GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 10. Pruebas básicas y especiales para el estudio de las plaquetas y sistema fibrinolítico

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1 Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 10 Pruebas básicas y especiales para el estudio de las plaquetas y sistema fibrinolítico

2 1 PRUEBAS GLOBALES PARA EL ESTUDIO DE PLAQUETAS Introducción: El estudio de las plaquetas en el laboratorio requiere extremos cuidados con respecto a la toma de muestra y anamnesis del paciente, teniendo en cuenta la principal característica de las plaquetas que es su gran capacidad de activarse y adherirse. Otro aspecto muy importante a tener en cuenta es que las plaquetas son fragmentos del citoplasma de megacariocitos y al carecer de núcleo son incapaces de sintetizar proteínas, por lo cual una medicación que afecte la funcionalidad la plaqueta no podrá repararla. 1- RECUENTO DE PLAQUETAS EN SANGRE ENTERA 1.a)- Método Manual Fundamento: La sangre entera se mezcla con una sustancia que lisa los glóbulos rojos dejando intactas las plaquetas. Reactivos EDTA disódico al 2% Oxalato de amonio 0,1 N 0 al 1% Obtención de la muestra: Se extrae sangre por punción venosa usando material de plástico y EDTA como anticoagulante. El EDTA debe usarse en una concentración aproximada de 2 mg por ml de sangre ya que a concentraciones mayores las plaquetas tienden a hincharse y romperse y a concentraciones menores no se evita su apelotonamiento. : Se diluye la sangre con la solución de oxalato de amonio al 1%, recientemente filtrada, en una proporción de 1:20. Se deja reposar 10 minutos para permitir la lisis de los glóbulos rojos, y posteriormente, se homogeneiza y se carga la cámara de Neubauer. Se deja reposar la cámara en ambiente húmedo durante 10 minutos para que las plaquetas sedimenten. Se realiza el recuento de plaquetas en el retículo central (se cuentan los cuatro cuadrados de las esquinas y uno del centro). Cálculo: N x 400 x 20 x 10 = número de plaquetas por µl 80 N = nº de plaquetas contadas en los cinco cuadrados 400 = nº total de cuadrados pequeños de la cámara 80 = nº de cuadrados pequeños contados 20 = inversa de la dilución 10 = se multiplica por 10 para expresar el resultado en nº de plaquetas por mm 3 (µl) Valores de referencia: a / µl 150 a /litro (SI) 1-b) Método automatizado: Se emplean contadores hematológicos donde el recuento plaquetario forma parte del perfil celular sanguíneo.

3 2 Independientemente del método de recuento empleado, es importante observar al microscopio un frotis de sangre periférica, para evaluar cantidad, distribución, forma y tamaño plaquetario. Asimismo la observación del mismo permitirá dilucidar una trombocitopenia producida como consecuencia de acúmulos plaquetarios. Trombocitopenia inducida por EDTA: Algunos pacientes presentan en su plasma un anticuerpo que reacciona con un criptoantígeno en presencia de EDTA. Este criptoantígeno se encuentra en la GP IIb-IIIa, lo que lleva a la aglutinación in vitro de las plaquetas con la consiguiente disminución en el recuento de plaquetas en la muestra obtenida con EDTA. Este descenso no se correlaciona con la cantidad de plaquetas presentes in vivo ni con la observación del frotis sanguíneo. En estos casos el recuento de plaquetas se debe realizar en muestras obtenidas con otros anticoagulantes como citrato o heparina. 2-TIEMPO DE SANGRÍA Es una prueba que permite estudiar la forma en que se realiza la hemostasia espontánea de pequeñas heridas. Cuando se produce la injuria tisular se exponen componentes del subendotelio, como el colágeno tipo IV y V, a los cuales se adhieren las plaquetas. El tiempo de sangría (TS) se modifica fundamentalmente por la cantidad y calidad de las plaquetas así como también por muy bajas concentraciones de proteínas plasmáticas como el fibrinógeno y disminución de von Willebrand. Podemos tener alterado el TS en trombocitopatías congénitas (Bernard Soulier, Trombostenia de Glazman, Síndrome de Pool de Depósito) o trombocipatías adquiridas (uremia, en presencia de paraproteínas, afibrinogenemias), síndromes mielodisplásicos, trombocitemia esencial). 2.a) Método de Duke Fundamento: Consiste en medir el tiempo de duración de una hemorragia provocada por una incisión realizada en el lóbulo de la oreja. Se desinfecta el lóbulo de la oreja y se practica en su borde inferior, con una lanceta afilada, una incisión en sentido vertical. El corte debe ser suficiente profundo (3 a 4 mm) para que la sangre fluya espontáneamente sin ejercer presión. Cada 30 segundos se recogen las gotas de sangre sobre un papel de filtro, sin tocar el borde de la incisión. Cuando la sangre fluye con mayor rapidez se debe recoger con intervalos de tiempo menores. Se mide con cronómetro el tiempo que transcurre entre la primera y última gota. Valores de referencia: 1 a 4 minutos Este método tiene la desventaja de su escasa sensibilidad. 2.b) Método de Ivy Fundamento: Es la medida del tiempo de sangría en tres puntos del antebrazo bajo presión continua. Se coloca en el brazo del paciente, por encima del codo, el brazal de un aparato de presión (esfigmomanómetro) manteniendo una presión constante de

4 3 40 mm de mercurio durante toda la prueba (a fin de llenar los capilares y eliminar la variabilidad del tono capilar). Se desinfecta con alcohol y se hacen tres punciones separadas, de 3 mm de profundidad, en una zona del antebrazo en la cual no existan venas visibles. Simultáneamente se pone en marcha el cronómetro y sin tocar los bordes de la incisión se recoge cada 30 segundos la gota de cada herida, mediante un papel de filtro, hasta que las punciones dejen de sangrar. El promedio de los tiempos obtenidos, es el tiempo de sangría. Valores de referencia: 2 a 7 minutos Es más sensible que el método de Duke. 2.c) Método de Mielke y colaboradores El fundamento y procedimiento es igual al método de Ivy. La modificación consiste en practicar un corte de 1 cm de longitud por 1 mm de profundidad usando hojas de bisturí calibradas. Valores de referencia: 2 a 9 minutos 2.d) Método de Template ó de Mielke modificado El fundamento y procedimiento es igual al anterior pero el corte se realiza empleando con dispositivos comerciales (Template). 3. FRAGILIDAD CAPILAR Las petequias o equimosis se forman por la extravasación indiscriminada de células sanguíneas fuera de la vasculatura capilar hacia la piel, tejido subcutáneo o ambos. En esta prueba intervienen la cantidad y funcionalidad plaquetaria; la calidad del vaso y sus tejidos adyacentes y el gradiente de presión transmural que produce la extravasación sanguínea. Se encuentra alterada en trombocitopenias, trombocitopatías, púrpuras vasculares, disproteinemias, Síndrome de Ehlers-Danlos, déficit de vitamina C, etc. Para determinar la fragilidad capilar existen dos tipos de métodos: a) métodos de éstasis (hiperpresión) y b) métodos de succión (hipopresión). 3.a) Prueba del lazo o del torniquete Se denomina también prueba de Rumpel-Leede, prueba de Hess o de la fragilidad capilar. Fundamento: Consiste en someter a los capilares de la piel del antebrazo a un aumento de presión, obstruyendo la circulación venosa de retorno, respetando la arterial y, en observar el número de petequias cutáneas que aparecen por debajo del pliegue del codo. Se realiza colocando el brazal de un aparato para tomar la presión sanguínea en el tercio medio del brazo y se mide la presión. Se mantiene el brazal durante 5 minutos a una presión intermedia entre la sistólica y la diastólica (entre 80 y 100 mm de mercurio en un individuo normal). Se retira el brazal y durante los 5 minutos siguientes se cuenta el número de petequias que aparecen en la cara anterior del antebrazo. Se puede repetir la prueba en el otro brazo, pero una

5 4 vez practicada en ambos brazos, se debe esperar una semana para poder repetirla. Valores de referencia: En condiciones normales pueden formarse hasta 5 petequias. La positividad de la prueba se expresa en cruces. Positiva (+): pocas petequias en la cara anterior del antebrazo Positiva (++): muchas petequias sobre la superficie anterior del antebrazo. Positiva (+++): muchas petequias sobre todo el antebrazo y mano. Positiva (++++): petequias de gran tamaño y confluentes en todo el antebrazo y a veces se extienden al dorso de la mano. En algunos casos debido a la abundancia y confluencia de las petequias, todo el antebrazo adquiere una tonalidad violácea. 3.b) Prueba por succión o aspiración Se conoce también con el nombre de prueba de presión negativa de la ventosa o del petequiómetro. Fundamento: Consiste en aplicar durante 1 minuto una presión negativa sobre la piel en una región que puede ser el brazo o el antebrazo. Se realiza colocando durante 1 minuto una ventosa plástica de 2 cm de diámetro, conectada a un tubo que contiene un émbolo, que permite producir una presión negativa que puede graduarse por medio de un manómetro. Como en el mercado es difícil conseguir este aparato, distintos autores han diseñado pequeños instrumentos con esta finalidad. Este método tiene la ventaja de tener una estandarización más exacta, ya que la superficie examinada, es siempre exactamente igual, la presión negativa aplicada también puede ser medida con exactitud, lo mismo que el tiempo utilizado y puede repetirse con intervalos de tiempos muy cortos. Valores de referencia: 0 a 3 petequias a 200 mm de mercurio. La prueba es positiva cuando aparecen más de tres petequias. 4- RETRACCIÓN DEL COÁGULO Fundamento: La retracción del coágulo se produce por la interacción de la GPIIb-IIIa con la actina del citoesqueleto, produciéndose un reordenamiento de la membrana plaquetaria. Se utiliza ATP como fuente de energía. Esta prueba depende de: cantidad y funcionalidad de las plaquetas; concentración del fibrinógeno y del hematocrito. Se encuentra alterada en disfunciones plaquetarias congénitas o adquiridas, principalmente la Trombastenia de Glanzmann e insuficiencias renales. Se coloca en tres tubos de hemólisis bien limpios 1 ml se sangre en cada uno y se los mantiene a 37ªC durante 1 hora. Luego se observa la magnitud de la retracción. Valores de referencia: El coágulo normal debe separarse de las paredes y del fondo del tubo. Cuando el coágulo al final de la primera hora no se separa de las paredes del tubo, se lo puede desprender mediante una varilla delgada, incubando nuevamente el tubo, si la retracción es normal esta tiene lugar rápidamente.

6 5 Se informa: retracción del coágulo aumentada (hiperretráctil), normal (normorretráctil), disminuida (hiporretráctil) o nula (arretráctil). PRUEBAS PLAQUETARIAS ESPECÍFICAS 1- ADHESIVIDAD PLAQUETARIA in vivo (Método de Borchgrevik) Al producirse una injuria tisular quedan expuestos componentes del subendotelio, en un primer momento la plaqueta se adhiere a los componentes del subendotelio como el colágeno y FvW mediante las glicoproteína plaquetaria (complejo Ib-V-IX). La plaqueta adherida forma una monocapa sobre la herida y se activa. Fundamento: Se mide la adhesividad plaquetaria comparando el número de plaquetas presentes en una muestra de sangre obtenida por punción venosa frente a otra obtenida a partir de una incisión realizada en el antebrazo. La diferencia entre ambas expresa el número de plaquetas adheridas al tejido lesionado o adhesividad plaquetaria. Se realiza el tiempo de sangría según el método de Ivy o Mielke y a los 2 minutos, se toma con micropipeta una muestra de la sangre que fluye de la incisión practicada para el tiempo de sangría. Se realiza el recuento de plaquetas en esta muestra (RT 2 ). Al mismo tiempo se toma una muestra de sangre venosa y se realiza el recuento plaquetario basal (RT 0 ). % de Adhesividad = Resultados Valores de referencia: 30 a 70 % Se encuentran valores de adhesividad plaquetaria disminuidos en la enfermedad de Bernard Soulier (donde está alterada la GP Ib-V-IX) y también en la enfermedad de von Willebrand. También se encuentra alterada en la enfermedad de Pool de depósito y en trombocitopatías adquiridas como síndromes mieloproliferativos, enfermedad renal crónica y síndrome de plaquetas activadas. 2-AGREGACIÓN PLAQUETARIA (RT 0 RT 2 ) x 100 Cuando se produce una injuria tisular distintos estímulos inducen la agregación plaquetaria, entre ellos destacamos la exposición de componentes del subendotelio como el colágeno, productos formados por la activación del sistema de coagulación como la trombina, sustancias que son secretadas por la plaquetas o aportadas por la membrana del glóbulo rojo como el ADP, o sustancias liberadas en el lugar de la injuria como la adrenalina. Todas estas sustancias solas o combinadas son capaces de convertir plaquetas en estado de reposo a plaquetas en estado activado. El mecanismo de agregación plaquetaria es consecuencia de un proceso metabólico complejo. Para cada activador interviene un receptor de la membrana plaquetaria específico, y esta unión ligando-receptor desencadena vías metabólicas, las cuales conducen a la agregación plaquetaria. RT 0

7 Fundamento: Se define como agregación plaquetaria a la interacción plaqueta-plaqueta medida sobre PRP por método óptico, requiriéndose para este proceso la integridad metabólica de las mismas, dado que este mecanismo incluye cambios morfológicos y químicos. La valoración de la respuesta de agregación de las plaquetas puede realizarse, con las mismas en su medio natural, en el plasma, o bien resuspendidas en distintos medios. Se usa un método turbidimétrico que se basa en medir mediante un agregómetro, la diferencia en la densidad óptica (DO) existente entre el plasma rico en plaquetas (PRP) y el plasma pobre (PPP). A medida que las plaquetas se agregan y permiten el mayor pasaje de luz, disminuyendo así la DO, se inscriben las curvas de agregación en función del tiempo. El agregómetro tiene un sistema magnético que hace girar una barrita agitadora incluida en la cubeta de PRP en el momento del ensayo. Esta barrita agitadora simula la turbulencia sanguínea, la cual es fundamental para que se produzca la colisión entre las plaquetas y se mezcle el agente agregante incluido en la muestra. La temperatura a la que se realiza el ensayo es de 37ºC. La muestra no debe entrar en contacto con material de vidrio, porque en este caso se originaría la adhesividad de las plaquetas y la activación de la muestra. Obtención de la muestra Para los estudios de función plaquetaria es fundamental que el paciente no tome medicamentos que contengan aspirina desde los 10 días previos al estudio, y en lo posible que se suspendan 48 horas antes otros medicamentos (especialmente si estos son anti-inflamatorios). Además debe presentarse con un ayuno de más de 8 horas. Se extrae sangre venosa con agujas 19G 1 ½, procurando una punción sin dificultades y un buen flujo sanguíneo. Se deja drenar la sangre espontáneamente a tubos de plástico que contengan citrato de sodio al 3,8% en una relación 9:1 de sangre y anticoagulante respectivamente. Se debe homogeneizar suavemente. La relación entre la sangre y el anticoagulante depende del hematocrito del paciente, debido a que el exceso de citrato en el medio modificará la disponibilidad de calcio ocasionando variaciones en la amplitud de las curvas de agregación. Obtención del PRP Se centrifuga la muestra en centrífuga no refrigerada (el frío estimula las plaquetas) durante 5 a 7 minutos a baja velocidad (180 g). Es importante que la muestra esté libre de glóbulos rojos y blancos debido a que los primeros modifican la disponibilidad de ADP y los segundos inhiben la agregación plaquetaria. Posteriormente se separa el plasma rico en plaquetas con pipeta plástica y se lo transfiere a tubos plásticos, que se tapan para evitar la oxidación del plasma. El resto de sangre se centrifuga nuevamente durante 20 minutos a alta velocidad para obtener PPP que será utilizado para calibrar el aparato. Debido a que las plaquetas necesitan ser metabólicamente activas deberá realizarse el ensayo de agregación dentro de las 2 horas desde la extracción de sangre y no antes de los 20 minutos, ya que responden menos, 6

8 7 probablemente porque no se metabolizó toda la PGI 2 que pudiera estar presente en la muestra. En cada prueba se utiliza una cubeta con 450 ul del PRP a la que se le incorpora la barrita agitadora y el agente agregante a probar en la dilución correspondiente. Los agentes agregantes o agonistas deben permanecer en gradillas enfriadas una vez preparados. Los agonistas que se pueden usar y su concentración final en la cubeta de reacción son: Acido Araquidónico: 2.5 mm ADP: 3,3 x 10-6 M Adrenalina: 10-6 M Colágeno: 2-5 µg/ml Ristocetina: 1.5 mg/ml Trombina: 0,2-0,5 U/mL Cada día al comenzar y al terminar el estudio de los pacientes deberá chequearse por lo menos un normal que asegurará la buena actividad de todo el sistema. El primer paso es la calibración del agregómetro. Se ajusta el 100% de DO con PRP y el 0% con PPP correspondiente, en ambos extremos del papel donde se grafican las curvas que deberá correr a 2 cm/minuto. Al colocar la barrita agitadora dentro de los 450 ul de PRP, lo primero que se observa son las oscilaciones características de las plaquetas discoides en suspensión. El segundo paso será ensayar la agregación espontánea durante 20 min. Se considerará que existe agregación espontánea cuando supere el 15 % de agregación. Posteriormente se continúa con los otros agonistas, obteniéndose curvas características con cada uno de ellos. Las siguientes gráficas ejemplifican el tipo de curva que se obtiene de acuerdo al tipo de agonista (Fig N 1). FIGURA N 1: Agregación plaquetaria. Curvas normales empleando ADP y adrenalina ADP Adrenalina

9 8 FIBRINOLISIS Los componentes del sistema fibrinolítico pueden ser evaluados en conjunto mediante pruebas globales (las cuales son pruebas funcionales) o estudiando específicamente la funcionalidad cada uno de sus componentes (pruebas antigénicas y/o estudios de biología molecular) También se puede evaluar si hubo activación de este sistema investigando la presencia de los productos generados por su activación. Debemos tener en presente que los ensayos que evalúan el sistema fibrinolítico en el laboratorio son pruebas in vitro. En las mismas se trabaja con una muestra de sangre del paciente (ex vivo), de tal manera que solo evaluamos los componentes del sistema fibrinolítico que tenemos en el tubo (principalmente las proteínas), es decir no intervienen las células (endoteliales, plaquetas, micropartículas) ni los receptores celulares que fisiológicamente desarrollan una función importante in vivo. Debido a ésto los resultados del laboratorio presentan cierta limitación. Obtención de la muestra Para el estudio de la fibrinólisis se debe tener presente algunas consideraciones: o Algunos componentes presentan fluctuaciones diarias debido al ritmo circadiano, por ejemplo el pico de síntesis del Inhibidora del activador plasminógeno (PAI) es entre las 3 y 6 de la mañana y su valle por la tarde, mientras que el activador tisular del plasminógeno (tpa) presenta un nivel máximo a las 9 de la mañana. Para que las técnicas de fibrinólisis puedan ser reproducibles se estableció que el horario de extracción debe realizarse siempre entre las 8 y 10 de la mañana. o Como varios de los componentes de este sistema son sintetizados por las células endoteliales, la punción venosa debe ser limpia procurando el menor éstasis posible (no superior a 2 minutos) para evitar la activación del endotelio y la posterior liberación de tpa. o Existen factores externos que potencian el sistema fibrinolítico, entre ellos: isquemia, oclusión venosa, ejercicio físico, frío intenso, sustancias vasoactivas, ingestión moderada de alcohol, tratamiento para la hipertrigliceridemia, la raza blanca y un factor etáreo (cuanto más joven más activo). Disminuyen su acción: Tabaco, diabetes, ingesta excesiva de alcohol, anticonceptivos orales, aterosclerosis, hipertrigliceridemia. o Para minimizar los posibles efectos de factores externos en la evaluación de la función fibrinolítica se solicita la paciente la restricción del consumo de alcohol 18 a 24 h previas a la toma de la muestra y del consumo de cigarrillos por lo menos días previos al estudio. Se recomienda no realizar actividad física (no hacer gimnasia, no subir escaleras, no correr, etc); el paciente deberá permanecer en reposo, en un ambiente tranquilo, entre 20 a 30 min antes de la extracción. o El anticoagulante recomendado para la lisis de euglobulinas es el citrato ácido de sodio (ph 5) porque preserva el tpa (tiene vida media corta) y evita la formación in vitro del complejo tpa-pai. Para el resto de las pruebas se utiliza citrato de sodio 0,11 M. Es recomendable la pronta separación del plasma del paquete globular, obteniéndose el PPP por doble centrifugación dentro de los 20 minutos realizada la extracción.

10 9 PRUEBAS GLOBALES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO 1-Tiempo de lisis de sangre entera diluida Fundamento: El tiempo de lisis del coágulo formado a partir de sangre entera diluida en buffer, depende de los niveles de fibrinógeno, plasminógeno, FXIII y del equilibrio entre los activadores e inhibidores del sistema fibrinolítico. Si los niveles de fibrinógeno, plasminógeno y FXIII son normales, el tiempo de lisis dependerá fundamentalmente del equilibrio tpa-pai. Colocar en un tubo de vidrio en baño de agua a 37ºC: 0,9 ml de tampón acetato de sodio (0,12 M, ph 7,4) 0,1 ml de sangre entera citratada 0,05 ml de trombina (solución 5 U/mL en tampón acetato) Incubar y registrar el tiempo de lisis del coágulo. Se informa el tiempo que tarda en lisarse el coágulo. Valores de referencia En individuos normales el tiempo de lisis del coágulo de sangre entera diluida es variable. Cada laboratorio debe establecer el rango de referencia. Se considera normal un tiempo de lisis superior a 18 horas. Tiempos de lisis menores a 2 h indican un aumento de la actividad fibrinolítica a expensas fundamentalmente de los activadores del sistema. 2-Tiempo de lisis de euglobulinas Fundamento: La dilución y acidificación del plasma produce la precipitación de una fracción proteica que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los activadores del plasminógeno y la plasmina. Esta fracción denominada euglobulinas, es resuspendida en un buffer alcalino, coagulada e incubada a 37ºC, para registrar finalmente el tiempo de lisis del coágulo. Mediante este procedimiento se eliminan los inhibidores de la fibrinólisis (sobrenadante) acortándose significativamente el tiempo de lisis en comparación con el de sangre entera. Una vez obtenida la muestra debe mantenerse en baño de hielo hasta su procesamiento, el cual debe llevarse a cabo dentro de los 20 min. de extraída la misma. La sangre se centrifuga durante 10 min. a rpm para obtener PPP. La prueba debe realizarse por duplicado. En un tubo de vidrio agregar: 8 ml de agua destilada fría. 0,5 ml de PPP 0,15 ml de ácido acético 1% Se mezcla por inversión y se dejan durante 30 minutos en heladera a 4ºC para que se complete la precipitación de las euglobulinas. Centrifugar a 5 min a rpm. Descartar el sobrenadante y colocar los tubos invertidos sobre un papel de filtro, durante 2 minutos para que escurra todo el líquido. A continuación agregar 0,5 ml de solución de borato de sodio (9 g de NaCl, 1 g de borato de Na y agua destilada csp 1000 ml). Mezclar con una varilla hasta disolución total del precipitado.

11 10 Mantener el tubo a 37ºC y agregar 0,5 ml de Cloruro de Ca 0,025 M. Registrar el tiempo al cual la mezcla coagula. Controlar cada 15 minutos hasta observar la lisis total del coágulo. Informar el tiempo de lisis del coágulo de euglobulinas. Valores de referencia: El coágulo no debe lisarse antes de las 2 horas. Tiempos de lisis menores de 1 hora 30 minutos indican un aumento de la actividad fibrinolítica a expensas fundamentalmente de los activadores del plasminógeno. La prueba puede, sin embargo, estar afectada por la concentración del fibrinógeno y del plasminógeno presentes en la muestra a analizar. 3-RESPUESTA FIBRINOLÍTICA POST-ISQUEMIA Fundamento: Esta prueba permite evaluar la respuesta del sistema fibrinolítico a un estímulo como la isquemia, provocada por la oclusión de la circulación sanguínea. Esta oclusión produce la estimulación de las células endoteliales que liberan componentes del sistema fibrinolítico y también una menor depuración hepática de los componentes (tpa, PAI, etc) lo cual conduce a un acortamiento de la prueba. La prueba consiste en tomar una muestra basal y otra post isquemia. La isquemia se produce colocando en el brazo del paciente un esfigmomanómetro durante 10 minutos a una presión media entre la máxima y la mínima de la presión arterial del paciente, lo cual impide su flujo sanguíneo. Concluido los 10 minutos, antes de retirar el esfigmomanómetro se obtiene la muestra de sangre post-oclusión. Sobre la muestra basal y post-oclusión se realiza alguna de las pruebas globales de la fibrinólisis como la lisis de sangre entera diluida o la lisis de euglobulinas. Resultados de lisis de euglobulinas: Se puede expresar el resultado: Lisis pre isquemia: > 120 minutos Lisis post isquemia: < 45 minutos También se pueden expresar los resultados como la diferencia en minutos del tiempo de lisis basal y el tiempo de lisis post isquemia, ó como el cociente entre post isquemia lisis / lisis basal. Se considera que la respuesta a la isquemia es buena si el cociente es menor de Niveles basales aumentados de PAI conducen a una respuesta fibrinolítica al estasis venoso pobre o ausente, debido a el PAI bloqueará el tpa liberado por el estímulo impidiendo su acción fibrinolítica. Una menor liberación de tpa producirá una respuesta similar. PRUEBAS ESPECÍFICAS FUNCIONALES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO DOSAJE DE PLASMINÓGENO Existen métodos directos e indirectos para estudiar el plasminógeno. Detallaremos un método directo amidolítico. Los métodos amidolíticos se basan en la capacidad que tienen las enzimas en actuar sobre sustratos específicos. Los sustratos cromogénicos son péptidos

12 11 sintéticos que presentan el mismo enlace que el sustrato natural de la enzima a estudiar. Al producirse la ruptura de dicha unión liberan un cromógeno (pnitroanilina) cuya intensidad se puede leer en espectrofotómetro a 405 nm. El plasminógeno circula como un zimógeno (proteína sin actividad). Para que esta proteína exprese su funcionalidad debe ser activada por activadores que pueden ser exógenos (estreptoquinasa) o endógenos (tpa). El plasminógeno de la muestra del paciente al ser colocado junto a un activador (estreptoquinasa) se convierte en plasmina (enzima activa). La plasmina liberada actúa sobre el sustrato cromogénico específico liberando un cromógeno que es medido a 405 nm Plasminógeno (muestra) + SK en exceso Plg-SK Plasmina Plasmina + sustrato p-nitroanilina 405 nm PRODUCTOS GENERADOS POR LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMA FIBRINOLÍTICO Como consecuencia de la activación del sistema fibrinolítico se genera plasmina, enzima proteolítica que puede actuar sobre distintos sustratos. Su principal sustrato fisiológico es la malla de fibrina. Cuando la plasmina degrada la fibrina el producto final de este proceso son los Dímeros D (fibrinólisis). Cuando la cantidad de plasmina generada degradó completamente la malla de fibrina y superó la capacidad de los inhibidores (α2 antiplasmina) capaces de frenarla, esta enzima sigue actuando sobre otros sustratos como el fibrinógeno, cuyos productos finales de degradación son los PDF (fibrinógenolisis). COAGULACIÓN TROMBINA FXIII FIBRINÓGENO MONÓMEROS COÁGULO DE FIBRINA DE FIBRINA X Y D E PLASMINA PDF D Dímeros D D

13 12 DETERMINACIÓN DE DÍMEROS D-D Métodos de aglutinación de partículas de látex Es una técnica rápida, semicuantitativa, para la determinación de productos de degradación de la fibrina D-D dímeros en el plasma. Se utilizan partículas de látex recubiertas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti D-D humano. La prueba es positiva con concentraciones de D-D que superen los 0,5 ug/ml. Es menos sensible que la determinación de D-D por enzimoinmunoensayo, pero resulta útil ya que es una técnica rápida que aporta información para el diagnóstico de emergencia o en el control de la terapia trombolítica. El ensayo es insensible a la presencia de fibrinógeno, productos de degradación tempranos (fragmentos X e Y) y al fragmento E. Valores de referencia: Valores menores de 500 ng/ml (plasma de individuos de ambos sexos con edades entre 18 y 55 años). El hallazgo de dímero D indica la activación del sistema de coagulación con generación de trombina y posterior acción del sistema fibrinolítico. Son de utilidad en el diagnóstico de Coagulación Intravascular Diseminada. Para el diagnóstico temprano de trombosis venosa profunda y tromboembolismo pulmonar es necesario utilizar una metodología altamente sensible que le otorgue un valor predictivo negativo alto como el ELISA o micropartículas de alta sensibilidad. La determinación de dímeros D resulta útil también para la evaluación de estados protrombóticos como neoplasias, leucemias agudas (M3) y en hepatopatías. BIBLIOGRAFÍA Manual de Hematología de la Academia Nacional de Medicina Manual de Hemostasia y Trombosis - Grupo Cooperativo de Hemostasia y Trombosis (Grupo CLAHT) Hemostasia y Trombosis Técnicas e interpretación. Dr. Edgardo Iglesias Guía de trabajos prácticos de Hemostasia. Universidad de Buenos Aires. Departamento de Análisis Clínicos Wintrobe s Clinical Hematology. 9ª Edición Trombosis. Tomo 1. Raúl Altman y colaboradores Fundamentos para el Manejo Práctico en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo CAHT (Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis) Guías de Trabajo Práctico del Curso de Posgrado Avances en Hemostasia Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.