DIAGNÓSTICO DE LA PRESENCIA DE GEMINIVIRUS EN ECUADOR APLICANDO TÉCNICAS MOLECULARES Ibarra M. (1), Campuzano A.,Espinoza L. & Peralta E. Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador, Escuela Superior Politécnica del Litoral, Campus Gustavo Galindo, Km. 30.5 vía Perimetral, Apartado 09-01-5863. Guayaquil, Ecuador. maibarra@espol.edu.ec (1) Resumen: Los Geminiviridae están constituidos por cuatro géneros, siendo los Begomovirus el de mayor propagación por ser transmitido por su vector principal, la mosca blanca (Bemisia tabaci). Esta familia ocasiona enormes daños y pérdidas en cultivos (frijol, tomate, melón, tabaco, calabaza, pimiento, entre otros) de las regiones tropicales y subtropicales, que se estiman entre 40 y 100% de la producción. Para este trabajo se recolectaron 64 muestras de plantas de tomate (Solanum lycopersicum) y maleza con síntomas relacionados con geminivirus con síntomas foliares de amarillamiento, clorosis, arrugamiento y deformación en sus hojas. Se realizó la extracción de ADN total y se procedió a comprobar la presencia de la región más conservada (L1 ó rep) mediante el uso de PCR empleando cebadores degenerados. En el 44% de las muestras de tomate y el 83% de las muestras de malezas se obtuvieron resultados positivos, con amplicones de aproximadamente 1250bp y de 700 bp. Los resultados expuestos constituyen los primeros en demostrar la presencia en Ecuador de geminivirus afectando los cultivos de tomate y malezas acompañantes, e incluyen evidencias sobre la posible presencia de diferentes especies virales en las muestras analizadas. Introducción: Los Geminiviridae se caracterizan por presentar un genoma de ADN circular de simple cadena [12, 14], al cual pertenecen cuatro géneros: Begomovirus, Curtovirus, Mastrevirus y Topocuvirus [2, 13]. Esta familia de virus ha causado problemas en diferentes cultivos en más de 20 países de América y demás zonas tropicales y subtropicales del resto del mundo [13] Los Begomovirus, son el género más estudiado debido a los daños que ocasionan en cultivos de importancia comercial desde el año 1986, [7, 8] convirtiéndose en un problema emergente por su gran capacidad de mutación y recombinación genética [2, 14]. La presencia de altas poblaciones de mosca blanca (B. tabaci), su vector, permite la rápida dispersión y recombinación de estos virus [1], este organismo cuenta con un amplio rango de hospederos, gran capacidad de proliferación y resistencia a varios tipos de insecticidas [6, 9].
Los geminivirus en general pueden llegar a ocasionar pérdidas que varían entre el 40 y el 100% de la producción [6], afectando al menos 17 cultivos, entre ellos se encuentran: fréjol, tomate, algodón, soya, melón, tabaco, calabaza, pimiento entre otros. [14]. En el Ecuador aún no existen resultados que demuestren la presencia de esta familia viral. Valarezo [11] establece la presencia de la mosca blanca (B. tabaci) en la zona costera de las provincias de Manabí, Santa Elena, Guayas, Los Ríos y parte de la sierra ecuatoriana, pero se plantea la continua investigación en relación sobre la presencia del complejo mosca blanca (B. tabaci) Begomovirus. Los síntomas en campo asociados con la infección de geminivirus pueden expresarse como: mosaico amarillo brillante, enrollamientos, reducción del área foliar, enanismo, epinastia, maduración prematura de los frutos, moteado clorótico y clorosis foliar interna o de los márgenes [3, 5], sin embargo estos síntomas también pueden ser producidos por otras especies virales siendo una limitante para su diagnóstico directo, siendo lo más recomendable utilizar mecanismos más específicos y sensibles para un diagnóstico efectivo de los geminivirus [4]. Con estos antecedentes, el objetivo de esta investigación fue realizar un diagnóstico preliminar sobre la presencia de geminivirus, en plantaciones comerciales de la costa ecuatoriana mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Materiales y métodos: Para la ejecución de este estudio se realizaron muestreos dirigidos en plantaciones comerciales de tomate (S. lycopersicum) en las localidades de Chanduy, El Azúcar y San Rafael pertenecientes a la provincia de Santa Elena. Se recolectó un total de 64 muestras de tejido vegetal, además se tomó en cuenta la presencia de altas poblaciones de mosca blanca (B.tabaci). En total se evaluaron 58 muestras de tomate de la variedad Dominique, con síntomas foliares de amarillamiento, clorosis y moteado; por otra parte se estudió seis malezas presentes en las plantaciones identificadas como Luffaspp e Ipomoeaspp que presentaron sintomatologías similares a las observadas en el cultivo principal. Se realizó la extracción de ADN total de cada muestra y mediante el uso de PCR empleando los cebadores degenerados (PAL1v1978 / PCRc1) y la metodología descrita previamente por Rojas
[10] se procedió a comprobar la presencia del gen de la proteína de la replicación viral (L1 ó Rep) presente en el componente A de los Geminiviridae. Resultados y Discusión: Las concentraciones de ADN de las muestras fueron evaluadas mediante espectrofotometría empleando el NANODROP (Thermo Scientific NanoDrop 2000) y por observación en gel de agarosa al 1.2% (Figura 1), los rangos oscilaron entre 32 y 1160 ug/ul. Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1,2% de la presencia de ADN total de las muestras evaluadas: M= marcador 1Kb de promega, B=blanco, T1 y T2= ADN de tomate; M1, M2 y M3= ADN de maleza Figura 2.- Electroforesis en gel de agarosa al 1.8% de la amplificación de PCR con primers degenerados PAL1v1978 / PCRc1 (M= marcador de 100 bp de invitrogen, B=blanco de PCR, C= control negativo de PCR, 14= control positivo para geminivirus en PCR el resto de las muestras corresponde a tomate(s. lycopersicum) mostrando infección. De las 57 muestras de tomate (S. lycopersicum) el 44% mostraron infección viral para geminivirus, mientras que en maleza de las 6 muestras recolectadas en campo, el 83% fueron positivas. Los producto de PCR presentaron una banda de aproximadamente 1250bp y de 700 bp. Las muestras presentes en la Figura 2 corresponden a muestras de tomate (S. lycopersicum), de las cuales las muestras 1, 2, 4 13, 16 presentaron un producto de 1250 bp y las muestra 7 y 13 presentaron una banda de 700 bp, la presencia de dos bandas en la muestra 13 hace suponer que en esta muestra podría existir alguna mezcla viral, esta hipótesis la comprobaremos en futuras investigaciones.
Uno de los mayores problemas encontrados, fue la estandarización del protocolo PCR para geminivirus, establecer la temperatura ideal y tiempos para que los cebadores degenerados sean lo más específicos posibles para determinar la presencia de esta familia viral. Los resultados expuestos demuestran de manera preliminar la presencia en Ecuador de geminivirus, aunque no de las especies predominantes, que se encuentran afectando los cultivos de tomate y malezas acompañantes, este trabajo es el inicio de una investigación que intenta caracterizar las diferentes especies de geminivirus existentes en el país mediante la aplicación de primers específicos de géneros y especies, ACR, clonación y secuenciación. Conclusiones: Con este estudio se demostró por primera vez la presencia de geminivirus en los cultivos de tomate y malezas en las haciendas aledañas a Santa Elena-Ecuador. Mediante electroforesis se obtuvo en muestras de tomate un 44% y malezas un 83% de muestras positivas de las muestras analizadas, con un producto de PCR de aproximadamente 700 bp y 1250 bp. Los síntomas más frecuentes hallados en las muestras de maleza fueron: deformación y arrugamiento, mientras que en las muestras de tomate: amarillamiento, deformación y enanismo. Bibliografía 1. Ambrozevicius, L.P., Calegario, R.F., Fontes, E.P.B., Carvalho, M.G. &Zerbini, F.M. Genetic diversity of begomovirus infecting tomato and associated weeds in southeastern Brazil. Fitopatologia Brasileira 27:372-377. 2002 2. Bian, X.Y., Thomas, M. R., Rasheed, M. S., Saeed, M., Hanson, P., DeBarro, P. J., and Rezaian, M. A. A recessive allele (tgr-1) conditioning tomato resistance to geminivirus infection is associated with impaired viral movement. Phytopathology 97:930-937.2007. 3. Cervantes, L; Zavaleta, E. Rojas, R. Detección de geminivirusasociados a laalstroemeria (alstroemeria l.) Envilla Guerrero-México. Revista Averciencia 34(12). 2009. 4. Czosnek, H. Characterization and management of tomato and pepper geminiviruses. Submitted to the Office Agriculture &Food Security U.S. Agency for International Development.P 3-6. 2002. 5. Faría, A; Nava, A. Detección por PCR de begomovirus en el cultivo de tomate en las áreas productoras de tomate en los andes venezolanos. Revista de la Facultad de Agronomía Luz (Maracaibo-Venezuela). 26: 179-195.2007.
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