VI. DISCUSIONES. VI.1

VI. DISCUSIONES. VI.1 Caracterización celular de bacterias totales (BT) mediante naranja de acridina y Bacterias Metabólicamente activas (BMA), con la sonda EUB338 y Oxidantes de amonio. Como se puede observar en las figuras 3, 4 y 5 se encontró una diferencia de entre un 20-30% entre la especificidad de detección entre BT y BMA, así como una diferencia de 30-40% entre BT y AOB, dicha diferencia es debido a que el colorante naranja de acridina, no discrimina al interactuar tanto en cadenas de ADN como de RNA, de todo tipo de microorganismo (bacterias, fitoplancton, zooplancton, etc.), a su vez este colorante no es capaz de distinguir entre organismos metabólicamente activos de los inactivos, debido a que este colorante interactúa principalmente en los grupos fosfatos de la cadena de ácidos nucleicos (Kepner y Pratt, 1994). La información que da el naranja de acridina no discrimina entre células vivas o muertas que no han sido lisadas, ya que solo representa el ADN de la bacteria y no su condición de vida, el mayor problema es su afinidad con materia particulada que fluorece de manera similar a las bacterias, lo que podría incrementar sus conteos si no se tiene experiencia con relación a la forma física de éstas. Caso contrario con el método de FISH, en donde la sonda de oligonucleótidos empleada se une específicamente a subunidades del ARN siendo la más común o ampliamente utilizada la región 16S (Atlas y Bartha, 2006), y este es indicativo de actividad metabólica de los microorganismos. Las bacterias de origen marino son regularmente pequeñas, tienen poco o nulo crecimiento por lo que la intensidad de la señal de fluorescencia pueden encontrarse por debajo de los límites de detección o se pierde por la alta fluorescencia del campo observable (Pernthaler y col., 2003). Debido a esto se han implementado nuevas técnicas con el fin de aumentar la calidad de la señal, dichas técnicas varían desde la utilización de fluorocromos más brillantes hasta la modificación de técnicas establecidas (Pernthaler y col., 2003; Thimm y Tebbe 2003; Rowan y col., 2005; Tang y col., 2005). Kuwae y Hosokawa (1999), cuantificaron y caracterizaron la población bacteriana en sedimentos de la bahía de Tokio utilizando una técnica de doble tintura con naranja de 41

acridina y DAPI, y reportan un conteo bacteriano en el rango de 0.20 x 10 9 hasta 3.54 x 10 9 cél/g. de sedimento húmedo. En contraste en el presente trabajo, la concentración celular varió en el rango de 10 7 hasta 10 8 cél/ml en agua de cultivo del sistema de biorremediación o estero. Sin embargo estos investigadores utilizaron una serie de técnicas para separar el contenido celular bacteriano del resto del sedimento, así como el uso de una doble tintura DAPI-Naranja de acridina, en donde el fluorocromo DAPI realizó una discriminación celular de bacterias metabólicamente activas debido a que éste se une directamente a los polifosfatos. Se ha comprobado que este colorante tiene una preferencia de unión en secuencias de ADN ricas en adenina y tiamina, lo que da como resultado a una longitud de onda de 365 nm, una coloración azul al unirse a ADN bacteriano y una coloración amarilla al unirse a ADN de otro material genético (Kepner y Pratt, 1994), con lo que explica la diferencia de hasta dos órdenes de magnitud con los datos obtenidos en nuestra investigación. López-Torres y Lizárraga-Partida (2007), encontraron diferencias en el porcentaje de hibridación entre el fluorocromo DAPI y la sonda EUB338 en un rango de 27-70%, en contraste, en esta investigación se encontró un porcentaje de hibridación en un rango entre 20-40% entre el fluorocromo naranja de acridina y la sonda EUB338 (Fig. 3, 4 y 5). Dicho contraste puede ser debido a que el colorante naranja de acridina no discrimina entre ADN bacteriano y partículas de detritus lo que pudo haber sobreestimado la carga bacteriana total. Como muestra la figura 7 la concentración bacteriana que se encontró en nuestra investigación se mantuvo en un orden de 10 6 cél/ml en todos los tratamientos del sistema de biorremediación, dichos resultados contrastan con los encontrados por Christenssen y col., (1999), en donde reportan una concentración de 10 8 cél/g de sedimento, lo cual es dos órdenes de magnitud mayor a lo encontrado en esta investigación. Sin embargo dichos investigadores utilizaron muestra de sedimento de una granja experimental, que fue enriquecida con extracto de glucosa lo cual nos podría explicar el aumento en la concentración celular. Pernthaler y col. (2002), cuantificaron bacterias totales metabólicamente activas por medio de la sonda EUB338 en muestras del Mar del Norte y reportan una biomasa bacteriana en un rango de 1.5 x 10 5 cél/ml hasta 9.9 x 10 5 cél/ml, con tendencia a incrementar su biomasa a medida que se acercaba a zonas costeras. 42

En investigaciones recientes se ha empleado a la sonda EUB338 con el fin de determinar la concentración de BMA o bien para comparar la eficiencia de colorantes fluorescentes como DAPI o naranja de acridina. Pernthaler y col. (2002), realizaron una comparación en el porcentaje de hibridación entre el fluorocromo DAPI y la sonda EUB338. En una investigación similar Sekar y col. (2003), utilizaron la sonda EUB338 y el colorante DAPI con el fin de establecer el mayor porcentaje de hibridación utilizando diferentes fluorocromos añadidos a la sonda. Las descargas de compuestos nitrogenados dentro del ambiente marino, puede llevar a grandes repercusiones como la toxicidad por medio de NH 3, disminución en la concentración del oxígeno disuelto y florecimiento de algas, las cuales pueden ser tóxicas o tener repercusiones negativas en la dinámica ecológica costera (Park y col., 2006). Se ha establecido que el nitrógeno presente en el cultivo de camarón provienen de tres fuentes principales: la excreción de estos compuestos por medio de la respiración de los camarones, además de la lixiviación de los alimentos ricos en nutrientes y de la materia fecal de los camarones, aunque este último es una fuente inmediata de nitrógeno para los microorganismos (Burford y Williams, 2000). La nitrificación es el proceso clave con la cual se reducen las altas concentraciones de compuestos nitrogenados, dicho proceso es realizado por dos grupos de microorganismos diferentes, las bacterias oxidantes de amonio (AOB) y las bacterias oxidantes de nitrito (NOB), siendo la primera población responsable del 95% de oxidación de amonio (Park y col., 2006). Al respecto en esta investigación se encontró que del 100% de la población de bacterias metabólicamente activas, la población de BMA se encontraron en un 50-70% en el tratamiento de moluscos, 40-60% en el tratamiento de microalgas y un 70% en el estero (Fig., 3, 4 y 5), lo que podría explicar las bajas concentraciones de compuestos nitrogenados detectados en esta investigación en cada uno de los tratamientos del sistema (Tabla I, II y III anexos). Hermansson y Lindgreen (2001), encontraron una concentración de bacterias oxidantes de amonio en un rango de 1.7 x 10 5 hasta 1.2 x 10 6 cél/gr, concentraciones que se incrementaron hasta 4.7 x 10 7 cel/gr al pasar por un proceso de fertilización. En una investigación similar Coskuner y col. (2005), cuantificaron la población de bacterias oxidantes de amonio en muestras de sedimentos de plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas, 43

en donde encontraron poblaciones bacterianas (AOB) en un rango de 2.47 x 10 5 hasta 2.17 x 10 8 cél/ml, en contraste esta investigación donde se encontró una concentración celular de AOB de hasta 10 4 cél/ml en todos los tratamientos del sistema de biorremediación, resultado que difiere hasta 4 órdenes de magnitud con lo publicado por dichos investigadores; sin embargo dicha diferencia, es explicable por la naturaleza de la muestra utilizada por estos investigadores. En la presente investigación se esperaba una mayor concentración de esta población de bacterias, debido a que la muestra utilizada provenía de un ambiente rico en compuestos nitrogenados, sin embargo, los resultados obtenidos indican que no sucedió así. Existe escasa información sobre el tema de bacterias en ambientes marinos y costeros, por lo que no se tiene un punto de comparación adecuado. Aunque el papel que juegan las bacterias oxidantes de amonio dentro de la nitrificación es ampliamente conocido y limitado, en la actualidad diversos investigadores se han enfocado en conocer las poblaciones que se encuentran dentro de la comunidad de bacterias oxidantes de amonio. Por ejemplo en cultivos de agua dulce se encuentran ampliamente documentadas 4 poblaciones bacterianas dentro de este proceso de nitrificación: Nitrosomonas marina, Nitrosospira sp., Nitrosomonas europaea y Nitrosococcus mobilis. De estas bacterias, Nitrosomonas marina ha sido establecida como la que desempeña el mayor papel dentro de este proceso. (Burrell y col., 2001). Dicho Phylum bacteriano se encuentra ampliamente distribuido en ambientes marinos y por mucho la población dominante del la comunidad de bacterias oxidantes de amonio, seguido por Nistrospira y Nitrobacter (Coskuner y Curtis, 2002). En la actualidad diversas investigaciones han sugerido que existe una coexistencia entre la población de bacterias oxidantes de amonio y bacterias anaerobias oxidantes de amonio (Anamox), en donde existe una organización espacial la cual queda establecida de la siguiente manera: las bacterias Anamox ocupan cerca del 62 al 92% y las bacterias oxidantes de amonio del género Nitrosomona, Nitrospira y Nitococcus ocupan del 13 al 21 % de la población total dentro de una biopelícula (Kindaichi y col., 2007). Sin embargo, dicha población bacteriana no solo mantiene una relación con bacterias de tipo Anamox sino que también se ha establecido una interacción ecofisiológica entre bacterias de naturaleza heterótrofa, en donde se ha determinado que del 100% de la población caracterizada en una 44

biopelícula, el 50% corresponde a bacterias oxidantes de amonio y el 50 restante estuvieron conformadas por bacterias de la clase proteobacteria, la cual tiene como función dar estabilidad a la comunidad (Kindaichi y col., 2003), lo que coincide en gran medida con los resultados obtenidos en esta investigación en donde se observó una estrecha relación entre las BMA y AOB caracterizadas con las sonda EUB338 y AOB, respectivamente. VI.2 Caracterización poblacional bacteriana entre los tratamientos del sistema. Aunque los datos obtenidos con el análisis de varianza no mostró diferencia significativa entre la concentración de la población de bacterias dentro de los tratamientos que conforman el sistema de biorremediación, existió una diferencia en la morfología celular al comparar el colorante naranja de acridina con la sonda EUB338, en donde el primero mostró una morfología compuesta por diferentes tipos de poblaciones microbianas que van desde cocobacilos, bacilos y bacterias filamentosas, con una mayor proporción de estas últimas en el tratamiento de microalgas, sin embargo, al caracterizarse con la sonda EUB338 se encontró una población homogénea que estaba dominada morfológicamente por bacilos y cocobacilos. Jochen (2001), realizó una caracterización de la morfología celular bacteriana en el norte del golfo de México por medio del colorante DAPI, y encontró que básicamente la población estaba dominada por tres tipos celulares de morfología: cocos, bacilos y cocobacilos, en donde los cocos representaron entre un 40 y un 60% de la población caracterizada. Es ampliamente conocido que dentro del ambiente marino, la población bacteriana está dominada por bacterias de morfología bacilar y cocoide, y que en la mayoría de los casos son bacterias tipo Vibrio, así como bacterias del Phylum Proteobacteria (Pujalte y col., 1999). Sin embargo, existe una amplia heterogeneidad de poblaciones bacterianas en ambientes marinos, encontrando especies del género Cytophaga y Flavobacterium las que en la actualidad se ha observado que poseen una alta presencia en poblaciones marinas (en un rango de 2 al 72%), aunque su papel dentro de dichas poblaciones no se encuentra bien definido (Glockner y col., 1999). Así mismo, no existió diferencia significativa en la población de bacterias oxidantes de amonio entre los tratamientos del sistema, sin embargo, como se menciona en párrafos 45

anteriores existe una interacción entre esta población y bacterias de naturaleza heterótrofa, dicha tendencia se observó en diversas investigaciones en donde la población se mantiene en un orden estable de 10 4 a 10 5 cél/ml inclusive en medios ricos en compuestos nitrogenados. VI.3 Relación de la población de bacterias oxidantes de amonio respecto a NH 4, NO 2, NO 3 y temperatura. Como se observa en la figura 9, hubo una disminución en la concentración de bacterias oxidantes de amonio conforme al tiempo en todos los tratamientos que componen el sistema de biorremediación, dicha disminución es atribuible en primera instancia a la utilización de compuestos nitrogenados por las bacterias, los cuales son necesarios para llevar a cabo su metabolismo, los cuales al escasear provocaron una disminución en la concentración de dicha población, en donde a su vez se esperaba que el NH 4 disminuyera y se incrementara los NO 2 y NO 3 (Atlas y Bartha, 2006) (Fig. 1). Lo cual concuerda con lo encontrado por el análisis de correlación lineal mostrando una relación entre la concentración de bacterias oxidantes de amonio y los nitratos nitritos, donde se observa que esta población tiene una preferencia en la utilización de NO 2, lo que concuerda con lo encontrado por Cébron y col., (2003), donde encontraron una alta relación entre la población de bacterias oxidantes de amonio y disminución de NH 4, así como el incremento de NO 2. También se observó que no se presentó ningún cambio significativo en la concentración de NH 4, NO 2 y NO 3, asimismo no hubo relación significativa entre los tratamientos en cuanto a concentración de dichos compuestos (Tabla I, II y III anexos). Sin embargo, no solamente las bacterias oxidantes de amonio son las que cumplen el papel como fijadores de amonio dentro de los sistemas marinos, se ha demostrado que el fitoplancton también puede llevar a cabo este papel, llegando alcanzar del 33 al 43% de la fijación de amonio en sistemas de producción semiintensivos e intensivos, respectivamente (Bode y col., 2004). De igual forma se ha observado que existe un cambio drástico en la dinámica de población bacteriana, la cual se traduce como un aumento en la concentración de bacterias heterótrofas, así como en la población general de bacterias y fitoplancton al presentarse descargas de aguas residuales procedentes de granjas camaronícolas (Hrenovic y 46

col., 2003). Información que concuerda con lo encontrado en nuestra investigación, en donde posiblemente la interacción de fitoplancton dentro del sistema, así como una elevada concentración de bacterias heterótrofas, puede sugerir que parte del nitrógeno amoniacal pudo haber sido fijado por el fitoplancton, además de las bacterias oxidantes de amonio, lo que se puede observar en la tendencia de los compuestos nitrogenados cuantificados en el sistema. La temperatura de igual manera, es uno de los parámetros más importantes dentro del crecimiento poblacional bacteriano, sin embargo en esta investigación el análisis de correlación lineal no mostró una buena correlación entre la temperatura y la concentración de bacterias oxidantes de amonio en ninguno de los tratamientos, lo que sugiere que la disminución registrada en las AOB puede deberse a la combinación de factores diversos tanto ambientales como humanos (aireación dentro del sistema, alimentación balanceada, etc.,). Bajo condiciones naturales en el sistema control (estero) se encontró una mejor relación aunque no muy aceptable (r 2 = 0.49). A pesar de que se encontró relación entre la población de bacterias oxidantes de amonio y la concentración de los compuestos nitrogenados (NO 2 y NO 3 ), se observó a lo largo de la investigación una disminución de la población bacteriana, así como una tendencia constante en disminución de la concentración de estos nutrientes, con excepción del nitrógeno total que presentó un aumento a lo largo de la investigación. Lo que nos indica que existe utilización de dichos compuestos, por medio de bacterias oxidantes de amonio y posiblemente por el fitoplancton, sin embargo, no se pudo demostrar en este trabajo, quién o quiénes utilizan el NH 4 como fuente de nitrógeno (Grobbelaar, 2004); de igual forma, los valores obtenidos de bacterias oxidantes de amonio se encontraron dentro de los rangos reportados por diversos investigadores, tomando en consideración que la naturaleza de la muestra utilizada difiere bastante del resultado mostrado en nuestra investigación. Por lo anterior se infiere que el proceso de biorremediación se llevó a cabo en los sistemas implementados. Sin embargo se requiere más estudios específicos con otros grupos e bacterias para determinar la eficiencia de la nitrificación en cada uno de los tratamientos. 47