Viejas y nuevas tecnologías en el estudio de enfermedades genéticas Miguel A. Garcia-Gonzalez, PhD. Hospital Clínico San Carlos 5 de Abril, 2014
Contenido 1 Por qué? 2 Qué es la secuenciación? 3 Tipos de ultrasequenciación 4 Cómo funcionan estas tecnologías?
Qué enfermedades podríamos diagnosticar? Aberraciones cromosómicas : Más de 5 Aneuploidias 11 Enfermedades d Renales 78 Enfermedades Neurológicas 56 Enfermedades Metabólicas y Endocrinas 69 Enfermedades Musculoesqueléticas 26 Enfermedades Hematológicas y Cardiovasculares 29 Enfermedades Multisistémicas 55 Enfermedades Neoplásicas 19 Enfermedades Dermatológicas 13 Enfermedades d Farmacogenéticas 12 Enfermedades Mitocondriales 6 Enfermedades Reproductivas
En qué beneficiaría al paciente? Aseguraría un diagnóstico certero: Beneficiaría el tratamiento de la enfermedad Podría anticiparse antes de que se desarrolle la enfermedad Podría determinar el prognóstico de la enfermedad Interaccion génica mal prognóstico. Herramienta de incalculable valor en la donación de órganos. Nos proporciona información y conocimiento sobre la Nos proporciona información y conocimiento sobre la enfermedad.
Métodos estudio de mutaciones RFLP Marcadores Southern Blot Northen Blot ASO Allele-Specific Oligonucleotide PCR Reacción en cadena de la polimerasa Hibridación in situ Análisis de secuencias
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Enzimas de restricción ió : reconocen secuencias específicas de ADN Cambios generan o eliminan sitios de restricción Deleciones, inserciones y SNPs
DNA fingerprints
Marcadores en el Diagnóstico Molecular a2 a1
Southern blot Análisis del ADN a groso modo Estructura de ADN, cortado con enzimas de restricción (miles de fragmentos) Sonda: segmento ADN Sonda: segmento ADN clonado y marcado
ASO Allele-Specific Oligonucleotide Detecta mutaciones puntuales Sondas: ADN corto de una hebra Hibridación solo si hay coincidencia perfecta
VNTR
Short Tandem Repeats (STRs) Marca fluorescente AATG AATG AATG 7 repeticiones 8 repeticiones La región repetitiva es variable y los lugares donde se alojan los partidores son constantes Homocigoto = ambos alelos tienen el mismo número de repeticiones i Heterocigoto = los alelos son diferentes y pueden ser distinguidos uno del otro La posición de los partidores define el tamaño del producto de PCR
Fluorescence in Situ Hybridization FISH
MLPA (multiple l ligation i probe assay) dup del MLPA
Single Nucleotide Polymorphisms SNP Métodos de estudio: 1. Cortando el ADN y estudiando los fragmentos ej: enzimas restricción ió 2. Copiar el ADN ej: secuenciar 3. Hibridacióncon id ió sondas de ADN ej: OLA, Taqman
Tambien podemos diagnosticar por Hibridaciónid ió genómica comparativa CGH
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa Se generan en 32 ciclos (con 100% de eficiencia) 1.070 millones de copias de ADN
Métodos de detección de producto amplificado Electroforesis en gel de agarosa
PCR en Tiempo Real Detección inespecífica
Secuenciación del ADN Incluye varios métodos y tecnologías que se utilizan para determinar el orden de las bases de nucleótidos: adenina, guanina, citosina y timina en una molécula de ADN.
Tipos de secuenciación Secuenciación Maxam Gilbert Método de terminación de la cadena Sanger Dye-terminator seq Pyrosequencing Ultrasecuenciación
Evolución
Maxam Gilbert 1976-77, "química de secuenciación". Modificación de ADN, la escisión subsiguiente en las bases específicas. Etiquetado radiactivo en el extremo 5 'del ADN (típicamente por una reacción de la Kinasa utilizando gamma-32p-atp) y purificación del fragmento de ADN a secuenciar. El tratamiento químico genera cortes en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de cuatro reacciones (G, A + G, C, C + T).
Maxam Gilbert Los DNAs modificados son entonces cortados por piperidina caliente en la posición ió de la base modificada. d Los fragmentos en los cuatro reacciones se someten a electroforesis de lado a lado en geles de acrilamida desnaturalizante para la separación de tamaño. Gel se expone a película de rayos X para autorradiografía, produciendo una serie de bandas oscuras que corresponden a un fragmento de ADN de radioisótopos, que puede facilitar la secuencia inferida 1) Dimethyl sulfate (DMS): G (+a), 2) Formic acid: A+G, facilitar la secuencia inferida. 3) Hydrazine: C+T, 4) Salt (sodium chloride) + hydrazine: C
Método de terminación de la cadena Método de Sanger: Uso de trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddntps) como terminadores de la cadena de ADN. Se requiere: Una sola hebra de ADN plantilla Cebador ADN polimerasa Desoxinucleótido trifosfatos (dntps) Nucleótidos modificados dideoxyntps) que terminan la elongación del ADN capítulo.
Método de terminación de la cadena Estos ddntps también son marcados radiactivamente o con fluorescencia para la detección en las máquinas de secuenciación ió automatizadas. ti
Método de terminación de la cadena La muestra de ADN se divide en 4 reacciones de secuenciación separadas, que contienen todos los 4 de los desoxinucleótidos estándar (datp, dgtp, dctp y dttp) y la DNA polimerasa. Para cada reacción, se añade sólo una de las 4 dideoxinucleótidos (ddatp, ddgtp, ddctp, o ddttp), que son los nucleótidos de terminación de cadena, carente de un grupo 3'-OH necesario para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, terminando así ADN extensión de la hebra y resultando en fragmentos de ADN de longitud variable.
Dye-terminator Es el pilar en la secuenciación automatizada. ti Limitación: Efectos del marcaje debido a diferencias en la incorporación de los terminadores de la cadena marcada con colorante en el fragmento de ADN, dando lugar a alturas de los picos desiguales y formas en el cromatograma de la secuencia después de electroforesis capilar
Método en tiempo real basado en la liberación de pirofosfato (PPi) que se produce en la reacción de polimerización de ADN de los dntps. Esta metodología se utilizó para monitorear continuamente la actividad de la DNA polimerasa. Requiere preparación de una molécula de DNA monocatenario que se hibrida con una imprimación pequeña. A medida que avanza la reacción, se hará una síntesis de la cadena complementaria y vamos a obtener una serie de picos de señal en el pirograma que nos permiten determinar la secuencia. Pyrosequencing
Todo esto osequedó o será obsoleto en breve!!!
Next-Generation Sequencing Technologies Generation: First Second Thirdd GENOMICS TRANSCRIPTOMICS EPIGENOMICS SOLiD
454 FLX pyrosequencing El método amplifica ADN dentro de las gotitas de agua en una solución de aceite (emulsión PCR), con cada gotita que contiene una plantilla de ADN de una sola unido a un único cebador-bola recubierta que forma entonces una colonia clonal. La máquina de secuenciación contiene muchas volumen picolitros pozos cada uno con una sola cuenta y las enzimas de secuenciación. Pyrosequencing utiliza luciferasa para generar luz para la detección de los nucleótidos individuales añadidos al nuevo ADN, y los datos combinados se utilizan para generar la secuencia de lectura de espera.
454 FLX pyrosequencing Annual Reviews
Video 454 FLX pyrosequencing
Solexa-based Whole Genome Sequencing Secuenciación por amplificación del genoma en portas
Adapted from Richard Wilson, School of Medicine, Washington University, Sequencing the Cancer Genome http://tinyurl.com/5f3alk Solexa flow cell ~50M clusters are sequenced per flow cell.
Video Solexa
SOLiD SOLiD 4 5500xl
Secuenciación mediante ligación. Antes de la secuenciación, el DNA se amplifica por emulsión de PCR. Cada bead resultante contiene copias únicas de la misma molécula l de ADN Se depositan sobre un portaobjetos t de vidrio. i El resultado es una secuencia de cantidades y longitudes comparables a la secuenciación de Illumina. SOLiD sequencing
SOLiD sequencing Aquí, una piscina de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud fija están etiquetados de acuerdo con la posición secuenciado. Los oligonucleótidos se reasociaron y ligaron; la ligadura preferencial mediante ADN ligasa para hacer coincidir los resultados secuencias en una señal informativa del nucleótido en esa posición.
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SOLiD 5500xl Wildfire technology Higher Density Sequencing Colonies >500,000 colonies per panel Double today s bead density per panel 5 um Individual Sequencing Colonies
SOLiD 5500xl Wildfire technology Two sided Sequencing Flow-Cell Colonies on top surface FlowChip fluid channel 981,000 per mm 2 objective Colonies on bottom surface 905,000 per mm 2 1,886,000 sequencing colonies per mm 2 FlowChip
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Ion PGM Sequencer Elimina errores de secuencia: Bases modificadas Bases fluorescentes Láser de detección de Cascadas enzimáticas de amplificación Elimina limitaciones de la longitud de lectura: Bases no naturales Síntesis defectuosa Tiempo de ciclo lento
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Ion PGM Sequencer Ion 318 Chip* Achieved in 2011 100-fold scaling and 200 bp kits, 525 base perfect reads achieved Ion 316 Chip Breakthrough Ion AmpliSeq app, microbial and RNA-seq apps Ion 314 Chip 2012 Roadmap 2 x 200 paired end kit, 400 bp kits Custom and fixed AmpliSeq panels FDA submission and CE-IVD certification
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DNA Microarrays - DNA chips Futuro de los métodos de diagnóstico molecular Oligonucleótidos están adheridos en posiciones específicas en un chip de vidrio (u otra matriz sólida) y se hibrida id con la muestra. Análisis computacional
Medical Genetics, through research and back to humans. Miguel A. Garcia-Gonzalez, PhD. March 20 th, 2013
Qué significa Genética Médica? Es la especialidad de la medicina que implica el diagnóstico y tratamiento de los trastornos hereditarios La genética humana es un campo de la investigación científica que pueden o no se pueden aplicar a la medicina, pero la genética médica se refiere a la aplicación de la genética a la atención médica Incorpora áreas como la terapia génica, la medicina personalizada, y la nueva especialidad médica en auge, la medicina predictiva.
Qué especialidades abarcan Genética Médica? Genética clínica La práctica de la medicina clínica, con especial atención a los trastornos hereditarios Genética Metabólica / bioquímica El diagnóstico y el tratamiento de los errores innatos del metabolismo (galactosemia, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, desórdenes de almacenamiento ace a e lisosomal, acidosis s metabólica, trastornos peroxisomales, fenilcetonuria, y Trastornos del ciclo de la urea)
Qué especialidades abarcan Genética Médica? Citogenética El estudio de los cromosomas y anomalías cromosómicas (aneuploidía, reordenaciones cromosómicas y trastornos supresión / duplicación genómica) Genética molecular l Descubrimiento y testado en el laboratorio de las mutaciones del ADN que son la base de muchos trastornos genéticos Genética mitocondrial El diagnóstico y el tratamiento de los trastornos mitocondriales
Qué áreas abarca la Genética Médica? La práctica clínica de los médicos El consejo genético Actividades de diagnóstico clínico en el laboratorio Investigación sobre las causas y la herencia de los trastornos genéticos
La práctica clínica de los Nefrólogos
Consejo genético
Actividades de diagnóstico clínico en el laboratorio
Investigación
Grupo de Genética y Biología del Desarrollo de las Enfermedades Renales miguel.garcia.gonzalez@sergas.es CHUS Colaborators: - Servicio Nefrología CHUS - Dr. Carracedo y Barros (Genómica) International Colaborators: - Greg Germino (NIH, USA) - Terry Watnick (Hopkins, USA) - Drs. Pardo and Dra. S. Sobrido (CMT) - Marco Pontoglio (IC and IP, Paris) - Alessandra Boletta (Milán, Italia) - Walz y Kottgen (Freiburg, Alemania)