Validación Clínica sistema CEDAI: Centro de Espermiogramas Asistidos por Internet Alejandra García. MSc, Carolina Figueroa, Fabrizzio Horta. MClinEmb, Susana Vargas. MC, Victor Castañeda. PhD y Steffen Härtel. PhD Proyecto 14SSAF-27061-07 Innova-CORFO
Introducción Infertilidad problema creciente de salud pública mundial, afecta alrededor del 15% de las parejas (Program for Appropriate Technology in Health, 2002). En Chile, ~6000 parejas consultan por infertilidad al año. Espermiograma provee información fundamental para definir la severidad del factor masculino que determina la estrategia del tratamiento clínico de la pareja. Existen grandes diferencias entre laboratorios, debido a: - subjetividad, - falta de estandarización, - falta de controles de calidad, - falta de entrenamiento profesional.
Propuesta CED AI Centro de Espermiogramas Digitales Asistidos por Internet, UChile Optimizar, estandarizar y validar espermiogramas en relación a la concentración, movilidad, vitalidad, morfología estricta y fragmentación del ADN de los espermatozoides. Mediante la integración de biomarcadores de funciones espermáticas, imágenes microscópicas digitales, herramientas matemáticas para el análisis de imágenes, y telecomunicación vía Internet,
Espermiograma Manual Muestras Análisis Visual Normal Anormales Concentración Movilidad Recuento de Células Redondas Vitalidad Diferenciación Células Redondas Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN
Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Movilidad Recuento de Células Redondas Vitalidad Morfología Estricta Kruger Diferenciación Células Redondas Fragmentación ADN
Solución CED AI SAAS Software As A Service, menor costo manejo simple soporte y respaldo almacenamiento en cloud
Solución CED AI SAAS Software As A Service, Concentración Movilidad Células Redondas Vitalidad 3-4 Imágenes Fragmentación ADN 3-4 Imágenes
Computer aided sperm analysis (CASA) - Desde 1980 - Por que CASA? - Precision y confiabilidad - Facil de realizar - Resultados reproducibles y consistentes - Disminución de variabilidad entre laboratorios Microptic SCA 6, España Hamilton Thorne CASA-II, USA
Computer aided sperm analysis (CASA) - Éxito en la medición de características seminales en laboratorios de producción de animales domesticados y toxicología reproductiva - Excelentes resultados en análisis de separaciones espermáticas Pobre resultados en semen humano: Agregaciones espermáticas Alta presencia de debris de fondo Alto costo en Vitalidad (Fluoroforos) Morfología espermática solo en cabeza Microptic SCA 6, España No existen sistema CASA validados para la evaluación clínica automatizada del espermiograma Hamilton Thorne CASA-II, USA
Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Vitalidad Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN Captura de Motilidad Recuento de Células Redondas Diferenciación Células Redondas imágenes Muestra seminal + Eosina Y 1:1 Laminas Teñidas Morfología Kruger Laminas HALOSPERM
Validación ED AI con expertos nacionales Muestras Manual Expertos Luis Sarabia (U-Chile) Marcia Madariaga (IDIMI) Adolfo Acosta (Clínica Las Condes) Digital ED AI Espermiogramas Asistidos por Internet (CED AI, U-Chile) Movilidad (OMS 2010) Grupos: Progresivo No progresivo Inmóvil Concentración millones/ml Recuento de células redondas millones/ml Vitalidad % en base de >400 espermios Fragmentación ADN % en base de >400 espermios
Variabilidad entre laboratorios Concentración Motilidad 41% 55,5% Coeficiente de variación interobservador Rango del coeficiente de 2,8% - 57% 3,5% - 51,2% variación intra- observador Auger., et al (2000), Human Reproduction; 15 (11), 2360-2368. Jørgensen., et al (2001), Human Reproduction; 16 (5), 1012-1019. Leushuis., et al (2010), Fertil Steril;94(7):2631-5
Motilidad (al fresco contraste fases) Movilidad y Concentración Espermáticas Recuento de Células Redondas
Vitalidad Eosina Y (al fresco) campo claro (OMS) objetos tamaños colas objetos de un tamaño definido con cola
Vitalidad rojicidad Rojicidad : R/G o R/B
Vitalidad rojicidad R/G: 1.00 0.87 1.03 0.88 0.96 0.95 0.96 0.89 0.89
Vitalidad plano focal Eosina Y (al fresco) Eosina Y (al frotis)
Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)
Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios no refringentes (vivos)
Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)
Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)
Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Vitalidad Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN Captura de Motilidad Recuento de Células Redondas Diferenciación Células Redondas imágenes Muestra seminal + Eosina Y 1:1 Laminas Teñidas Morfología Kruger Laminas HALOSPERM
Calibración Motilidad
Método Manual Movilidad y Concentración Espermática Recuento de Células Redondas Carga de Muestra en cámara de recuento Lectura Movilidad (OMS 1999): al menos 200 espermatozoides son clasificados (SE=14rcto = 7.1%) en los Grupos A, B, C o D ; contar solamente espermatozoides completos, es decir, con cabeza y cola. Concentración [millones/ml], contar al menos 200 espermatozoides Recuento de células redondas [millones/ml]: Células germinales y/o leucocitos
Validación 20 Muestras Manual Expertos Luis Sarabia (U-Chile) Marcia Madariaga (IDIMI) Adolfo Acosta (Clínica Las Condes) Digital ED AI Espermiogramas Asistidos por Internet (SCIAN-Lab, U-Chile) Movilidad (OMS 1999) Grupos: A, B, C, D Concentración millones/ml Recuento de células redondas millones/ml
Metodología Movilidad - Video
Metodología Movilidad
Metodología Movilidad N t t y y x x VCL final t i i i i i i i _ 0 1 2 1 2 1 ) ( ) ( Velocidad curvilínea 0 _ 2 0 _ 2 0 _ ) ( ) ( t t y y x x VSL final t final t final t Velocidad lineal N t t Ys Ys Xs Xs VAP final t i i i i i i i _ 0 1 2 1 2 1 ) ( ) ( Velocidad promedio
Metodología Movilidad Diferentes sistemas digitales utilizan diferentes algoritmos matemáticos para: - identificar espermatozoides, - perseguir trayectorias, - calcular movilidad.
Metodología Movilidad y Concentración. Objetivo 10x ph1, 650,138 x 483,436µm
Metodología Movilidad y Concentración.. Identificación de cabezas por tamaño (4 a 15 pixeles).
Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas Identificación de colas de espermatozoides
Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas BorderDivCenterPix Para separar estructuras redondeadas
Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas Identificación de colas de espermatozoides
Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Cabezas c/ Colas Identificación de cabezas de espermatozoides con colas.
Concentracion [10E6]/ml] Verificación / Estandarización Concentración: Cuantificación de espermatozoides con cola. 400 350 300 250 Ob 1 Ob 2 Ob 3 EDAI 1 EDAI 2 EDAI 3 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Muestra Debido al conteo de un mayor número de objetos en el análisis digital los valores son más cercanos al valor real. SE = 10.5 % (Expertos) contra SE = 8 % (ED AI)
Calibración Motilidad
Comparación SCA versus ED AI CASA CED AI total=68 total=57 Cabezas sin cola: 11 2 Espermatozoides no encontrados: 4 2 Sobreestimación de la concentración y motilidad
Comparación SCA versus ED AI CASA CEDAI Intersección de trayectorias: - Error de Fusión y Fisión Colisión con detritus celular: - Error de velocidad
Vitalidad Eosina Y (al frotis) Familia de espermios refringentes (muertos) Familia de espermios no refringentes (vivos)
Vitalidad Eosina Y (al frotis) Familia de espermios refringentes (muertos) Familia de espermios no refringentes (vivos)
Fragmentación del ADN espermático Imagen Raw
Segmentación del Halo Detección de Cabezas
Generación del Halo
Clasificación Halos
Morfología Identificación de zona de cabezas por color (K-Means) Eliminación según tamaño y forma Detección de orientación de espermatozoides Crecimiento de máscara y relleno de cabeza Eliminación según tamaño y forma Después de Clustering Mascara de detección Después de separación por color Máscara resultante Segmentación de cabeza Filtro por umbralización Eliminación de bordes Acrosoma Detección de Orientación Núcleo Crecimiento de máscara Segmentación final Segmentación final Objetivo 63x / 0,63x, 163,028 x 121,226 µm
Morfología http://morfologia.cedai.cl/
Proyecto 14SSAF-27061-07 Innova-CORFO Validación Clínica sistema CEDAI: Centro de Espermiogramas Asistidos por Internet en el Laboratorio de Andrología de Clínica Las Condes
Hipótesis La utilización del sistema CEDAI para la realización de espermiogramas digitales, presenta resultados preliminares altamente correlacionados con los valores entregados por personal de laboratorio de Clínica las Condes, eliminando la subjetividad y error de operador. OBJETIVO GENERAL Evaluar el análisis del espermiograma digital, conjuntamente con el Laboratorio de Andrología de Clínica Las Condes.
Metodología
Análisis de los resultados Bland Altman:grafica la diferencia entre 2 ensayos Coeficiente Krippendorff-alpha: mide grado de concordancia entre 2 variables Coeficiente de spearman: Coeficiente correlación para muestras no paramétricas
Resultados
Concentración espermática 54
Concentración espermática Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 7 pacientes oligozoospermico severos 2 pacientes con azoospermia 19 muestras con concentración superior a 100 [millón/ml] según experto.
Concentración espermática K-alpha= 0,92 Casi perfecta concordancia
Concentración espermática < 100 [millones/ml] 76 muestras < 15 [millones/ml] 21 muestras K-alpha= 0,93 Casi perfecta concordancia K-alpha= 0,95 Casi perfecta concordancia
Motilidad Progresiva 58
Motilidad Progresiva Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 7 pacientes oligo severos
% CEDAI Motilidad Progresiva 100 75 Coef. Spearman: 0.849 y = 1,1496x - 5,9546 R² = 0,7203 K-alpha= 0,78 Fuerte concordancia 50 25 0 0 25 50 75 100 % Experto
Motilidad Progresiva <32% 32% K-alpha= 0,9 Casi perfecta concordancia K-alpha= 0,68 Fuerte concordancia % %
Conclusión Concentración espermática - Existe una alta correlación y concordancia casi perfecta entre el análisis del experto y CEDAI. Motilidad - Existe una fuerte concordancia entre el análisis del experto y CEDAI tanto en motilidad progresiva 32% como <32%.
Vitalidad espermática 64
Vitalidad espermática Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 9 pacientes fueron oligozoospermicos severo o azoospermicos, a los cuales no se les realizó análisis digital.
Vitalidad espermática K-alpha= 0,38 Aceptable concordancia
Vitalidad espermática Grafica Bland-Altman Promedio Promedio Diferencia: 3.05 Desviación Estándar : 9.25 = 82% = 79%
Conclusión Vitalidad - No es posible realizar un análisis de correlación, debido a la distribución de los datos. - Concordancia aceptable entre Experto y CEDAI - Solo 2 pacientes bajo el criterio OMS 2010 (58% según Experto). - Diferencia Promedio entre expertos y CEDAI es de 3.04.
Conclusión Vitalidad - Dificultad en el análisis de vitalidad en pacientes oligozoospermicos (< 15mill/ml), especialmente en casos severos (<5mill/ml). - 9 muestras no pudieron ser procesadas por bajo recuento - Se requiere ampliar el estudio, en el cual la vitalidad se distribuya en un amplio rango (Bajo y sobre 58%)
Fragmentación del ADN espermático 88 muestras totales
Fragmentación del ADN espermático Obtención de muestras 88 muestras entraron al estudio. Halo Sperm Kit
Fragmentación del ADN espermático K-alpha= 0,64 Fuerte concordancia
Fragmentación del ADN espermático Grafica Bland-Altman Promedio Diferencia Promedio: -2.98851 Desviación Estándar : 4.34954 = 14% = 17%
Conclusión Fragmentación - Existe una fuerte concordancia entre análisis por CEDAI y Expertos. - Diferencias entre en expertos y CEDAI es de -2.98,y una SD de 4.34
Resumen conclusiones estudio Concordancia entre el análisis del experto y CEDAI: o Concentración espermática: casi perfecta o Motilidad: casi perfecta <32%, y fuerte 32% o Vitalidad: aceptable o Fragmentación del ADN espermático: Fuerte concordancia Concentración Casi perfecta Motilidad Casi perfecta 32% Fuerte > 32% Vitalidad Fragmentation del ADN Aceptable Fuerte concordancia
Conclusiones A [100 millón/ml] CEDAI tendría una mayor precision debido a que cuantifica un mayor número de eventos, por lo tanto, el error es más bajo (SD/ n). Sería de gran utilidad optimizar el sistema con diferentes cámaras de recuento, ya que existen diferencias en recomendación (WHO) y características entre ellas (2X-CEL, Cell- VU) La toma de imágenes es un proceso más rápido para parámetros de concentración, motilidad y fragmentación ADN. La captura correcta de imágenes es fundamental para la obtención de resultados apropiados. Se necesita una persona capacitada para tomar imágenes y análisis seminal Los algoritmos para morfología se encuentran optimización (Chang., et al 2014, 2015).
Equipo Alejandra García MSc Tecnólogo Médico MSc en Reproducción Dip. Admistración Empresas Gerente General Fabrizzio Horta MSc Tecnólogo Médico MSc en Embriología Clínica y Andrología Asesor científico Susana Vargas MSc Andrea Rodriguez MSc Bióloga M.Cs en Reproducción Humana Validación Clínica Marcia Madariaga Tecnólogo Médico 20 años de experiencia en Andrología Victor Castañeda PhD Ingeniero Eléctrico. Subdirección Sistema Informática Responsable Red Alta Velocidad Tecnólogo Médico MSc en Biofísica Médica Espermiograma convencional Procesamiento de imágenes y algoritmos Steffen Härtel PhD Biofísico Investigador FONDECYT/MILENIO/FONDEF Director CIMyT Asesor I&D
Muchas» Gracias @ todos