Bacterias Probióticas en Alimentos Fermentados. Características de los Productos y Microorganismos Iniciadores Knut J Heller* Cuando los probióticos se añaden a los alimentos fermentados, se deben considerar varios factores que pueden influir en la capacidad de los probióticos para sobrevivir en el producto y volverse activos cuando entran al tracto gastrointestinal del consumidor. Foto: ANUGA 2005 Panorama Introducción E n este artículo, se trata la influencia de la tecnología de producción de alimentos sobre las propiedades funcionales de los probióticos: primero, las posibles interacciones entre microorganismos probióticos y los compuestos de alimentos, y segundo, el efecto del producto y de las características de producción en las propiedades funcionales de los probióticos. El uso del término probiótico es únicamente conceptual y no se relaciona con los beneficios saludables comprobados. Interacciones entre Probióticos y Compuestos de Alimentos Fermentados Además de sus propiedades saludables, los probióticos deben cumplir varios requerimientos básicos para el desarrollo de productos probióticos comerciales. Los requisitos más importantes son que las bacterias probióticas sobrevivan en el producto en la cantidad suficiente, que se garantice su estabilidad física y genética durante el *From the Institute of Microbiology, Federal Dairy Research Center, Kiel, Germany. Presented at the symposium Probiotics and Prebiotics, held in Kiel, Germany, June 11 12, 1998. almacenamiento del producto y que se mantengan todas sus propiedades benéficas esenciales después del consumo y durante el almacenamiento del producto. Inclusive, los probióticos no deben tener efectos adversos en el sabor o aroma del producto y no deberán aumentar la acidez durante el almacenamiento del producto. Finalmente, los métodos para identificar las cepas de los probióticos deben de estar disponibles. Para aprovechar completamente las propiedades funcionales de las bacterias probióticas, los procesos utilizados para fabricar productos lácteos se deben modificar para cumplir con los requerimientos de los probióticos. Cuando esto no sea posible, se deben probar otras cepas o, en caso extremo, se deberán desarrollan nuevos productos. En esta parte se mencionan ciertas variables necesarias a considerar para la aplicación de probióticos en productos lácteos. Como todos los productos lácteos fermentados que contienen bacterias vivas, los productos probióticos se deben refrigerar durante el almacenamiento. Esto es necesario para garantizar altos índices de supervivencia de los organismos probióticos y para asegurar la es- tabilidad del producto. Además, debido a que se sabe que el tracto intestinal es una ambiente natural para las bacterias probióticas, se deben considerar el contenido de oxígeno, la oxidorreducción y la actividad acuosa del medio. Los microorganismos activos interactúan intensamente con su medio ambiente intercambiando componentes con el medio por productos metabólicos. De esta manera, la composición química del producto lácteo es muy importante para las actividades metabólicas de los microorganismos. Las variables esenciales son el tipo y cantidad de carbohidratos disponibles, el grado de hidrólisis de las proteínas de la leche (las cuales determinan la disponibilidad de los aminoácidos esenciales), y la composición y grado de hidrólisis de los lípidos de la leche (los cuales determinan la disponibilidad de ácidos grasos de cadena corta en particular). Por otro lado, las propiedades proteolíticas y lipolíticas de los probióticos pueden ser importantes para una degradación posterior de las proteínas y lípidos. Estas dos propiedades podrían tener efectos considerables en el gusto y sabor de los productos lácteos. Un aspecto importante en la produc- info@mundolacteoycarnico.com Julio/Agosto 2008 Mundo Lácteo y Cárnico 23
Panorama ción de productos lácteos fermentados es la interacción entre los probióticos y los microorganismos iniciadores. Aunque se sabe poco sobre esta interacción, se han establecido bien ambos efectos sinérgicos y antagónicos entre organismos iniciadores diferentes. Por ejemplo, el cultivo clásico de yogurt se caracteriza por una protosimbiosis entre Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Este sinergismo, visto como una acidificación acelerada y eficiente de la leche y la multiplicación de los cultivos se basa en una alimentación-cruzada entre ambos microorganismos, lo cual no es una propiedad de estas dos especies pero sí de cepas específicas de estas especies. Por otro lado, el antagonismo se basa comúnmente en la producción de sustancias que inhiben o interactúan más o menos, especialmente con otros microorganismos iniciadores relacionados y hasta con bacterias no relacionadas. Es importante señalar que el antagonismo es causado por bacteriocinas, las cuales son péptidos o proteínas que tienen propiedades antibióticas. La capacidad de producir bacteriocinas frecuente-mente se percibe como una propiedad deseable de los probióticos; sin embargo, el antagonismo de cultivos iniciadores y viceversa podría ser un factor limitante para la combinación de organismos iniciadores y probióticos. Se han descrito más actividades antagónicas producidas por bacterias ácido lácticas y las sustancias involucradas son peróxido de hidrógeno, ácido benzoico (producido por la pequeña parte del componente de la leche; ácido hipúrico) aminas biógenas (formadas por la decarboxilación de aminoácido) y ácido láctico. Una visión general del uso de bacterias iniciadoras en las fermentaciones lácteas y algunas de sus propiedades fisiológicas importantes se muestran en la Tabla 1. La intensidad de las interacciones entre los probióticos con la matriz del alimento y los microorganismos iniciadores dependen en gran parte de en qué momento se añadieron los probióticos al producto, por ejemplo, si estuvieron presentes durante la fermentación o se añadieron después. En el último caso, las interacciones podrían ser mínimas debido a que la adición pudo ocurrir inmediatamente antes o hasta después del enfriamiento a menos de 8 C y la actividad metabólica de los cultivos iniciadores y probióticos se reduce drásticamente a estas temperaturas. Sin embargo, durante un almacenamiento largo, pueden apreciarse efectos en el rendimiento aún con poca interacción. También, se debe evitar una interrupción de la cadena de frío para mantener las interacciones al mínimo. El estado fisiológico de los probióticos añadidos puede ser de mucha importancia. Este estado depende en gran parte del tiempo de recolección del cultivo (ya sea durante la fase logarítmica, durante la fase estacionaria o de crecimiento), en las condiciones que producen la transición a la fase estacionaria, en el tratamiento de los probióticos durante o después de su recolección y finalmente, de la composición del medio de cultivo de los probióticos en relación a la composición del alimento al que se va a añadir. Se pueden tomar en cuenta algunas ideas de manejo de probióticos de la experiencia de los productores de cultivos iniciadores comerciales. Cuando las bacterias probióticas participan activamente en la fermentación, se deben tomar muy en cuenta los aspectos de la composición del alimento y de las interacciones con la matriz del alimento y los microorganismos iniciadores. Debido a que el antagonismo entre probióticos y cultivos iniciadores producirá un retraso en el crecimiento o la inhibición total de uno de los componentes bacteriales, estos casos son relativamente fáciles de identificar. Una variable importante a este respecto es la producción de ácido láctico y la reducción concomitante del ph durante la fermentación, que producen una inhibición de los organismos probióticos. El estado fisiológico de los probióticos es de especial importancia cuando se Tabla 1. Organismos iniciadores para productos lácteos. Temperatura de Crecimiento Fermentación de Ácido Láctico Especies 1 Mínimo Óptimo Máximo Homofermentativos Heterofermentativos Ácido Láctico ph Final 24 Mundo Lácteo y Cárnico Julio/Agosto 2008 info@mundolacteoycarnico.com
considera cómo se finaliza la fermentación. Varias investigaciones muestran que las bacterias de la fase logarítmica son más susceptibles al estrés ambiental que las bacterias de la fase estacionaria. Experimentos con microorganismos iniciadores mostraron que los factores ambientales señalan a las bacterias la transición de la fase logarítmica a la fase estacionaria pueden tener un efecto considerable en los índices de supervivencia durante la fase estacionaria. De esta manera, una signo de privación, provocado por disminución de fuentes de carbono, aparentemente es mucho más favorable para sobrevivir que un ph bajo en presencia de suficientes fuentes de carbono. Sin embargo, las investigaciones en la regulación de bacterias acidolácticas en la fase estacionaria es una nueva disciplina. Ciertamente, se necesita mucho más investigación para explotar las posibilidades de mejorar los índices de supervivencia no sólo de bacterias probióticas sino también de bacterias iniciadoras tradicionales. Figura 1. Proceso de manufactura de leche acidófila de leche dulce y fermentada. Dulce Leche Acidófila Fermentada Tratamiento Término Intensivo de Leche (2 x 90 C por 20 min, o 1 x 140 C por 2 s) Enfriamiento a 37 C Inoculación con 5% Cultivo Lactobacillus acidophilus Enfriamiento 5 C Enfriamiento 5 C Adición de 1x1010 Lactobacillus acidophilus cells/ml. Envasado Envasado Almacenamiento a 5 C Almacenamiento a 5 C info@mundolacteoycarnico.com Julio/Agosto 2008 Mundo Lácteo y Cárnico 25
Panorama Producción y características de algunos productos lácteos fermentados en relación con el uso de probióticos La base para la producción de productos lácteos es la leche, la cual tiene una 0.6% de minerales. El ph de la leche está generalmente entre 6.5 y 6.7. La fracción de caseína y 20% de proteínas de suero. Por tanto, la materia seca no grasa de la leche está entre 8.5% y 9%. La leche acidófila dulce y la leche dulce AB son productos lácteos probióticos basados en leche sin fermentar. Ambas se producen añadiento concentrados probióticos a leche con tratamiento térmico intenso. El tratamiento térmico es necesario para alcanzar la suficiente estabilidad microbiológica durante el almacenamiento del producto final. L. acidophilus y L. acidophilus más bifidobacterias se añadieron a la leche Figura 2. Proceso de fabricación para diferentes tipos de yogurts. Yogurt Ajuste de Sólidos No Grasos 11-12% sólidos no grasos 13-14% de sólidos no grasos 15-18% de sólidos no grasos Yogurt bebible Yogurt Batido Yogurt natural Pasteurización Pasteurización Adición de cultivos iniciadores (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) Adición de sabor Componentes, fruta, etc Incubación a 40-45 C por 2 a 6h Batido Relleno de Envases Incubación a 40-45 C por 2.5 a 6h Enfriado a 4 8 C Enfriado a 4 8 C Adición de componentes de sabor, futa, etc. Batido Llenado de Envases Almacenamiento acidófila dulceyalaleche dulce AB, respectivamente. Por otro lado, se produjo la leche acidófila (fermentada) por fermentación con L. acidophilus. Se realizó nuevamente el tratamiento térmico antes de la fermentación; es necesario producir leche casi estéril para una fermentación exitosa debido a que el L. acidophilus acidifica lentamente y las bacterias contaminantes pueden competir fácilmente. Se presenta en la Figura 1 un esquema de la producción de leche acidófila. Los productos estilo yogurt se fabrican con diferentes texturas. El yogurt reposado natural, yogurt batido, y yogurt bebible se diferencian en su contenido de sólidos no grasos: 16-18%, 13-14% y 11-12%, respectivamente. En algunos países son legales variaciones considerables con respecto al cultivo iniciador utilizado, incluyendo a Alemania. A pesar de que el yogurt clásico se produce con un cultivo protosimbiótico termofílico de S. thermophilus y L. delbrueckii subsp. bulgaricus, el llamado yogurt suave se produce con el cultivo Almacenamiento termofílico de S. thermophilus y especies de Lactobacillus, generalmente L. acidphilus. Debido a la naturaleza termofílica del cultivo iniciador, la fermentación generalmente se lleva a cabo entre los 40 y 45 C. El tiempo necesario para la fermentación puede ser tan corto como 2.5h para el cultivo iniciador del yogurt clásico; esta fermentación rápida es principalmente el resultado de la protosimbiosis. Debido a la rápida acidificación y el corto tiempo necesario, el tratamiento térmico no se requiere cuando se utiliza el cultivo iniciador para yogurt clásico. Por otro lado, el yogurt suave requiere porque el uso de L. acidophilus como el componente Lactobacillus del cultivo iniciador. En cualquier caso, se necesita un ph<4.8 para garantizar la formación de un gel estable de la proteína coagulada de la leche. Esto es especialmente importante para el yogurt natural. Como resultado del método utilizado para fabricarlos, los yogurts batidos y bebibles son adecuados para que se les agreguen probióticos posteriormente a la fermentación. Los probióticos se pueden añadir fácilmente durante el batido del producto antes del llenado de los contenedores finales (Figura 2). Para el yogurt natural, las bacterias probióticas deben estar presentes durante la fermentación porque la fermentación se lleva a cabo en los contenedores finales y un batido posterior destruiría la textura del producto. Para la fabricación del yogurt suave, se puede utilizar el probiótico lactobacilli como cultivo iniciador porque cumplen con los requerimientos legales. Sin embargo, dicha elaboración es un compromiso entre la expresión total de los beneficios potenciales en la salud de las cepas de probióticos y la tecnología apropiada para la cepa. Las cepas de probióticos no solo deben cumplir con el criterio de supervivencia sino también con el criterio de fermentación y tener una interacción armoniosa con la cepa de S. thermophilus del cultivo iniciador 26 Mundo Lácteo y Cárnico Julio/Agosto 2008 info@mundolacteoycarnico.com
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Panorama Figura 3. Proceso de elaboración de kefir. CFU, unidad formadora de colonias. Kefir Manufactura Comentarios Leche Pasteurizada Inoculación con granos de Kefir Granos de Kefir: simbióticos, cultivos multicepas que consisten en: Levaduras (1x107-108 CFU/g) Candida Kefir, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces, etc. Lactococci (1x107-108 CFU/g) Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides Lactobacilli (1x108-109 CFU/g) Lb. Kefir, Lb. Fermentum, Lb. Reuteri1, Lb. Acidophilus1, Lb. Casei1, Lb. Brevis, Lb. Buchneri Bacterias acido acéticas (1x107-108CFU/g) Acetobacter pasteurianus 1 Cepas probióticos se aislaron de estas especies Fermentación a 18-28 C Durante 10-20h, ph final 4.4-4.5 Separación de granos de Kefir Incubación posterior opcional (Para producción posterior de a 4-7< C por 24-48h dióxido de carbono y etanol) Embotellado refuerza aumentando la temperatura de la mezcla suero-mezcla de coágulos a 50-55 C por 1-2h. Durante este tiempo las partículas del cuajo se contraen (por la pérdida adicional de suero) y se hacen más firmes. Después de que se drena el suero, el cuajo se lava con agua limpia eliminar la lactosa residual. Finalmente, se añaden crema y sal (y especias en algunos productos) a las concentraciones deseadas y se mezclan para posteriormente envasar para su venta. Existen dos opciones para añadir probióticos al queso cottage: ya sea con un cultivo iniciador o con crema y sal. La adición de un cultivo iniciador es problemática por dos razones. Primero, se pierden un número considerable de células bacterianas de la cuajada durante el drenado del suero. Por esto, es difícil de controlar exactamente el número de bacterias probióticas en el producto final. Segundo, las temperaturas de escaldado de <=55 C pueden afectar negativamente la supervivencia de las bacterias probióticas en el producto. Para el queso cottage, entonces, aparentemente es mejor añadir probióticos con la crema. Almacenamiento a 5 C utilizado. Esto podría significar que la cepa con la mejor combinación de propiedades funcionales y tecnológicas es el que se debe usar, no la cepa con las mejores propiedades para la salud. Un producto lácteo probiótico ideal podría ser el kefir porque las cepas de probióticos se aislaron de varios miembros de una flora típica ( ej. L. acidophilus, L. casei, and L. reuteri). Sin embargo, el mercado potencial para este producto es limitado por la forma abombada que toman los envases (como resultado de la producción de dióxido de carbono después de la fermentación) lo cual es un signo aparente de descomposición para la mayoría de los consumidores. Se presenta una visión general de la fabricación de kefir en la Figura 3. Mientras que la coagulación de las proteínas de la leche es una consecuencia de la producción de ácido en el yogurt, la coagulación en el queso se logra por medio de la acción proteolítica del cuajo. Se añade menos cuajo para el queso fresco (quesos que no se sometan a maduración) que para el queso madurado. Como un ejemplo, la producción del queso cottage se describirá en la Figura 4. Generalmente, la leche se inocula con un cultivo iniciador mesofílico y se incuba entre 20 y 30 C por un periodo relativamente corto antes de añadir el cuajo. Se incuba hasta que se forme la cuajada. La cuajada se corta para permitir que salga el suero de la caseína cuagulada. La expulsión del cuajo se Actualmente se conocen muchas variaciones de quesos madurados, pero todos sus diferentes métodos de elaboración no se discutirán en el presente artículo, especialmente porque el queso madurado tiene poca importancia como transportador de bacterias probióticas. Por esto, sólo se presentaran algunos aspectos generales y críticos sobre la supervivencia de probióticos se presentan en la Tabla 2. La leche pasteurizada y precalentada se inocula con un cultivo iniciador mesofílico o termofílico y se Cuando el ph de la leche baja hasta un continúa incubando hasta que se forma la cuajada. La cuajada se corta en pedazos con tamaños que difieren de acuerdo al producto final (pequeñas piezas como granos de trigo para quesos extra duros 28 Mundo Lácteo y Cárnico Julio/Agosto 2008 info@mundolacteoycarnico.com
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Panorama Figura 4. Proceso General de queso cottage. Queso Cottage Leche descremada pasteurizada Adición de cultivo iniciador: Lactococcus lactis subsp. Lactis, Leuconostoc cremoris Generalmente a 20-30 C Adición de cuajo (a ph 5.6-5.8) Corte del cuajo (a ph 4.5-4.7) Aumento de temperatura a 50-55 C por 2-3h con Generalme suave Drenado del suero Adición de crema, sal, especies, etc. Llenado de envases Enfriamiento, almacenaje o quesos duros, piezas de tamaños medianos para quesos semiduros y piezas más grandes (cubos de 2-3 cm) para quesos suaves). Dependiendo de la variedad del queso, las temperaturas de escaldado de <=55 C se pueden aplicar a la mezcla suero-cuajada. Después de que se drene el suero, las partículas de la cuajada se coloca en moldes en donde se les permite fusionarse, ya sea por el peso de la cuajada o por la aplicación de presión. El queso se sumerge en un baño de salmuera y se deja durante el periodo requerido desde algunas horas para quesos pequeños y suaves hasta un mes para quesos grandes y extraduros. Con Tabla 2. Etapas críticas en el elaboración de queso frecuencia, los quesos no se sumergen en baños de salmuera pero se salan en seco. Algunos quesos duros, como el cheddar, se salan durante la molienda de la cuajada drenada y se presiona una vez colocada en moldes. La duración de la maduración bajo condiciones de temperatura y humedad controladas dependen del tipo de queso y puede variar de algunos dias (suaves, queso con superficie madurada) hasta > 2 años (quesos extra-duros). Respecto al tiempo de adición de probióticos y el impedimento de supervivencia por la temperatura de escaldado, aplican las mismas consideraciones para el caso del queso madurado y para el queso cottage. Para quesos como el cheddar que se salan, es posible añadir una dosis exacta de probióticos cuando se añade la sal (ej., por aspersión de una solución muy concentrada de probióticos sobre la cuajada durante la molienda). Un problema adicional en queso madurado es causado por un periodo largo de maduración. No ha quedado claro a qué grado afecta las propiedades funcionales. Primero se puede imaginar que la capacidad relativamente alta de amortiguación de la matriz del queso, el alto contenido de grasa y la matriz ajustada puede estabilizar las bacterias probióticas no solo durante la maduración sino también durante el tracto intestinal después del consumo. Productos probióticos especiales que se obtienen por fermentación con una cepa probiótica individual y que no use uno de los productos lácteos estándares Etapa Condiciones Adición de cultivo iniciador Mesofílico (especies de Lactococcus, especies de Leuconostoc) Termofílico (Lactobacillus herveticus, Streptococcus thermophilus, etc) Salado Suero o salado seco (cheddar: salado seco de la cuajada Madurado A 10-15 C, hasta 1 o más (emmental: primero 2 meses a 22-25 C) como transportador no se describirá con detalle aquí. Con dichos productos, las restricciones tecnológicas se mantienen al mínimo porque la fermentación se dirige hacia un máximo de expresión de las propiedades funcionales (salud) de las cepas probióticas. La única restricción es fabricar un producto que sea aceptado por el consumidor. Conclusión Con el aumento de popularidad de los productos probióticos, los consumidores frecuentemente demandan que las propiedades saludables de las cepas probióticas se preserven en los productos vendidos y que haya por lo menos una oportunidad teórica de que los efectos saludables de las cepas probióticas sean evidentes después del consumo. Para garantizar esto, se deben considerar importantes variables por la industria láctea. Uno es que los números suficientes de células probióticas sobrevivan durante la vida de anaquel del producto. Otra es que las células probióticas sobrevivan en el tracto intestinal y se establezcan en el final del ileum o en el intestino grueso en cantidad suficiente para producir sus efectos saludables. Para asegurar esto, los estudios deben mostrar que las interacciones adversas con matrices de alimentos o con microorganismos iniciadores del alimento lácteo los cuales en este caso no juegan un papel importante. La medida esencial debe ser que los productos anuciados como probióticos, no sólo contengan cepas probióticas, sino que se tienen que mostrar los efectos probióticos. Los fabricantes de productos probióticos deben dejar claro esto a los consumidores. Fuente del material seleccionado: Probiotic Bacteria in Fermented Food: Product Characteristics and Starter Organisms American Journal of Clinical Nutrition EUA, 2001. Traducción: I.A. Violeta Morales V. 30 Mundo Lácteo y Cárnico Julio/Agosto 2008 info@mundolacteoycarnico.com