Universidad de Costa Rica Escuela de Biología Cultivo in vitro de tejidos vegetales Andrés Gatica Arias, M.Sc. andres.gatica@ucr.ac.cr 2511-8656
Contenidos Introducción al curso Cultivo de tejidos y sus aplicaciones Historia del cultivo de tejidos Laboratorio de cultivo de tejidos Medios de cultivo Técnicas de esterilización
Laboratorio de Cultivo de Tejidos Tomado de Roca W.M., Mroginski L.A. (ed). 1993. Cultivo de Tejidos en la Agricultura. CIAT
Área de preparación
Área de lavado y esterilización
Cuarto de transferencia
Cámara de flujo laminar Chawla H.S. 2003. Plant Biotechnology: A practical approach.
Cuarto de crecimiento
Área de observación
Invernadero
Equipo básico de laboratorio
Control de la contaminación microbiana
Control de la contaminación microbiana Tomado de Aguilar F. 2000.
Fuentes de la contaminación microbiana
Fuentes de la contaminación microbiana Tomado de Aguilar F. 2000.
Fuentes de la contaminación microbiana Tomado de Aguilar F. 2000.
Tomado de Aguilar F. 2000. Fuentes de la contaminación microbiana
Loyola-Vargas y Vásquez-Flota. 2005. Plant Cell Culture Protocols. Vol 318.
Tomado de Aguilar F. 2000.
Tomado de Aguilar F. 2000.
Tomado de Aguilar F. 2000.
Tomado de Aguilar F. 2000.
Esterilización Proceso por el cual cualquier material vegetal, superficie o sitio se libera de cualquier microorganismo vivo o espora. Asepsia. Cultivo axénico: cultivo que se encuentra libre de virus, hongos y bacterias.
Preparación del explante Tratamiento de la planta donadora. Desinfección superficial del explante. Desinfectantes: Etanol al 70 % v/v Hipoclorito de sodio Hipoclorito de calcio Cloruro de mercurio Antibióticos y fungicidas. PPM (Plant Preservative Mixture)
Control microbiológico químico Chawla H.S. 2003. Plant Biotechnology: A practical approach.
Tomado de Aguilar F. 2000.
Control microbiológico químico Jiménez et al. 2006. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 86: 389 395
Control microbiológico físico Llama directa del mechero Calor seco Estufa a 160-180 ºC por 2-3 horas. Instrumentos y cristalería. Calor húmedo 15 min a 100 ºC. No destruye las esporas.
Control microbiológico químico Vapor bajo presión (autoclave) 15 lb por 20 min a 121 ºC. Tamaño y cantidad del recipiente, volumen del medio. Cambio de ph y degradación de compuestos. Filtración Filtros milipore (0.22 um) estériles. Líquidos sensibles al calor (termolábiles).
Control microbiológico químico Radiaciones ultravioleta 200-300 nm. Provocan la ruptura del ADN causando mutaciones. Control de microorganismos del 50 al 90 %. Superficies, agua y aire. Queman la piel (CUIDADO).
Esterilización
Loyola-Vargas y Vásquez-Flota. 2005. Plant Cell Culture Protocols. Vol 318.
Recomendaciones Limpiar la cámara de flujo laminar con alcohol de 70%. Desinfectar la parte externa de los recipientes y cualquier material que ingrese a la cámara. Desinfectar las manos y antebrazos con con alcohol de 70%. Flamear instrumentos metálicos con alcohol de 95%. Trabajar en la parte interna de la cámara de flujo laminar. No hablar en la cámara de flujo laminar.
Loyola-Vargas y Vásquez-Flota. 2005. Plant Cell Culture Protocols. Vol 318.
Componentes del medio de Nitrógeno cultivo Sales de nitrato (25-40mM) o amonio (2-20 mm). Parte de los aa, proteínas y ácidos nucleicos. Potasio (2-26 mm) Sales de nitrato (25-40mM) o cloruro. Regulación osmótica en la célula. Activación de muchas enzimas.
Componentes del medio de cultivo Calcio (1-3 mm) Componente de la pared y membrana celular, balance catión- anión. Fósforo (1-3 mm) Forma parte de las moléculas de ADN, ARN y ATP. Fosfolípidos.
Componentes del medio de cultivo Magnesio (1-3 mm) Componente de enzimas, fotosíntesis, participa en la síntesis de ATP. Azufre (1-3 mm) Forma parte de aa, proteínas y enzimas. Sulfolípidos y polisacáridos.
Componentes del medio de cultivo Boro En la síntesis y estabilidad de la pared y mebrana celular. Cloro Osmoregulación. Fotosíntesis II. Apertura y cierre de estomas.
Componentes del medio de cultivo Cobre Participa en la fotosíntesis. Forma parte de complejos enzimáticos. Cobalto Fijación de nitrógeno.
Componentes del medio de cultivo Manganeso Participa en la Reacción de Hill en la fotosíntesis II. Forma parte de las metaloproteínas. Molibdeno Cofactor en muchas enzimas. Reducción de N 2
Componentes del medio de cultivo Zinc Participa en la síntesis de proteínas. Forma parte de muchas enzimas. Hierro Se adiciona como un quelato (EDTA) de tal manera que esta disponible a ph 8.0. Formación de proteínas: heme proteínas y proteínas azufre/hierro.
Fuentes de carbono Tomado de George et al. 2007.
Reguladores de crecimiento
Citocininas Naturales Tomado de George et al. 2007. Sintéticas
Citocininas Tomado de George et al. 2007. Fenilureas
Auxinas Naturales Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Tomado de George et al. 2007.
Agentes gelificantes Agar (derivado de un alga): 6-10 gl -1. Alginato, Gelrite (requiere Ca y Mg), Phytagel. Absorben y retienen agua y nutrientes.
Tomado de George et al. 2007.
ph del medio Tomado de George et al. 2007.
ph del medio Tomado de George et al. 2007.
Preparación medio de cultivo
Historia del cultivo de tejidos Cuadros resumen