HEMATOLOGIA CLASE TEORICO-PRACTICA PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO. Bioq. Mariana Raviola

Transcripción

1 HEMATOLOGIA CLASE TEORICO-PRACTICA PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO Bioq. Mariana Raviola Cátedra de Hematología-Servicio de Hematología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. 2018

2 HEMOSTASIA Comprende el proceso que previene el sangrado cuando un vaso sanguíneo es dañado y al mismo tiempo mantiene la sangre en estado fluido dentro del árbol vascular.

3 HEMOSTASIA FASES: -Respuesta vascular: Vasoconstricción localizada a nivel del área afectada -Hemostasia Primaria: Formación de un agregado o trombo de plaquetas sobre la superficie de vascular lesionada. -Coagulación: Formación de fibrina que refuerza el trombo plaquetario. -Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos de fibrina.

4 INDICACIONES PARA EL PACIENTE Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas tratando de realizar el menor esfuerzo físico posible

5 FICHA DE ANTECEDENTES DEL PACIENTE - Motivo de consulta -Trombosis actual o anterior -Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis -Sangrado post extraccion dentaria -Hemorragia post parto o post cirugia -Menstruacion abundante -Petequias -Antecedentes familiares de trombosis o sangrado. -Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos, heparina, etc

6 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS -Anticoagulante: EDTA -Material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado -Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido

7 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Método manual sangre venosa anticoagulada con EDTA Dil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: x 10 3 /mm 3 Contadores hematológicos

8 HEMOSTASIA PRIMARIA RECUENTO DE PLAQUETAS Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde se controlará el número, forma y tamaño plaqueterio

9 HEMOSTASIA PRIMARIA Tiempo de sangría Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa interacción: Plaquetas-Pared vascular in vivo Depende de: cantidad y calidad funcional de las plaquetas cantidad y calidad funcional de vwf calidad del colágeno. Duke VN < 4 min Ivy VN < 5 min Simplate VN < 9 min Cohibir cuando tpo > 2 VN

10 Tiempo de sangría TS: sensibilidad - especificidad - reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, barrido excesivo

11 HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se produce a través de la interacción de la GPIIb- IIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP como fuente de energía, depende de varios factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy influenciada por la limpieza del material

12 HEMOSTASIA PRIMARIA Retracción del Coagulo Se coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de vidrio bien limpio, se mantiene a 37 c, a la hora se observa la magnitud de la retracción. El resultado se expresa en cruces. Cuando el coagulo se ha despegado por completo de la pared del tubo se considera retracción total (+++), cuando no hay retracción es a retractil, y cuando queda un sedimento de hematíes es fibrinocruorico.

13 RETRACCION DEL COAGULO

14 HEMOSTASIA PRIMARIA PRUEBA DEL LAZO Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión positiva que aumenta la presión sanguínea por obstrucción del recorrido venoso, depende de calidad y cantidad de plaquetas, calidad del vaso y los tejidos adyacentes, el gradiente de presión que tiende a generar la extravasación

15 HEMOSTASIA PRIMARIA PRUEBA DEL LAZO Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y se deja 5 min. a una presión media entre la máxima y la mínima, se quita la presión y se observa la aparición de petequias VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de diámetro. Se informa la positividad en cruces

16 ADHESIVIDAD HEMOSTASIA PRIMARIA PLAQUETA vw SUPERFICIE In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37

17 HEMOSTASIA PRIMARIA ADHESIVIDAD In Vivo : Borchgrevink Adhesividad (%)= 100 *( RT 0 RT 2 / RT 0 ) RT 0 : recuento de pq. De muestra de sangre venosa extraída con EDTA RT 2 : recuento de pq. Luego de 2 min de TS. VN: 30-70%

18 ADHESIVIDAD: método de Hellen II Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. columna cp bomba EDTA 2% sp EDTA 2% %Adh = 100 VN = 27-70% SP- CP SP

19 HEMOSTASIA PRIMARIA AGREGACIÓN La agregación plaquetaria es el resultado final de un complejo proceso metabólico. Cuando el endotelio se daña, se expone una serie de agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos son el colageno, la adrenalina, y el ADP. La agregación plaquetaria in vitro se define como la interacción Pq-Pq medida sobre PRP.

20 Agregación plaquetaria in vitro Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982) IIHEMA-ANM

21 Agregación plaquetaria in vitro

22 Condiciones del ensayo: -Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3,8% (1:9) -Tubos de polipropileno -Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a rpm -Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a altas rpm. -Ajustar concentración del PRP con PPP: /m 3 -Tapar tubos para evitar cambios de ph - Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

23 AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 um ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mm (receptor de Tx) ADP: 2.5 um, 5.0 um (P2Y 1, P2Y 12 ) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vw tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

24 AGREGACION

25 COAGULACIÓN MI HMWK XII PK XI IX VIII X V II I VII ME TC

26 TOMA DE MUESTRA Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 % No se aconseja utilizar sangre capilar. La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular, ( torniquete menos de un minuto)

27 TOMA DE MUESTRA La sangre arterial debe ser obtenida por punción directa no traumática. Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable, realizar la extracción con doble jeringa y descartar los primeros 5 a 10ml de sangre.

28 TOMA DE MUESTRA No se aconseja la extracción con tubos de vacío, aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar sangre una vez abiertos. la Relación ac / sgre, 1+9

29 TOMA DE MUESTRA La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se encuentra fuera del rango de 25 50%. Para calcular el citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula: Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55 1 Hto en (v/v)

30 TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Cualquiera sea la distancia se remitirán las muestras congeladas, con hielo seco, y en un recipiente adecuado para su conservación, acompañadas de controles normales procesados de igual forma.

31 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Descartar los tubos que no mantengan adecuada relación ac/ sgre, y aquellos que muestren hemólisis visible. Centrifugar las muestras y separar los plasmas con pipetas de plástico lo mas rápido posible.

32 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS a-plasma citratado rico en plaquetas (prp) centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs b-plasma citratado pobre en plaquetas (ppp) Menos de 5000/mm3 centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las 4 hs. c-plasma citratado libre de plaquetas (PPP) Menos de 1000/mm3 centrifugar la muestra de sangre 10 minutos a 3000 rpm, trasvasar el PPP a tubo de plástico de polipropileno (PP) con pipeta plástica y volver a centrifugar a altas revoluciones para eliminar la mayor cantidad de plaquetas posibles. 1 mes a -20ºC

33 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA TPR -Tiempo de plasma recalcificado -Se basa en reiniciar la cadena de activación del sistema de la coagulación al agregar un exceso de iones calcio al plasma citratado y se mide el tiempo que tarda en coagular. -Evalúa numero y función de plaquetas Muestra: prp Reactivo: cloruro de calcio 0,025 M

34 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TPR Procedimiento: incubar unos segundos a 37 C 200 ul de prp y disparar el cronometro al agregar 200 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30 seg el tiempo que tarda en coagular Se realiza por duplicado y se informa el promedio VN: 1-3 min. Prolongado: Déficit de factores de la vía intrínseca y del numero y función de las plaquetas.

35 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TP -Tiempo de protombina -Mide el tiempo de coagulación de un plasma citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones calcio -Evalúa la vía extrínseca y tronco comun. -Se usa para monitorear la terapia con ACO -Refleja cambios en los niveles de los factores II,VII,X,V -En cuanto al fibrinógeno solo una disminución por debajo de 50 mg lo afectan.

36 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA TP Tromboplastina Apoproteina + Fosfolipidos Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratón o mono, recombinarte (humana) a la que se le agregan fosfolipidos naturales o artificiales

37 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TP Muestra: plasma citratado ppp Reactivo: tomboplastina calcica Procedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37 C, disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a 37 C, medir el tiempo de coagulación. Los resultados se informan: -En segundos informando entre paréntesis el valor del testigo( 11 recombinante, de conejo)

38 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TP -En % de actividad o tasa de trombina: Se preparan diluciones de un pool de plasmas normales y se determina el TP por duplicado, con los datos se grafica una curva, en papel doble log, de TP vs % de actividad, asignando al pool de normales el 100% de actividad. Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el % o tasa que le corresponde. VN: %

39 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TP Valores prolongados se observan en: -Deficiencia congénita o adquirida de uno o varios de los siguientes factores: II,V,VII,X -Hipofibrinogenemia -Enfermedad hepática -Deficiencia de vitamina K -Tratamiento con ACO -Presencia de inhibidores de alguno de los factores involucrados

40 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA APTT -Tiempo de tromboplastina parcial activado -Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial, un activador, e iones calcio. -Evalúa la vía intrínseca y tronco común. -Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulación con heparina

41 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA APTT Tromboplastina parcial: fosfolipidos de la tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de fuentes vegetales (cefalina) Activador :- particulado, caolín, celite, sílica micronizada. -no particulado, ac. Elagico

42 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA APTT Muestra: plasma citratado ppp Reactivos: -cefalina - caolin -cloruro de calcio M Procedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de rvo a 37 C durante 3 min, disparar el cronometro al agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el tiempo que tarda en coagular. VN: seg.

43 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA APTT Valores prologados se observan en: -Déficit congénito o adquirido IX, X, XI, y XII -Tratamiento con heparina -Presencia de inhibidores -Tratamiento ACO instaurado de factores II, V, VIII,

44 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TT Evalúa la etapa de fibrinoformación midiendo el tiempo que tarda en coagular el plasma citratado en presencia de trombina, independientemente de las alteraciones que podrían afectar el MI o el ME

45 PRUEBAS PARA EVALUAR COAGULACIÓN LA Muestra: ppp TT Reactivo: solución de trombina comercial (liofilizada) o preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la dilución de manera tal que el testigo sea aproximadamente 15 seg Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37 C agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo que tarda en coagular.

46 PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN TT Se considera prolongado cuando el plasma del paciente difiere en mas de 4 segundos con el normal. Valores prolongados se observan en : -Niveles bajos de Fibrinógeno o Disfibrinogenemia -Tratamiento con heparina no fraccionada -Presencia de inhibidores adquiridos

47 PRUEBAS ALTERADAS Déficit de factores o presencia de inhibidores? Pruebas de corrección - Mezcla (1+1) corrige no corrige cuantificación de factores detección de inhibidores

48 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Para orientarnos sobre las causas que provocan la alteración de las pruebas podemos realizar correcciones mezclando partes iguales del plasma en estudio con: - Plasma normal - Plasma adsorbido: aporta los factores I,V,VIII,XI,yXII. - Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yxii - Plasma envejecido: carece de factor V

49 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Preparación de pool de plasmas normales Se extrae sangre a como mínimo 10 sujetos normales con básico de coagulación normal, y se prepara ppp se fracciona y se conserva a -80 C hasta 6 meses o solo 1 mes si se guarda a -20 C

50 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Preparación de plasma adsorbido Es plasma desprovisto de los factores vitamina K dependientes, factores II,VII, IX y X, que quedan adsorbidos en sulfato de bario. A partir de sangre extraída con oxalato de sodio en relación 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37 C 15 min.,se centrifuga dos veces y se recoge el sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg. El plasma adsorbido posee los factores: I,V,VIII,XI,XII

51 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Preparación de suero Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII. Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min. a 3000 rpm.se puede mantener a 4 C por 24 horas o fraccionar y congelar

52 PRUEBAS DE CORRECCIÓN Preparación de plasma envejecido Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato de sodio 1 M en proporción 9+1, se obtiene ppp, y se coloca en un enlenmeyer a 37 c. Se contola decaimiento de la actividad del factor V mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar y guardar a -20 c.

53 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA EXTRINSECA II,V,VII,X plasma TP» patrón/pool de plasma normal(curva de calibración)» paciente diluido seg seg pac plasma deficiente en el factor a medir tromboplastina - calcio % pac % factor

54 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA INTRINSECA VIII,IX,XI,XII plasma» patrón/pool de plasma normal (curva de calibración)» paciente diluido plasma deficiente en el factor a medir cefalina - kaolín Cl 2 Ca seg pac % pac % factor

55 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL :FIBRINOGENO (método gravimétrico) trombina fibrinógeno fibrina -Se recoge el coagulo con varilla de vidrio -Se lava con agua destilada -Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80 -Se pesa la fibrina en balanza de precisión, la masa de fibrina es directamente proporcional a la concentración de fibrinógeno C final

56 DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL :FIBRINOGENO (método de Claus) método básico = TT plasma» patrón mg/dl calibración)» paciente (curva de seg seg pac trombina mg/dl pac mg/dl

57 SANGRADO SIN ALTERACION PRUEBAS GLOBALES DE LA Determinación de factor XIII -Solubilidad del coagulo en urea 5 M La fibrina formada en ausencia de factor XIII disuelve en urea 5 M. Procedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con 200ul de cloruro de calcio M, y 100 ul de trombina, incubar 30 min a 37 C agregar solución urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a 30min, 1,2,4,y 24 horas la disolución del coagulo se de los

58 SANGRADO SIN ALTERACION PRUEBAS GLOBALES DE LA Valor normal: no disolución a las 24 horas. Poco valor diagnostico solo se modifica cuando la cc del factor es muy baja -Metodos Funcionales: Espectofotometricos Fluoromericos -Determinacion Inmunologica de factor XIII

59 FUNCIONES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO ELIMINACIÓN DE LA FIBRINA QUE QUEDA ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS DESPUÉS DE LA COAGULACION (intravascular) INTERVIENE HÍSTICAS EN LAS REPARACIONES INTERVIENE MACROFAGOS EN LA ACTIVACION DE LOS (extravascular)

60 SISTEMA FIBRINOLÍTICO Está compuesto por una enzima clave: plasmina (Plm), cuyo precursor inactivo es el plasminógeno ( Plg ). Esta activación puede producirse por : Activador tisular del plasminógeno: t-pa Activador tipo uroquinasa: u- PA Factor XIIa y calicreína

61 SISTEMA FIBRINOLÍTICO La plasmina produce clivaje tanto del fibrinógeno como de la fibrina. Degradación del fibrinógeno.(fibrinogenolisis) fragmentos X, Y, D, E ( PDF) Fisiológicamente esto no ocurre ya que las pequeñas cantidades plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina. de Degradación de fibrina. (Fibrinolisis) fragmentos de distinto PM, en su mayoría fragmento D entrecruzado ( D-Dímero) El hallazgo de Dímero D aumentado implica que hubo formación de fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.

62 EVALUACION DEL MECANISMO PRUEBAS GLOBALES FIBRINOLÍTICO TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO. TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO ENTERA DILUIDA. DE SANGRE TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS

63 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO LISIS DE EUGLOBULINAS La dilución y acidificación del plasma provoca la precipitación de las euglogulinas( fracción proteica que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los activadores del plasminógeno y la plasmina), luego se resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba a 37 C,. para registrar el tiempo de lisis del coágulo, este procedimiento elimina los inhibidores de la fibrinolisis. El tiempo de lisis del coagulo es inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica del plasma

64 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de agua destilada,70ul de acido acético, y 250ul de ppp, se mezcla y deja 30 min a 4 C, se centrifuga 5 min a bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con solución de borato de sodio en baño a 37 C hasta disolución y se coagula agregando cloruro de calcio Se registra el tiempo desde la coagulación hasta la disolución total del coagulo.

65 EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs. Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores del plasminógeno, pudiéndose asociar con hemorragias. Tiempos de lisis superiores reflejan disminución de la actividad fibrinolítica y pueden asociarse a perdidas embriofetales. La prueba se ve afectada por los niveles de fibrinógeno y de plasminógeno.