Factores de fertilidad que limitan el incremento de variación genética en poblaciones mutantes de calabacín N. Vicente-Dolera 1, V. Pinillos 2, M. Moya 1, F. Rubira 1, D. Martínez 1, M. Del Río- Celestino 1, B. Román 3 y P. Gómez 1 1 IFAPA Centro La Mojonera. Camino de San Nicolás, 1, 04745 La Mojonera, Almería 2 Universidad de Almería. Departamento de Producción Vegetal. Carretera de Sacramento s/n. 04120 La Cañada, Almería 3 IFAPA Centro Alameda del Obispo. Avd. Menéndez Pidal s/n, 14004 Córdoba Palabras clave: Cucurbita pepo, mutagénesis, cuajado de fruto, viabilidad del polen. Resumen Las colecciones de mutantes inducidos químicamente suponen un recurso esencial en especies cultivadas para la obtención de nueva variabilidad y la mejora genética, además de pasar a ser la principal vía de estudios de genética reversa gracias al desarrollo de la técnica TILLING. Estas poblaciones presentan mas variaciones genéticas cuanto mayor sea la acumulación de mutaciones por línea que se generen, puesto que el aumento del número de mutaciones confiere un mayor número de series alélicas por gen. Pero esto disminuye al mismo tiempo la fertilidad de las plantas y compromete la sucesión generacional de la población. En este trabajo se evalúa, en las poblaciones mutantes de calabacín del centro IFAPA de Almería, si la estimación de la viabilidad de las flores masculinas puede servir para determinar con precisión y antelación la fertilidad de plantas mutantes comparándolos con los métodos habituales, con la intención de conocer antes la fertilidad de la población mutante. Para ello en primer lugar se han agrupado los distintos tipos de plantas de la población en 3 categorías en términos de producción de fruto viable. La baja cantidad de malformaciones florales, que habitualmente se usa como indicador de la acumulación de mutaciones en la población, no explican la alta proporción de plantas sin semillas en una población tratada con 1% de EMS. Por ello se ha analizado la viabilidad de polen de las plantas de cada uno de los 3 grupos establecidos ya que es uno de los factores esenciales que definen la fertilidad de las plantas. Las plantas mutantes de calabacín han presentado una importante disminución de la fertilidad masculina respecto a las plantas control, pero los valores de viabilidad de polen presentan un amplio rango de valores: de los tres grupos de plantas establecidos en función de la producción de fruto, la mayoría de las plantas que producen semillas presentan una viabilidad de polen superior al 45%, mientras que las que no tienen fruto tienen una mayor proporción de plantas con menor viabilidad. En este último grupo además se ha estudiado si la polinización cruzada con polen viable de plantas sin tratar podía producir fruto, y el resultado ha sido plantas con fruto en un tercio de la muestra utilizada. Todos estos resultados indican que, aunque el efecto de la mutagénesis ocurre sobre muchos procesos de la fertilidad de la planta, el análisis de la viabilidad del polen puede ser utilizado como un índice más preciso y precoz que el habitual análisis de mutaciones morfológicas para determinar la viabilidad de una población mutante en desarrollo. 49
ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60 INTRODUCCIÓN El calabacín es un cultivo cuya producción y comercialización está en clara expansión. Durante los últimos 10 años ha supuesto el cultivo de mayor incremento en la producción hortícola nacional pues ha aumentado su producción por encima del 40% hasta las 203 mil toneladas en 2009 (MARM, 2010) dedicándose mas del 56% de las mismas a la exportación. Sin embargo, con esta elevada repercusión en la producción, no presenta el mismo esfuerzo en desarrollo varietal que otras especies como tomate y pimiento. Las poblaciones mutantes inducidas químicamente han sido extensamente utilizadas en el último siglo como fuentes de nueva variación genética para el desarrollo de variedades vegetales. La importancia de obtener fuentes de variación genética en un tiempo corto se ha multiplicado tras el desarrollo de métodos de selección de materiales dentro de grandes poblaciones con mutaciones inducidas, como es el TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) (Henikoff et al, ). Pero la viabilidad de las poblaciones mutantes como fuentes de nuevos materiales para mejora está limitada por la fertilidad de las plantas que la componen, y se ve reducida cuando se incrementan las mutaciones en la población (Martín et al., 2009). Además suponen una limitación considerable en poblaciones cultivadas como calabacín que necesitan meses y grandes superficies para establecer una población de mutantes. Debido a que la reducción de fertilidad es bastante acusada en poblaciones mutantes de cucurbitáceas, y en concreto en calabacín, hemos estudiado en poblaciones mutantes de calabacín la fertilidad de la flor masculina por medio de la viabilidad del polen, lo cual nos ha permitido comprobar que el análisis de este carácter determinante de la fertilidad floral permite un análisis temprano de la viabilidad de la población mutante que se quiere establecer, puesto que el análisis tradicional no permite conocer la misma hasta el final del ciclo de la planta. MATERIALES Y MÉTODOS Semillas del cultivar de calabacín MU-CU16 fueron tratadas para inducir mutaciones con EMS (Etil Metano Sulfonato) en una concentración del 1% durante 16 horas en agitación continua, tras lo cual fueron lavadas y sembradas en semillero. Los cultivos que se han llevado a cabo han sido dos: El primero en el año 2010 y el segundo a principios de 2011. Aproximadamente el 50% de las semillas fueron viables, y estas plantas M1 fueron transplantadas al invernadero para llevar a cabo un programa diario de autopolinizaciones y generar el primer banco de semillas M2. Para estudiar la fertilidad de las plantas se determinó la viabilidad del polen y el cuajado de frutos y semillas, estableciendo 3 bloques de plantas dispuestas al azar. La viabilidad del polen se estimó con el test de la reacción fluorocromática (FCR test; Heslop-Harrison y Heslop Harrison, 1970). Las flores fueron recolectadas a primera hora de la mañana y se mantuvieron en una cámara húmeda durante un mínimo de 2 horas para rehidratar el polen. Posteriormente, una pequeña cantidad de este se dispersó en una gota de diacetato de fluoresceína 0,01% en sacarosa 0,5 M, observándose después en un microscopio de fluorescencia (Olympus BX40F4). Los granos de polen fluorescentes se consideraron viables. La viabilidad se expresó como porcentaje de granos viables, contando al menos 200 granos de polen por muestra. También se determinó la fertilidad femenina en plantas que no producían fruto por autofecundación, valorando el cuajado de frutos y la formación de semillas tras realizar polinizaciones cruzadas con polen viable procedente de plantas control. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La primera población, de aproximadamente 3000 individuos mutantes de calabacín, presentó muchos problemas de fertilidad, puesto que mas del 50% de la 50
población M1 de calabacín no desarrolló fruto, y dentro de las que lo desarrollaron aproximadamente otra mitad presentaron deficiencias que les impedía producir semillas. Para comprobar si las mutaciones en el desarrollo de las plantas explicaban la disminución en la fertilidad, se analizaron mutaciones morfológicas que alteraban la capacidad de formar frutos y semillas floración. El mayor número de mutaciones fueron las que afectaban al desarrollo vegetativo, mientras que las que afectaban al desarrollo reproductivo suponían un porcentaje relativamente bajo (Martínez-Valdivieso et al., 2012). Las mutaciones de este último grupo se agruparon en distintas categorías, comenzando por aquellas mutaciones que alteraban el patrón normal de crecimiento de la planta (plantas sin flores o cegadas en el desarrollo temprano), las que modificaban la determinación sexual (solo flores macho o solo flores hembra) y en último lugar las que daban lugar a flores de ambos sexos con órganos defectuosos que pueden afectar su fertilidad (flores macho que no producían polen o flores hembras con estigmas deformados, fig. 1). El porcentaje de flores de cada una de estas categorías era variable (tabla 1) siendo lo más frecuente modificaciones en la morfología normal de los órganos de la flor. Sin embargo el porcentaje total de mutaciones en el desarrollo reproductivo no explicaba la alta proporción de plantas con problemas de fertilidad, pues la mayor parte de la población presentaba flores masculinas y femeninas en apariencia normales, si bien no alcanzaban a formar frutos tras sucesivas polinizaciones. Por tanto, llevamos a cabo un ensayo siguiendo un modelo de tres bloques al azar, para poder analizar como condiciona la viabilidad del polen la fertilidad de la planta. Dentro de cada bloque se identificaron plantas que, tras ser autopolinizadas, no producían fruto, y dentro de las que producían fruto se distinguió las que producían semillas de las que no lo hacían, comparándose todas ellas con plantas control sin tratamientos. La viabilidad del polen en plantas control fue siempre cercana al 100%, siempre superior al 90%, y todas desarrollaron frutos con semillas. Sin embargo, más del 90% de las plantas sin fruto tienen una viabilidad del polen inferior al 45%. En cuanto a las plantas mutantes que produjeron semillas viables, la mayoría presentan una reducción significativa de la viabilidad del polen respecto al control, pero no inferior al 45% de viabilidad (fig. 2). Mas de las 2/3 partes de las plantas con semillas presentaban valores de viabilidad por encima del 45%. Es de notar que las plantas con fruto forman dos grupos más heterogéneos en cuanto a la viabilidad del polen que las plantas sin fruto o el control. En el grupo de plantas sin fruto se propuso valorar que importancia tiene la disminución de la viabilidad del polen provocada por la mutación, aplicando a flores femeninas de este grupo polen de plantas control. Para ello se polinizaron con polen viable de plantas sin mutar, 75 flores de plantas mutantes sin fruto hasta conseguir el cuaje o hasta un máximo de 3 rondas sucesivas. El resultado fue que se consiguieron 53 frutos cuando utilizamos este polen, pero de estos frutos sólo 25 tenían semillas, lo que parece indicar que más del 60% de las plantas que no producen fruto presentan otras deficiencias de fertilidad que impiden la producción de fruto. Todos estos datos apuntan a que la disminución de la fertilidad en poblaciones mutantes de calabacín es resultado no solo de mutaciones directas sobre la floración, sino principalmente a la acumulación de efectos de mutaciones que alteran, directa o indirectamente, la fertilidad de la planta. En otras especies vegetales como Arabidopsis o maíz ya se había comprobado que el aumento del número de mutaciones en el genoma compromete la fertilidad de la población (Martín y col, 2009). En este sentido el análisis de mecanismos tempranos que controlen la fertilidad de una población es imprescindible para determinar las posibilidades de establecer una población mutante, 51
ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60 mas aún en especies como calabacín que precisan cuatro meses a la obtención del fruto para valorar si tiene o no semillas. Con el análisis de la viabilidad del polen podríamos evaluar la viabilidad de la población, y en el futuro evaluar incluso su relación con la carga de mutaciones por línea. Puesto que todas las poblaciones mutantes presentan una reducción en la viabilidad del polen, la fertilidad la podría dar la proporción de plantas con viabilidad superior al 45%, que en el caso de plantas que producen semillas está por encima del 75%. Por otra parte, otros tratamientos como la aplicación de polen viable logra un efecto limitado en la restauración de la fertilidad de las plantas sin fruto. Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado con fondos FEDER y por los proyectos RTA2009-00039 y RTA2011-00044-C02-01. N Vicente-Dolera tienen una beca IFAPA6-2010 Referencias B. Martín, M. Ramiro, J. M. Martínez-Zapater y C. Alonso-Blanco. 2009. A highdensity collection of EMS-induced mutations for TILLING in Landsberg erecta genetic background of Arabidopsis., BMC Plant Biology 9:147. D. Martínez-Valdivieso, P. Gómez, N. Vicente-Dólera, F. Rubira, M. Moya y M. del Río Celestino. 2012. Obtención y caracterización de mutantes morfológicos en calabacín (Cucurbita pepo spp. pepo). En este mismo volumen. J. Heslop-Harrison y Y. Heslop-Harrison. 1970. Evaluation of pollen viability by enzymatically induced fluorescence, intracellular hydrolisis of fluorescein diacetate. Stain Technology, 45:115-120. MARM, 2010. Anuario de Estadística Agraria. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Madrid, España. Tabla 1. Mutaciones en el desarrollo floral observadas en la población de mutantes. TIPIFICACIÓN MUTACIÓN % DE PLANTAS Plantas sin flor 2% Desarrollo general Plantas ciegas 5% PLANTAS SIN FRUTO Determinación Solo flores macho 6,50% sexual Solo flores hembra --- Defectos en la flor Flores macho irregulares 25% Flores hembras irregulares 7,50% 52
! a " b Fig. 1. Diferencias en la morfología de órganos sexuales masculinos (a) y femeninos (b) encontrados en la población mutante de calabacín. El fenotipo normal de cada uno de estos órganos se encuentra a la izquierda de cada una de las imagenes. 516-17,4)*4. &!! %! $! #! "!! '()*+(,-. /+0*(1'().-23,,4 /+0*(1.3).-23,,4.3)1/+0*( *37(16-17,4)*4. Fig. 2. Análisis de la viabilidad del polen en plantas control, sin fruto, con fruto sin semilla y con fruto con semilla de la población mutante de calabacín estudiada. 53