte y almacenamiento.
ENVOLTORIO Permeable al agente esterilizante Resistente a la penetración de microorganismos Libre de pérdida de fibras y partículas. No tóxico Resistente a la humedad y roturas
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN MÉTODOS FÍSICOS Calor seco Llama directa Aire caliente (estufa) Incineración Calor húmedo A presión (autoclave) A vapor fluente (tyndalización) Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore) Radiaciones Ultravioletas Ionizantes MÉTODOS QUÍMICOS Óxido de etileno Formaldehído Glutaraldehído Gas plasma
ESTERILIZACIÓN POR CALOR MECANISMO DE ACCIÓN Desnaturalización de proteínas Disolución de lípidos Daño de ácidos nucleicos NO APTO PARA SUSTANCIAS o MATERIALES TERMOSENSIBLES RÁPIDO Y PENETRANTE
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO: acción oxidante en presencia del aire Llama directa Material a esterilizar: -Ansas -Tijeras -Portaobjetos -Pinzas -Material muy resistente al calor - Incineración: desechos infecciosos (870-980 C), en desuso por alterar el medio ambiente)
CALOR SECO ESTUFAS DE ESTERILIZACIÓN (u HORNOS) 160º C------------- 1.5 h 180º C------------- 1 h
CALOR SECO en ESTUFA Qué material podría esterilizarse por calor seco? -Materiales resistentes al calor -Soluciones oleosas, aceites, vaselina recipientes cerrados. -Polvos (talco) -Material de vidrio resistente y metal líquida, en No se pueden esterilizar: Medios de cultivo sólidos o líquidos (se deshidratan) Material de goma (guantes, sondas) Textiles.
AUTOCLAVE Funcionamiento T : 121º C Tiempo: 15 a 20 min P interna: a 1 atm de vapor de agua P total: 2 atm Fundamento del proceso: a > Pvapor > T eb. del agua Mecanismo de acción: desnaturalización de proteínas, disolución de lípidos Autoclave tipo Chamberland
Modelos de autoclaves Olla a presión
CICLO TÍPICO DE UN AUTOCLAVE Objeto Autoclave La temperatura de un objeto voluminoso se eleva más lentamente que la temperatura del autoclave
Qué material podría esterilizarse en autoclave? Material de vidrio o metálico - Agua destilada, solución fisiológica (NaCl 0,9 %) - Medios de cultivo que no lleven incorporados hidratos de carbono en alto % - Material de plástico autoclavable (tips, tubos Eppendorf, equipos de filtración) -
TYNDALIZACIÓN * A vapor fluente (olla a presión o autoclave c/ espita abierta) * A Baño María a ebullición ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO EN 3 ETAPAS 1er. día 2do. día 3er. día 20 min a 100º C 20 min a 100º C 20 min a 100º C 24 h a 37 C 24 h a 37 C 24 h a 37 C
TYNDALIZACIÓN Durante los períodos de incubación las esporas germinarán pasando a formas vegetativas Para que las esporas germinen necesitan: Un shock térmico Un medio de cultivo rico en nutrientes Una temperatura y tiempo adecuado de incubación
TYNDALIZACIÓN Se pueden tyndalizar: -Medios que no resisten > 100 C -Medios ricos en nutrientes (como hidratos de carbono, proteínas) que permitan la germinación de esporas No se pueden tyndalizar: Agua destilada Solución fisiológica Soluciones de buffers o electrolitos Medios pobres en nutrientes Objetos
VENTAJAS DEL CALOR HÚMEDO SOBRE EL CALOR SECO Menor tiempo de esterilización Menor temperatura El calor húmedo es más penetrante Se pueden esterilizar medios de cultivo Se pueden esterilizar líquidos como agua destilada (AD) y solución fisiológica (SF)
PASTEURIZACIÓN no es un método de esterilización!! Destruye sólo el 97-99% de los microorganismos presentes - MICROORGANISMOS PATÓGENOS ( Listeria monocytogenes, Campylobacter, Salmonella y Escherichia coli O157:H7 ) - REDUCE LA MICROFLORA ALTERANTE - PROLONGA LA VIDA ÚTIL DEL PRODUCTO Aplicaciones: - leche - jugos de frutas - bebidas (vinos, cervezas)
PASTEURIZACIÓN LTH (Low Temperature Holding) 30 min a 63-66º C HTST (High Temperature Short Time) 15 seg a 72-73º C Altera el sabor en menor medida Mata los microorganismos resistentes al calor con mayor eficacia - Este método se utiliza en la industria de productos lácteos -
UHT (Ultra High Temperature) 140º C 150º C durante pocos segundos Proceso continuo Necesita envasado aséptico Logra esterilidad comercial
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN LOS MICROORGANISMOS SON REMOVIDOS ESTERILIZACIÓN DE LÍQUIDOS Y GASES Ej. de LÍQUIDOS TERMOSENSIBLES: soluciones oftálmicas e intravenosas, q radiosótopos, vacunas, q hidratos de C en solución, medios líquidos para cultivos celulares, soluciones de antibióticos y vitaminas q
Equipo de filtración Mecanismo: efecto tamiz
FILTROS DE PROFUNDIDAD Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore) -la retención de partículas se produce por una combinación de absorción y efecto tamiz. -Consisten de fibras vidrio o borosilicato. de -El material de filtración está dispuesto al azar en una lámina gruesa, los filtros de profundidad no se obstruyen fácilmente, se usan como prefiltros para eliminar partículas grandes de suspensiones líquidas. -Ej: Filtros HEPA y ULPA
Filtros HEPA
FILTROS DE NUCLEACIÓN (Nucleopore) Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore) - Películas muy delgadas de policarbonato perforadas por radiación y sustancias químicas. -Filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente, funcionan como tamices. -Menor cantidad de poros, la velocidad de flujo es más baja y se produce saturación. -Se usan en microscopía electrónica de barrido para concentración y visualización.
Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore)
EQUIPO DE FILTRACIÓN: filtros de membrana de acetato o nitrato de celulosa LA FILTRACIÓN SE UTILIZA PARA ESTERILIZAR LÍQUIDOS TERMOLÁBILES
FILTRACIÓN MECANISMOS DE ACCIÓN FILTROS DE PROFUNDIDAD: Adsorción y efecto tamiz Filtros de membrana: Efecto tamiz - Usos actuales de filtros de profundidad: prefiltros. - Usos de las membranas filtrantes: laboratorio de microbiología, investigación e industria
VENTAJAS DE FILTROS DE MEMBRANA * Filtran más rápido líquidos y gases Filtran únicamente por efecto tamiz No alteran las características organolépticas de las suspensiones Filtran mediante la aplicación de una bomba de vacío Son esterilizados en autoclave Se desechan una vez utilizados Además de esterilizantes tienen otras utilidades en microbiología (recuentos, concentración y separación de microorganismos).
FILTRACIÓN DE AIRE FILTRO HEPA (High Efficiency Particulate Aire) Laminas de borosilicato que atrapan partículas y agentes infecciosos de más de 0,3 micras con una efectividad del 99,97%. Efecto Tamiz. FILTROS ULPA: retienen partículas de entre 0,1 y 0,2 micras. Eficiencia de 99.99%
CABINAS DE BIOSEGURIDAD (CSB) FILTROS HEPA LUZ UV Gabinete de clase II Cabina de flujo laminar
CBS de clase II
Radiaciones: ESPECTRO DE ENERGÍA RADIANTE UV entre 220 y 300nm. Fuente: Introducción a la Microbiología. Tortora y Col. 2007.
RADIACIONES IONIZANTES RADIACIONES NO IONIZANTES Ej. UV CARACTERÍSTICAS CARACTERÍSTICAS -Alta energía, baja longitud de onda -Baja energía, sin poder -Gran poder de penetración ionizante -Ionizan átomos y moléculas -Sin poder penetrante -No requieren altas temperaturas -Máxima eficiencia biocida a 260 nm FUENTES MÁS HABITUALES -Rayos gamma -Rayos catódicos (electrones acelerados) - Rayos X
RADIACIONES MECANISMOS DE ACCIÓN Radiaciones ionizantes Ionización de los contenidos celulares, formación de radicales libres, y moléculas excitadas y esto lleva a la desorganización de enzimas y del DNA. Radiaciones ultravioletas Produce lesiones del DNA letales o modificaciones químicas como uniones cruzadas entre bases que interfieren en la replicación (dímeros de pirimidinas T-T)
RADIACIONES IONIZANTES
RADIACIONES UV
RADIACIONES UV Afectan a las moléculas de DNA formando dímeros de Timina. Son escasamente penetrantes y se utilizan para esterilizar superficies y el aire en salas y cabinas y el agua que no la absorbe.
CREACCIÓN Y REPARACIÓN DE UN DÍMERO DE TIMINA PRODUCIDO POR LA LUZ UV LUZ UV
APLICACIONES DE LAS RADIACIONES RADIACIONES IONIZANTES - Son acumulativas - Material medico quirúrgico: guantes de goma, implantes (válvulas cardiacas), injertos óseos y de tejidos, catéteres, suturas, jeringas, agujas y bisturies. antibióticos, vacunas, hormonas Las radiaciones gamma se usan en la Industria alimentaría RADIACIONES UV - Desinfección de superficies en cabinas de seguridad biológica, Disminución de la contaminación de superficies. Desinfección de aire (quirófanos, sala de quemados, de inmunodeprimidos, de animales de experimentación) Desinfección de agua No penetra superficies sólidas, opacas, vidrios, plásticos, líquidos turbios y materiales empaquetados
CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN Y ESTERILIDAD CONTROL DE ESTERILIZACIÓN: para comprobar si se cumplieron las condiciones del procedimiento. CONTROL DE ESTERILIDAD: para comprobar la ausencia total de microorganismos en muestras del material esterilizado.
CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN para control del procedimiento!
CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN BIOLÓGICO FÍSICO QUÍMICO A) Control biológico: esporas bacterianas en algún soporte se someten al proceso de esterilización por calor húmedo junto con el material y luego se llevan a incubar en medio de cultivo muy nutritivo por 24 h a 37 C para estimular su germinación y desarrollo. Resultados: -Si las esporas germinan y se observa desarrollo: la esterilización NO fue efectiva. -Si las esporas NO germinan y NO se observa desarrollo: la esterilización fue efectiva. Microorganismos esporulados que se utilizan: - Bacillus stearothermophilus: para esterilizadores de vapor - Bacillus subtilis var. niger: en esterilización por óxido de etileno - Bacillus subtilis var. niger o Clostridium tetani: esterilización por calor seco - Bacillus pumilus o Streptococcus faecium: en esterilización por radiaciones ionizantes
B) Control físico: método directo y sin demora que registra la temperatura y el tiempo en que se mantuvo la misma. Termógrafos C) Control químico: Sustancias químicas en tubo que funden a temperatura de esterilización. Están mezcladas con un colorante y al fundir indican si se alcanzó la temperatura óptima de esterilización. Desventajas: no dan información sobre la relación temperatura/tiempo como tampoco miden la penetración del vapor. Para tratamientos a 121º C anhídrido succínico (PF: 120º C) o ácido benzoico (PF: 121º C) y para tratamientos a 115º C es apropiado el azufre (PF: 115º C). Método más confiable: el control biológico
Integradores de esterilización mediante un cambio cromático progresivo integran todas las variables críticas del proceso. - para calor seco (cambian de color del amarillo al marrón: ciclo correcto) - para vapor (cambian de color amarillo al azul: ciclo correcto). cintas adhesivas sensibles al calor o radiación que modifican su color cuando se alcanza la temperatura o dosis deseada. Para esterilización con calor seco
CONTOLES DE ESTERILIDAD - Recipientes con medios de cultivo : se toman los de la zona central y se incuban a 37 C, 24 h. - Sustancias termolábiles: se toma una alícuota y se siembra en un medio de cultivo adecuado; se incuba a 37 C, 24 h.