Transfección de células eucariotas Dra. Anabel Alvarez Juliá Biología celular - 2017
Transfección: Proceso por el cual un ácido nucleico foráneo ingresa en una célula eucariota Para qué transfectar? Estudiar la regulación de la expression génica (promotores y otros elementos regulatorios) Estudiar mecanismos involucrados en el procesamiento del ARN, postraduccionales, etc. Estudiar la localización subcelular y/o el efecto de la expression de una proteína sobre el fenotipo celular Expresión de proteínas para su purificación Evaluar la interacción de proteínas Producir organismos transgénicos Terapia génica
Tipos de transfección Estable El ADN se incorpora dentro del genoma. Transmiten el ADN introducido a su progenie. Transitoria El ADN introducido no se integra al genoma. Existe solo por un período limitado de tiempo. No se transmite en la división celular.
Cuál elijo? Estable Es necesario seleccionar las células que han incorporado el ADN. Se requiere de un método de transfección de alta eficiencia. Transitoria Se puede evaluar el efecto de la transfección a tiempos cortos Brooks, PNAS 2007 Producción de proteínas a gran escala, estudios farmacológicos largos, terapia génica Efectos rápidos de la expresión de genes o sus productos o producción de proteína a pequeña escala
Cómo transfecto? Métodos físicos Electroporación Biobalística Microinyección Métodos químicos Liposomas Fosfato de calcio Polímeros catiónicos Métodos biológicos (transducción viral) Adenovirus Retrovirus Lentivirus
Métodos físicos Biobalística Proyección de micropartículas de oro recubiertas con el ácido nucleico a alta velocidad Dispositivo: Gene gun Células vegetales Microinyección Microinyección del ADN al núcleo Dispositivo: microagujas/micromanipulados Células individuales Electroporación El ADN pasa a través de poros temporarios en la membrana celular Dispositivo: electroporador. Da un pulso eléctrico que eleva el potencial eléctrico de la membrana celular Suspensión celular
Métodos químicos Moléculas catiónicas: Péptidos y sus derivados (por ejemplo, polilisina) Polímeros sintéticos (polietilenimina o PEI) o naturales (colágeno) Lípidos catiónicos (liposomas) Difieren en eficiencia y citotoxicidad Mecanismo: forman complejos con el ADN, que se adhieren a la membrana celular mediante interacciones electrostáticas y son incorporados por endocitosis. Fosfato de calcio: se utiliza una solución buffer para formar un coprecipitado de ADN y fosfato de calcio sobre el cultivo celular. Este precipitado ingresa a la célula por endocitosis
Métodos biológicos 1. Producción de partículas pseudovirales en células empaquetadoras: virus defectivos para la replicación cuyo genoma incluye al gen de interés 2. Infección de células de interés con partículas virales Ventajas: Amplio rango de células de mamíferos con alta eficiencia de transfección Dependiendo el tipo de virus se puede: Restringir la infección a células en división o a células que no se dividen únicamente Dirigir a un tipo celular específico (terapia génica) Integrar o no en el genoma Ejemplo: lentivirus
Eficiencia de la transfección No todas las células incorporan el ADN foráneo. Eficiencia: porcentaje de células que incorporaron el ADN. Tipo celular Viabilidad celular Confluencia Medio de cultivo Tipo de molécula transfectada Método de transfección Calidad y cantidad de ADN Método A Método B
Vectores Cómo ingresa el ADN a la célula? Un vector es una molécula de ADN que se utiliza como vehículo para introducir material genético exógeno a otra célula, donde puede replicar o ser expresado. Plásmidos Los plásmidos son un tipo de vector. Son moléculas pequeñas de ADN circular doble cadena. Se replican en forma independiente del cromosoma bacteriano
Clonar o expresar? Los vectores de clonado son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Los vectores de expresión poseen toda la información necesaria para expresar el gen.
Entonces, para clonar necesito: Origen de replicación (ori) Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción (MCS Multiple cloning site) Marcadores que permitan su reconocimiento (resistencias a antibióticos)
Y si quiero expresar el gen? Además del origen de replicación, marcador de selección y MCS, necesito: Promotor Sitio de unión a ribosomas Sitio de terminación de la transcripción Plus: tags a proteínas fluorescentes o detectables por anticuerpos Marcador de selección para eucariotas (transfección estable)
Ya tenemos el gen de interés en nuestro vector y ahora?
Cultivo celular Cultivo primario Células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y cultivados en un medio artificial. Línea celular Cultivo celular que tiene capacidad de multiplicarse indefinidamente
Confluencia pasajes celulares Adheridas: Disgregación química, mecánica o enzimática Suspensión: Dilución
Establecimiento de una línea celular
Medio de cultivo Debe aportar todos los requerimientos para el crecimiento de las células Base: Glucosa (fuente de C), aminoácidos (fuente de N), cofactores enzimáticos, vitaminas, sales Suplementos Buffer: Mantenimiento del ph, bicarbonato, HEPES Suero: Estímulos proliferativos y adhesivos. Ejemplos: Transferrina, albúmina, factores de crecimiento, etc. Antibiótico: Prevención de contaminación. Ejemplos: Penicilina, estreptomicina, gentamicina
Condiciones físico-químicas ph: 7.2-7.5 Osmolaridad: 280-320mOsmol/kg Medio de cultivo CO 2 : 5-7 % Temperatura: 37 C (mamíferos) Esterilidad Técnica asép ca
Técnica aséptica Cabinas de seguridad biológicas Mechero Esterilizar la cabina con luz UV antes de usar Guantes Guardapolvo Limpiar el área antes de empezar a trabajar Corrientes de aire estéril. Esperar 5 minutos antes de comenzar a trabajar Medios esterilizados (filtración), material autoclavado
Reglas de trabajo en el laboratorio Antes de entrar Saber qué hay que hacer = Leer la guía -Cabello recogido -Guardapolvo Antes de empezar Limpiar la mesada de trabajo con alcohol 70% Verificar el material de trabajo Al finalizar Descartar el material, Verificar mecheros, Limpiar la mesada, Dejar las pipetas en su máxima graduación
TP de transfección Desarrollo del TP Materiales Tubos eppendorfs estériles Tips estériles Micropipetas Soluciones PEI 87k Opti-MEM ADN plasmídico-gfp PBS estéril N-cadherina-GFP 850 ng/µl β3-integrina-gfp 490 ng/µl α Actinina-GFP 370 ng/µl PTP1B-D181A-GFP 560ng/µl Paxilina-GFP 610 ng/µl Tubulina-GFP 580 ng/µl Medio de cultivo completo (DMEM con 5% Suero fetal bovino, antibiótico)
1. Sembrar las células en una placa multipocillos a una densidad celular adecuada 24 hs antes de la transfección 2. Preparar la mezcla de transfección usando los reactivos a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml estériles de la siguiente manera: -1 µg de DNA/pocillo -2 µl de PEI 87k /pocillo -100 µl/pocillo de Opti-MEM Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente 3. Lavar cada pocillo de células con PBS estéril 2 veces 4. Agregar 200 µl de Opti-MEM a cada uno 5. Agregar la mezcla de transfección a cada pocillo 6. Incubar 2 a 4 hs en estufa Cambiar el medio de las células por medio fresco completo a 37 C