Instrucciones de Uso TIMP-1 ELISA Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación de inhibidores tisulares de metalloproteinasa-1 (TIMP-1) en plasma humanos. RE54081 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com
1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático de diagnóstico in-vitro para la determinación de inhibidores tisulares de metalloproteinasa-1 (TIMP-1) en plasma humanos. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La degradación proteolítica de la matriz extracelular (MEC) parece desempeñar una función importante en muchos procesos psicológicos y fisiopatológicos. Uno de los factores clave de estos procesos son las metaloproteinasas de matriz (MPM) y sus inhibidores endógenos. Se ha demostrado en varios estudios que las metaloproteinasas de matriz (MPM) participan en el desarrollo de diversos tumores, como el cáncer colorrectal, gástrico, pulmonar y de mama. La actividad proteolítica en el tejido está regulada, entre otros, por los inhibidores endógenos de las proteasas. Los inhibidores endógenos de las MPM más importantes son los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP). El TIMP-1 es una proteína N glicosilada. Tiene un peso molecular de 28 kda y consta de 184 aminoácidos. El TIMP-1 desempeña un papel importante ya que mantiene la homeostasis de la matriz extracelular de los diferentes procesos fisiológicos. Una alteración de su sensible equilibrio dentro de la matriz extracelular resultaría en varios procesos fisiopatológicos como inflamación, enfermedades crónicas degenerativas, invasión tumoral, metástasis y angiogénesis. Además de estas actividades inhibidoras de las MPM se conocen también funciones de los TIMP no dependientes de las MPM. Se describen para los procesos antiapoptóticos, para estimular la proliferación celular además de tener un papel en la angiogénesis que tiene como resultado el crecimiento tumoral y la transformación maligna. En estos casos el TIMP-1 se estableció como marcador pronóstico negativo en diferentes tipos de cáncer. Actualmente, el TIMP-1 constituye el núcleo de la investigación para el diagnóstico del cáncer. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Análisis de inmunoabsorción enzimática (ELISA) de fase sólida basado en el principio del sándwich. Los pocillos están recubiertos con anti-timp-1 anticuerpo policlonal. Estos anticuerpos específicos unen el TIMP-1 presente en la muestra a los pocillos. El analito se detecta mediante un anticuerpo monoclonal murino secundario, conjugado con HRP. La reacción del sustrato se cataliza mediante el conjugado de enzima del sistema de detección.. La intensidad del color desarrollado por la reacción del sustrato es proporcional a la cantidad de TIMP-1 detectados. La cuantificación se logra por comparación de la actividad enzimática de la muestra desconocida con una curva de respuesta preparada con estándares conocidos. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u Version 2014-09 1 / 5
otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS ATENCION: No utilice suero. El TIMP-1se libera mediante los granulocitos α de forma incontrolada durante la preparación del suero. TIMP-1 tiene que ser medido en plasma. Plasma (EDTA) Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C (Alícuotas) Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Estabilidad: 48 horas 6 meses Evite congelar y descongelar repetidamente. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 0.1 ml ENZCONJ CONC 6 x 0.5 ml CAL A-F 2 x 0.5 ml CONTROL 1+2 1 x 12 ml ASSAYBUF CONC 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Placa de Microtitulación Tiras separables. Recubierto con anti-timp-1 anticuerpos (oveja). Conjugado Enzimático Concentrado (101x) Contenido: anti-timp-1 anticuerpos conjugado con HRP, estabilizadores. Estándar A-F 0; 10.2; 51; 102; 204; 510 ng/ml Listo para usar. Contenido: TIMP-1, estabilizadores. Control 1 + 2 Listo para usar. Contenido: TIMP-1, estabilizadores. Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas. Buffer de Ensayo Concentrado (20x) Contenido: Solución buffer fosfatada, ASB y ProClin 300 Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores. Solución de Parada TMB Listo para usar. 0.5 M H 2SO 4. 3 x FOIL Folio Adhesivo 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 5; 20; 50; 100; 1000 µl 2. Tubos de vidrio desechables (12 x 75 mm) 3. Vortex 4. Micropipeta de 8 canales con depósito para reactivos 5. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia 600-650 nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro Version 2014-09 2 / 5
9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Algunos componentes contienen 250 µl de solución. Asegúrese de que toda la solución esté en el fondo del vial antes de abrirlo. 5. Se recomienda ensayar estándares, controles y muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 6. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 7. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 8. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 9. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del juego de reactivos para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos independientes. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones). 10.1. Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 10 ml WASHBUF CONC 90 ml agua bidest. 1:10 Mezclar bien. 2-8 C 4 semanas 1 ml ASSAYBUF CONC 19 ml agua bidest. 1:20 Mezclar bien. 2-8 C 1 semana 20 µl ENZCONJ CONC 2 ml ASSAYBUF diluído 1:101 Mezcle sin formar espuma. Prepare freshly and use only once. 10.2. Dilución de Muestras Muestra de paciente para ser diluído con Relación Notas Plasma (EDTA) generalmente ASSAYBUF diluído 1:51 p.e. 10 µl + 500 µl Version 2014-09 3 / 5
11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 50 µl de Estándar, Control y muestra diluida en cada pozo respectivo de la placa de microtitulación. 2. Pipetee 50 µl de Conjugado Enzimático diluida en cada pozo. Cubra la placa con un folio adhesivo. Sacuda cuidadosamente la placa. 3. Incubar 90 min a TA (18-25 C). 4. Remueva el folio adhesive. Descarte la solución de incubación. Lave la placa 5 x con 250 µl de Buffer de Lavado diluido. Remueva totalmente el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 5. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TBM en cada pozo. 6. Incubar 30 min a TA (18-25 C). 7. Detenga la reacción del sustrato, añadiendo 100 µl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Agitar brevemente. El color cambia de azul a amarillo. 8. Mida la densidad óptica con fotometro a 450 nm (longitud de onda referencial: 600-650 nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar TIMP-1 (ng/ml) DOMedio DO/DO max A 0 0.014 0.5 B 10.2 0.087 3.5 C 51 0.337 13.6 D 102 0.754 30.6 E 204 1.384 56.1 F 510 2.467 100 (OD) 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 TIMP-1 ELISA 0.1 1.0 10.0 100.0 1000.0 (ng/ml) Version 2014-09 4 / 5
14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan TIMP-1 valores inferior a 100 ng/ml en EDTA Plasma. (95% percentile: 100 ng/ml; 90% percentile: 80 ng/ml). Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas: Conc. Hemoglobina 5 mg/ml Bilirrubina 5 mg/ml Triglicéridos 91 mg/ml 16. PRUEBAS FUNCIONALES Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) 1 ng/ml Señal media (Estándar-Cero) + 2DS Sensibilidad Funcional 5 ng/ml Medio Concentracion < 20% CV Precisión Intervalo CV (ng/ml) Intra-Ensayo 60 191 2.5 2.7 Inter-Ensayo 64 233 7.0 10.5 Inter-Lote Ensayo 61 223 6.1 9.5 Linearidad Intervalo (ng/ml) Dilución en Serie hasta Intervalo 4 528 1:16 93-104 Recuperación Medio Intervalo % Recuperación después del enriquecimiento 92 89-96 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Birgisson H., Nielsen H., Christensen IJ., Glimelius B., Brünner N., Preoperative plasma TIMP-1 is an independent prognostic indicator in patients with primary colorectal cancer: A prospective validation stidy. Eur J Cancer (2010); 46: 3323-3331. 2. Soerensen NM., Byström P., Christensen IJ., Berglund A., Nielsen HJ., Brünner N., Glimelius B., TIMP- 1 is significantly associated with objective response and survival in metastatic colorectal cancer patients receiving combination of irinotecan, 5-fluorouracil, and folinic acid. Clin Cancer Res (2007); 13(14) July 15 4117-4122. 3. Holten-Andersen MN., Nielsen HJ., Soerensen S., Jensen V., Brünner N., Christensen IJ., Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in the postoperative monitoring of colorectal cancer. Eur J Cancer (2006); 42: 1889-1896. 4. Holten-Andersen M., Christensen I.J., Nilbert M., Bendahl P.O., Nielsen H.J., Brünner N., Fernebro E. Association between preoperative plasma levels of tissue inhibitor of metalloproteinases 1 and rectal cancer patient surviaval: a validation study. Eur J Cancer (2004) 540; 64-72. 5. Holten-Andersen MN., Stephens R.W. Nielsen H.J. High preoperative plasma tissue inhibitor of metalloproteinase-1 levels are associated with short survival of patients with colorectal cancer. Clinical Cancer Research (2000); 6: 4292-4299. Version 2014-09 5 / 5
Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20