TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 FISIOLOGIA DE LA HEMOSTASIA ESTUDIO DE LOS PROCESOS FISIOLÓGICOS PUESTOS EN JUEGO DURANTE LA HEMOSTASIA PRIMARIA Y SECUNDARIA 1. OBJETIVOS Con los conocimientos adquiridos en la clase teórica: 1. a. OBJETIVOS GENERALES Conocer los mecanismos fisiológicos involucrados en la hemostasia. Comprender el rol de las plaquetas, el endotelio y los factores de coagulación en la regulación del proceso hemostático. 1. b. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Comprender la importancia de la Hemostasia primaria en el mantenimiento de la integridad del organismo. Relacionar la estructura de las plaquetas con su función dentro de los mecanismos hemostáticos. Comprender el concepto de hemostasia Secundaria y su papel en el equilibrio homeostático del organismo. Conocer los Factores de la coagulación, su lugar de síntesis y función. Integrar los procesos involucrados en el mecanismo de la coagulación: formación del coágulo y fibrinólisis. Relacionar la Teoría de la Cascada con los eventos observados in Vitro y los que ocurren in Vivo explicados por el nuevo modelo basado en superficies celulares. 2. CONOCIMIENTOS TEÓRICOS NECESARIOS Hemostasia primaria: Plaquetas. Estructura. Función. Hemostasia Secundaria: Factores de la coagulación. Mecanismo de la coagulación. Teoría de la Cascada. Nuevo Modelo basado en superficies celulares. Fisiología de la Hemostasia 1
3. DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO 3.a. Fundamento El término Hemostasia se refiere al conjunto de interacciones entre los componentes de la sangre y los de la pared vascular, responsables de impedir la fuga de la sangre de dicho compartimiento. El proceso hemostático a menudo es esquematizado en cinco fenómenos consecutivos que pueden superponerse: vasoconstricción localizada, adhesión de las plaquetas al subendotelio, formación del tapón plaquetario, reforzamiento de éste a través del depósito de fibrina y finalmente degradación del material depositado a través de la fibrinólisis. 3.b. Recuento de plaquetas por método manual El recuento plaquetario en sangre entera refleja, en individuos normales, el equilibrio que existe entre la producción en médula ósea y las plaquetas en circulación periférica. Debe trabajarse con material plástico o vidrio siliconado, ya que las plaquetas tienden a adherirse y agregarse sobre cualquier superficie que no tenga calidad de endotelio normal. Los métodos de recuento pueden ser manuales, semiautomáticos y automáticos. Materiales y método: Sangre entera anticoagulada con EDTA disódico o dipotásico al 10% (p/v). Oxalato de amonio 1%. Se guarda en heladera. Conviene preparar y fraccionar en alícuotas. Se filtra en el momento de usar. Micropipetas calibradas o automáticas. Cámara de Neubauer. Cámara Húmeda (Caja de papel con filtro humedecido) Microscopio de contraste de fase o normal. La muestra de sangre venosa anticoagulada con Edta, se homogeiniza y se toma una muestra con micropipeta calibrada o semiautomática, 20 µl en 1,80 ml de solución de Oxalato de amonio 1%. (dil 1/100) Se homogeniza suavemente y se deja reposar 10 minutos para favorecer la hemólisis de los Glóbulos rojos. Se coloca la laminilla de vidrio (cubrecámara) en la cámara para recuento (Fig.1), presionándola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Cuando ha sido montada adecuadamente, entre las dos superficies del vidrio se observan unas bandas de color, llamadas anillos de Newton (Fig. 2). Fisiología de la Hemostasia 2
Pasado los diez minutos, con la micropipeta se carga la cámara por capilaridad para el recuento. Evitar llenarla más allá del área cuadriculada (Fig. 3). Se realiza el recuento en el cuadrante central N 5 (Fig. 4) Fig. 1 Cámara de Neubauer Fig.2 Fig.3 1 2 3 1 mm 4 5 6 1 mm 0,25 mm 7 8 9 1 mm Fig. 4 Cuadricula que muestra los 9 cuadrados primarios El resultado obtenido se multiplica por 1000 ya que la dilución que se realiza es de 1/100 y el volumen contado es 0,1 mm 3. El resultado se expresa por mm 3 Valores de Referencia: 150.000 400.000 /mm 3 3.c. Observación de las plaquetas en el frotis de sangre periférica. La revisión del frotís de sangre periférica, brinda una estimación del recuento de plaquetas y da información de la morfología y disposición de estos elementos. En el frotis de sangre teñido con May Grunwald Giemsa las plaquetas aparecen de color celeste a incoloro con gránulos de color rojo o púrpura, su tamaño es de 2 a 4 µm y su forma redondeada. Fisiología de la Hemostasia 3
Sí el recuento de plaquetas es normal, se deberían observar aproximadamente entre 8 a 15 plaquetas (individualmente o en pequeños grupos) en cada campo con objetivo de 100X (Fig. 5). Un método tradicional para estimar el número de plaquetas por mm3 de sangre, es contar las plaquetas en 10 campos de 200 glóbulos rojos, hacer el promedio y multiplicar por 20.000. En los extendidos de sangre preparados inadecuadamente, las plaquetas pueden formar grandes agregados en algunas áreas y aparecen disminuidas o ausentes en otras. Los agregados también se pueden presentar cuando la técnica de venopunción es dificultosa y las plaquetas se activan antes de entrar en contacto con el anticoagulante. En algunas circunstancias el EDTA puede producir la agregación plaquetaria o al satelitismo plaquetario (adherencia de las plaquetas al neutrófilo) que también conducen a inexactitudes del recuento. Fig. 5 3.d. Tiempo de Sangría Cuando se produce una injuria tisular quedan expuestos los componentes del subendotelio (fundamentalmente colágeno tipo IV y V) donde las plaquetas se adhieren y luego se agregan. El tiempo de sangría (TS) se basa en esta propiedad y mide el tiempo que tarda en cohibirse la salida de sangre provocada por una incisión estandarizada realizada en los vasos superficiales pequeños. Es una prueba global de la hemostasia primaria. Está influenciada por factores técnicos que se deben estandarizar cuidadosamente: profundidad, ubicación y dirección de la incisión; también depende del tipo de piel del paciente y de la habilidad del operador. El TS depende fundamentalmente de la calidad y cantidad plaquetaria. Se puede realizar por varias técnicas. Nosotros en el Trabajo Práctico realizaremos el Ts según la técnica de Ivy. Fisiología de la Hemostasia 4
Material y Métodos: Esfingomanómetro Lancetas descartables. Cronómetro Papel de filtro Procedimiento Se realiza una incisión con lanceta en el antebrazo donde se ha colocado un esfingomanómetro a una presión constante (40 mm de Hg) para llenar los capilares en forma homogénea y eliminar la variabilidad del tono capilar. Se elige una zona donde no haya vasos capilares visibles y esté libre de vellos. Se efectúa en el antebrazo 3 incisiones con lanceta descartable (profundidad 1mm) (Fig. 6) Se pone en marcha el cronómetro y cada 30 seg. Con papel de filtro, se absorben las gotas de sangre formadas sin tocar las heridas para no remover el coágulo en formación, hasta que cese de fluir la sangre. Fig. 6 Valor de Referencia: 3 5 minutos 3.e. Tiempo de coagulación ( Método de Lee- White modificada) El tiempo de coagulación (TC) es el tiempo que tarda en generarse la trombina in vitro para formar el coágulo, como resultado de la interacción de los factores involucrados contenidos en la sangre. Un TC normal no descarta la existencia de una alteración en el sistema de coagulación, pero si es prolongado indica la existencia de un defecto severo, debido a que esta técnica tiene baja sensibilidad para detectar alteraciones de la función hemostática. Fisiología de la Hemostasia 5
Materiales y método: Sangre entera sin anticoagulante Tubos de hemólisis de vidrios Baño termostático a 37º C Cronómetro Colocar en un baño a 37ºC tres tubos de hemólisis. Realizar una punción venosa en la forma habitual (ver TP Nº 1). Extraer aproximadamente 3 ml de sangre y verter por las paredes 1ml en cada tubo (Fig. 7) Activar el cronómetro. A los 7 minutos retirar uno de los tubos del baño termostático, inclinarlo ligeramente e investigar el deslizamiento de la sangre por la pared. Repetir la operación cada 30 segundos hasta que no se observe deslizamiento (formación del coágulo). Inmediatamente comenzar a inclinar el tubo 2 hasta que no se observe deslizamiento. A partir de ese momento comenzar a mirar el tercer tubo. 1 2 3 Fig. 7 Valor de referencia: menor de 15 minutos 3.f. Tiempo de Protrombina en una etapa Muestra: el anticoagulante que se utiliza es citrato de sodio en una relación 1+9 ó dilución 1/10, entonces por ejemplo para 250 ul de anticoagulante se necesita 2,5 ml de sangre. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min y separar el plasma en otro tubo de plástico, proceder a realizar una segunda centrifugación a 3000 rpm por 15 min, de esta manera se obtiene un plasma pobre en plaquetas. Es necesario que no haya plaquetas porque estas ya se estudian en las pruebas que evalúan la hemostasia primaria, ahora sólo se van a estudiar los factores de la coagulación. El plasma además de no contener plaquetas no tiene calcio por que el citrato de sodio compleja el calcio. Fisiología de la Hemostasia 6
El plasma se debe procesar dentro de las 4 horas después de obtener la muestra porque muchos factores se degradan in vitro con el transcurso el tiempo. Evalúa la eficiencia del sistema extrínseco de la coagulación midiendo la formación del coagulo plasmático en presencia de extractos tisulares (fosfolípidos) y CaCl 2. Es más sensible al déficit de factores VII, X y V que a la deficiencia de protrombina. Se prolonga con déficit severo de fibrinógeno. Materiales y Método Citrato de Sodio 0,1 M Baño termostatizado a 37 C Pipetas automáticas de 100 µl y 200 µl. Tubos de vidrio para realizar las pruebas Tubos de plástico para recolección de la muestra Centrífuga Cronómetro Reactivo: Tromboplastina cálcica recombinante o tromboplastina cálcica de cerebro de conejo que aportan los fosfolípidos y el calcio. Estabilidad en días luego de reconstituida. El reactivo se debe mantener a 37 C durante la realización de las pruebas. A 37 C sólo dura 60 min. En un tubo de vidrio en baño a 37 C colocar 100 µl del plasma pobre en plaquetas. Incubar por lo menos 1 minuto. Agregar 200 µl de tromboplastina cálcica y simultáneamente poner en marcha el cronómetro. Mover el tubo suavemente por inclinación hasta que se forma el coágulo y detener el tiempo. Anotar el tiempo. Los resultados se expresan en tiempo y en porcentaje de actividad interpolando el tiempo correspondiente a la muestra en una curva de calibración. Valor de Referencia: 70 120% Fisiología de la Hemostasia 7
3.g. Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado Mide el tiempo de coagulación del plasma en presencia de: cefalina (tromboplastina parcial, sustituto plaquetario), aporta los fosfolípidos que son el sitio de anclaje donde se realizan las reacciones; un activador (caolín, ácido elágico, sílice, celita), aporta cargas negativas para activar la coagulación y los iones calcio que se agregan en forma de CaCl 2. Con esta prueba se estudian los factores de la vía intrínseca de la coagulación y se prolonga ante los descensos de los factores XII, XI, IX, VIII, X, II ó V. La muestra que se utiliza es la misma que para el tiempo de protrombina, es decir un plasma pobre en plaquetas. Materiales y método Citrato de sodio 0,1 M Reactivo de APTT comercial CaCl 2 0,025 M Baño termostatizado a 37 C Pipetas automáticas de 100 µl Tubos de vidrio Tubos de plástico para recolección de la muestra Centrífuga Cronómetro En un tubo de vidrio en baño a 37 C colocar 100 ul de muestra e incubar 1 minuto. Luego agregar 100 ul de reactivo de APTT e incubar 3 minutos (etapa de activación) Agregar 100 ul de CaCl 2 y poner en marcha el cronómetro. Controlar la formación del coágulo de plasma sumergiendo y sacando el tubo. Detener el cronómetro cuando se visualiza la red de fibrina. El resultado se expresa en segundos. Valor de Referencia: 25 35 seg. Además se realizarán las pruebas utilizando un coagulómetro (Fribintimer 2) Fisiología de la Hemostasia 8
El coagulómetro Fibrintimer 2, es un analizador compacto de lectura turbidimétrica que es óptimo para sistematizar todas las determinaciones rutinarias de hemostasia. Principio de acción: Turbodensitompetrico, cuenta con cubetas de lectura (microcubetas), con un volumen total de 150 a 300 µl de plasma citratado (1+9). Procedimiento Tiempo de Quick Tiempo de Protrombina - TP 1. Elegir en el menú principal la determinación a realizar (Tiempo de Protrombina) 2. Introducir 100 µl de plasma en la microcubeta de trabajo y esperar que se incube a 37 C. 3. Cuando el aparato lo indique en el display agregar de una vez 200 µl del reactivo de TP. 4. Al cabo de unos segundos aparecerá el valor en la pantalla. El equipo informa el tiempo y la tasa de protrombina en %. Tomar nota del resultado obtenido. Tiempo de Tromboplastina parcial activado (APTT) 1. Elegir en el menú principal la determinación a realizar (APTT). 2. Introducir 100 µl de plasma + 100 µl del reactivo de APTT en la microcubeta de trabajo y esperar que se incube a 37 C. 3. Cuando el aparato lo indique en el display agregar de una vez 100 µl de solución de Cl 2 Ca 0,0025 M. 4. Al cabo de unos segundos aparecerá el valor en la pantalla. El equipo informa el tiempo en segundos. Tomar nota del resultado obtenido. Materiales de limpieza (por comisión): Detergente Rejilla Alcohol gel Cepillo Fisiología de la Hemostasia 9
3.h. Conclusiones: Explique en forma sintética los mecanismos fisiológicos puestos en juego en cada una de las técnicas de evaluación de la hemostasia, indicando que aspectos se ponen en evidencia. 1. Recuento de Plaquetas. 2. Tiempo de Sangría. 3. Tiempo de coagulación. 4. TP 5. APTT 4. GUÍA DE ESTUDIO 1. Qué proceso fisiológico se evalúa con un Tiempo de Sangría? 2. De qué factores depende la adhesión plaquetaria al endotelio? 3. Qué proceso fisiológico se explora con la determinación del Tiempo de Coagulación? 4. Cómo está formado el complejo protrombinasa? Cuál es su función? 5. Qué sucede con el coágulo de fibrina luego de la reparación de la injuria vascular? 6. Por qué la sangre en condiciones fisiológicas y en ausencia de daño endotelial circula sin coagularse? 7. Cuáles son las funciones procoagulantes y antitrombóticas de la trombina? 8. Cuáles son las funciones antitrombóticas y procoagulantes del endotelio? 5. BIBLIOGRAFÍA Textos de cabecera Cingolani, H. E.; Houssay, A. B. y Col: Fisiología Humana de Houssay. 7ª Edición. Editorial El Ateneo. Buenos Aires. 2006. Dvorkin, M. A.; Cardinali, D. P.; Iermoli, R. H.: Best & Taylor. Bases Fisiológicas de la Práctica Médica. 14ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. 2010. Guyton, A. C.: Tratado de Fisiología Médica. 11ª Edición. Editorial Elsevier. Madrid. 2006. Koeppen, B.M.; Stanton, B.A.: Berne & Levy. Fisiología. 6ª Edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid, 2009. Fisiología de la Hemostasia 10
Silvernagl, S; Despopoulos, A.: Fisiología. Texto y Atlas. 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid, 2009. Silverthorn, D. U.: Fisiología Humana. Un Enfoque Integrado; 4ª Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. 2007. Coppo, J. A.: Fisiología Comparada del Medio Interno. 2ª Edición corregida y aumentada. Editorial Universidad Católica de Salta. Departamento Editorial EUCASA. Salta. 2008. Textos de consulta Henry, J.B.: El Laboratorio en el diagnóstico clínico: homenaje a Todd-Stanford & Davidsohn. Tomos I y II. Editorial Marbán. 2005. Gauna Pereira, María del Carmen: Bioseguridad en el laboratorio. Curso PARÁMETROS DEL HEMOGRAMA. UTILIDAD E INTERPRETACIÓN. Resolución 811/08 C.D. Corrientes, 16 de octubre de 2008. Ióvine, E.; Atilio SeIva, A.: El Laboratorio en la Clínica. 3ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 1985. Levy-Lambert: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. Organización Panamericana de la Salud. 1983. J Sans Sabrafen; C. Besses; Raebel, J. L; Vives Corrons: "Hematología Clínica" 6º edición, 2008. Ediciones Harcourt, Barcelona, España. L. Kordich; A. Blanco; G. Cerrato y Quintana; A. Vazquez; M. Vizcargüenaga: "Fundamentos para el manejo práctico del laboratorio de Hemostasia. 2ª Edición 2005. Ediciones Grupo CAHT. Buenos Aires, Argentina. Colman et Al: "Hemostasis and Thrombosis" 4º edición. J.B. Lippincott Co. Philadelphia, 2003. Fisiología de la Hemostasia 11