RIDASCREEN Chikungunya Virus IgG capture, RIDASCREEN Chikungunya Virus IgM µ-capture K8121 K8131
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- Cristina Hernández Jiménez
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1 RIDASCREEN Chikungunya Virus IgG capture, RIDASCREEN Chikungunya Virus IgM µ-capture K8121 K8131 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, Darmstadt, Alemania Tel.: +49 (0) / Fax: +49 (0)
2 1. Uso previsto Para diagnóstico in vitro. Las pruebas RIDASCREEN Chikungunya Virus son inmunoensayos enzimáticos para la detección cualitativa de los anticuerpos IgG o IgM del virus del chikunguña en suero o plasma humanos. Estos ensayos están indicados para su uso en los casos en que hay sospecha de infección por el virus del chikunguña. 2. Resumen y descripción del ensayo Los virus del chikunguña son virus de ARN monocatenarios con envoltura del género Alphavirus en la familia Togaviridae. Tienen un diámetro de aproximadamente 60 nm. Existen cinco variantes del virus, en función de la distribución geográfica: África Occidental, África Central, África Oriental y Meridional, Océano Índico y Asia. Los virus del chikunguña son transmitidos a los seres humanos principalmente por mosquitos de las especies Aedes aegypti o Aedes albopictus. En los seres humanos, el virus provoca la fiebre de chikunguña. Tras un período de incubación de 1 a 6 días, la enfermedad comienza con la aparición repentina de dolor articular, frecuentemente con fiebre bifásica, mialgia y náuseas. Por norma general, la fiebre dura tan solo unos días. A medida que la enfermedad evoluciona suelen aparecer otros síntomas, entre ellos, hinchazón de los ganglios linfáticos, exantema maculopapular, dolores de cabeza y agotamiento. La enfermedad normalmente remite al cabo de dos semanas, pero el dolor articular puede persistir durante meses. En casos infrecuentes pueden producirse complicaciones hemorrágicas. Los daños permanentes y la muerte son raros. Si bien las infecciones por alfavirus no son comunes en Europa, pueden darse casos importados o por viajes. Como resultado de la respuesta del sistema inmunitario, el cuerpo genera anticuerpos específicos frente al patógeno tras producirse la infección por el virus del chikunguña. Estos anticuerpos pueden detectarse en el suero o el plasma por medio de métodos inmunológicos. La elección del antígeno específico frente al patógeno que se va a utilizar y el método de ensayo que se va a aplicar son primordiales para la validez de este último. 3. Principio del ensayo Los anticuerpos anti IgG y anti IgM humanas están unidos en una placa de microtitulación. Los anticuerpos IgG o IgM presentes en las muestras del paciente se unen a los anticuerpos anti IgG y anti IgM humanas. El material de muestra no unido se elimina por lavado. Los antígenos del virus del chikunguña se depositan seguidamente en la placa. A continuación se realiza un paso de lavado y después se añaden los anticuerpos del virus del chikunguña biotinilados. Tras otro paso de lavado, se pipetea la estreptavidina marcada con enzima, la cual se une a los RIDASCREEN Chikungunya Virus
3 inmunocomplejos específicos del chikunguña inmovilizados. La enzima cambia el substrato incoloro (H 2 O 2 /TMB) en un producto final de color azul. La reacción enzimática es interrumpida por la adición de ácido sulfúrico. Esta adición hace que el color cambie de azul a amarillo. La medición final se realiza en un fotómetro a 450 nm (longitud de onda de referencia de 620 nm). RIDASCREEN Chikungunya Virus
4 4. Reactivos suministrados Tabla 1: Reactivos suministrados (los reactivos del kit son suficientes para 96 ensayos). K8121 IgG K8131 IgM Plate 96 ensayos Placa de pocillos, 12 tiras de pocillos (divisibles) en el soporte; recubiertas con anticuerpos anti IgG humana Plate 96 ensayos Placa de pocillos, 12 tiras de pocillos (divisibles) en el soporte; recubiertas con anticuerpos anti IgM humana Diluent 100 ml Diluyente de muestras, listo para su uso; con fosfato y de color amarillo Wash 50 ml Búfer de lavado, concentración 20x; con fosfato Control IgG + Tapa roja 1,5 ml Control positivo IgG, listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Control IgG Tapa azul 1,5 ml Control negativo IgG; listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Cut-off IgG Tapa verde 2 ml Control de corte IgG; listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Control IgM + Tapa roja 1,5 ml Control positivo IgM; listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Control IgM Tapa azul 1,5 ml Control negativo IgM; listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Cut-off IgM Tapa verde 2 ml Control de corte IgM; listo para su uso; suero o plasma humanos diluidos; color amarillo Conjugate IgG Tapa negra 6 ml Conjugado de estreptavidina, listo para su uso; Conjugado peroxidasa-estreptavidina, color azul Conjugate IgM Tapa negra 6 ml Conjugado de estreptavidina, listo para su uso; Conjugado peroxidasa-estreptavidina, color rojo Ag LYO Tapa roja 1 ml Antígeno del chikunguña, liofilizado; puede utilizarse en 1 ml de búfer de lavado listo para su uso una vez reconstituido Ab SOLN Tapa blanca 6 ml Solución de anticuerpos contra el chikunguña, lista para su uso; solución de anticuerpos contra el virus del chikunguña biotinilados, color azul Substrate Tapa amarilla 15 ml Sustrato, listo para su uso; H 2 O 2 /tetrametilbenzidina Stop Tapa roja 15 ml Solución de parada, lista para su uso; 0,2 mol/l de ácido sulfúrico La información sobre sustancias peligrosas cumple con los requisitos del etiquetado. Para más información, consultar las hojas de datos de seguridad (SDS) en RIDASCREEN Chikungunya Virus
5 5. Instrucciones de almacenamiento El kit de ensayo puede utilizarse hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena a 2-8 C. El búfer de lavado diluido tiene una vida útil de cuatro semanas cuando se almacena a 2-8 C, y de cinco días cuando se almacena a temperatura ambiente (20-25 C). Una vez alcanzada la fecha de caducidad, no es posible garantizar la calidad. Abrir la bolsa de aluminio que contiene la placa de microtitulación sin que se rompa el precinto de seguridad. Almacenar las tiras de microtitulación que no se necesiten en la bolsa de aluminio cerrada. Evitar la contaminación de los reactivos y proteger el substrato incoloro de la luz directa. 6. Reactivos necesarios no suministrados 6.1. Reactivos Agua destilada o desionizada 6.2. Accesorios Viales de muestras Incubadora a 37 C Mezclador de vórtice Micropipetas para volúmenes de µl y µl Probeta graduada (1000 ml) Equipo de limpieza para placas de microtitulación o pipetas multicanal Fotómetro para placas de microtitulación (450 nm, filtro de referencia 620 nm) Papel de filtro (toallitas de laboratorio) Recipiente para residuos con solución de hipoclorito al 0,5 % 7. Advertencias y precauciones para los usuarios Para diagnóstico in vitro exclusivamente. Este ensayo solo debe llevarlo a cabo personal de laboratorio capacitado. Respetar las directrices para el trabajo en laboratorios médicos. Deben seguirse estrictamente las instrucciones de uso para realizar este ensayo. No pipetear las muestras ni los reactivos con la boca. Evitar el contacto con heridas de la piel o membranas mucosas. Llevar equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas de protección adecuados) al manipular los reactivos y las muestras, y lavarse las manos después de finalizar el ensayo. No fumar, comer ni beber en las zonas donde se manipulen las muestras. Para más información, consultar las hojas de datos de seguridad (SDS) en RIDASCREEN Chikungunya Virus
6 Los sueros de control presentes en el kit (control positivo, control de corte y control negativo) se analizaron para detección del anticuerpo del VIH, el anticuerpo del VHC y el antígeno de superficie de la hepatitis B, y dieron resultado negativo. Aún así, deberían tratarse como potencialmente infecciosos, al igual que las muestras del paciente y todos los materiales que toque, y deben manipularse de acuerdo con lo establecido en las normativas de seguridad nacionales correspondientes. Los usuarios son responsables de desechar de forma correcta todos los reactivos y los materiales después del uso. Se debe cumplir la normativa nacional aplicable a la hora de desecharlos. 8. Recogida y almacenamiento de muestras Este ensayo se ha diseñado para analizar las muestras de suero y plasma humanos. Tras la recogida de sangre, el suero debe separarse del coágulo lo antes posible para evitar hemólisis. Las muestras deben conservarse en frío o congeladas hasta el momento de realizar el ensayo. No congelar y descongelar la muestra repetidamente, para evitar la contaminación microbiana. El uso de muestras termoinactivadas, lipémicas, hemolíticas, ictéricas o turbias puede dar lugar a resultados falsos. Tabla 2: Almacenamiento de muestras Suero o plasma sin diluir Suero o plasma diluidos 2-8 C -20 C 2-8 C 1 semana > 1 semana 7 horas 9. Procedimiento de ensayo 9.1. Información general Antes del uso, todos los reactivos y las tiras de microtitulación deben alcanzar la temperatura ambiente (20-25 C). Una vez que hayan alcanzado la temperatura ambiente, extraer las tiras de microtitulación de la bolsa de aluminio. Mezclar bien los reactivos inmediatamente antes del uso. Tras el uso, almacenar rápidamente el kit a 2-8 C de nuevo. Utilizar solo los reactivos necesarios para realizar el ensayo. No devolver el reactivo restante al envase, ya que esto puede provocar contaminación. Las tiras de microtitulación no pueden usarse más de una vez. No utilizar reactivos ni tiras de microtitulación si el envase está dañado o los recipientes no se han cerrado herméticamente Preparación del búfer de lavado Mezclar 1 parte de búfer de lavado concentrado Wash con 19 partes de agua destilada. Para ello, añadir 50 ml de concentrado a una probeta de 1000 ml y llenar RIDASCREEN Chikungunya Virus
7 hasta 1000 ml con agua destilada. Calentar previamente el concentrado (baño maría a 37 C) para disolver los posibles cristales presentes. El búfer de lavado diluido se conserva durante cinco días cuando se almacena a temperatura ambiente (20-25 C) Preparación de la solución de antígeno del chikunguña Disolver el contenido de cada vial en 1 ml de solución de lavado diluida agitándolo. La solución debe incubarse durante 15 min a temperatura ambiente. La solución lista para su uso dura un día cuando se conserva a 2-8 C Preparación de la muestra Antes de iniciar el ensayo, diluir las muestras de suero o plasma a con el diluyente de muestras Diluent Por ejemplo, 10 µl de suero/plasma + 1 ml de diluyente Diluent Atención! El control de corte, el control negativo y el control positivo están listos para su uso y no deben diluirse Primera incubación Después de haber colocado un número suficiente de pocillos en el soporte, pipetear 50 µl del suero diluido, los controles listos para su uso en los pocillos respectivos; la posición A1 (valor de blanco del substrato) permanece vacía. Usar los controles adecuados (IgG, IgM). Se recomienda realizar el control de corte por duplicado. La placa se incubará en una incubadora durante 60 minutos a 37 C. La base de los pocillos no debe entrar en contacto con materiales capaces de conducir el calor fácilmente. La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación. A1 Valor de blanco del substrato B1 Control negativo C1 Control de corte D1 Control de corte E1 Control positivo F1, G1 Suero del paciente 1, 2, etc. Atención! No coloque la placa de microtitulación en un recipiente de incubación frío que no se vaya a calentar a 37 C hasta que se esté realizando la incubación. El recipiente debe adaptarse a 37 C previamente Lavado Vaciar los pocillos en un recipiente para residuos que tenga una solución de hipoclorito para desinfección. A continuación, dar golpecitos a la placa sobre papel absorbente para eliminar la humedad residual. Después, lavar la placa tres veces RIDASCREEN Chikungunya Virus
8 con 300 µl de búfer de lavado cada vez. Tras cada lavado, dar golpecitos a la placa sobre una sección del papel no utilizada para garantizar un vaciado completo. Cuando se utilice una máquina de lavado, asegurarse de que la máquina esté correctamente configurada para el tipo de placa. Tras el lavado, dar golpecitos a la placa sobre papel absorbente limpio para eliminar la humedad residual Segunda incubación Añadir 50 µl de solución de antígeno del chikunguña Ag LYO preparada Ag LYO a todos los pocillos, excepto a A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación Lavado Lavar tres veces como se describe en el punto Tercera incubación Añadir 50 µl de solución de antígeno del chikunguña Ab SOLN Ab SOLN a todos los pocillos, excepto a A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación Lavado Lavar tres veces como se describe en el punto Cuarta incubación Añadir 50 µl de conjugado de estreptavidina Conjugate a todos los pocillos, excepto a A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). La placa de microtitulación debe cubrirse con la lámina protectora suministrada durante la incubación Lavado Lavar tres veces como se describe en el punto RIDASCREEN Chikungunya Virus
9 9.13. Quinta incubación Añadir 100 µl de substrato Substrate a todos los pocillos, incluido A1 (valor de blanco del substrato). A continuación, incubar la placa durante 15 minutos a temperatura ambiente (20-25 C) a oscuras. Después, añadir 100 µl de reactivo de parada Stop a todos los pocillos para detener la reacción, lo que hace que el color cambie de azul a amarillo. Tras mezclar cuidadosamente la placa (dando golpecitos suaves en un extremo de la placa), la extinción se medirá en un fotómetro para placas a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 nm) en un plazo de 30 minutos. La comparación del valor nulo se efectúa con el valor de blanco del substrato (posición A1). 10. Control de calidad: indicación de inestabilidad o deterioro de los reactivos A efectos de control de calidad, deben realizarse los controles positivo, negativo y de corte cada vez que se efectúe el ensayo. El control de corte se realiza por duplicado y el valor promedio se determina a partir de dos mediciones individuales. El ensayo se ha realizado correctamente cuando los valores de extinción (DO) de los controles cumplen los siguientes criterios: Tabla 3: Criterios para control de calidad DO Valor de blanco del substrato < 0,100 Control negativo < valor de corte Control de corte 0,150 1,300 Control positivo > valor de corte Una desviación de los valores previstos, así como la turbiedad o coloración azul del substrato incoloro antes de la adición a los pocillos, pueden ser un indicador de un reactivo caducado. Si los valores especificados no se cumplen, comprobar lo siguiente antes de repetir el ensayo: Fecha de caducidad de los reactivos utilizados Rendimiento funcional de los equipos utilizados (p. ej., calibración) Ejecución correcta del ensayo Control visual de los componentes del kit para detectar contaminación o pérdidas. Las soluciones de substrato de color azul ya no deben utilizarse. Si, tras repetir el ensayo, las condiciones siguen sin cumplirse, se deberá contactar al fabricante. RIDASCREEN Chikungunya Virus
10 11. Evaluación e interpretación Cálculo del índice de la muestra 1 Se calcula el valor de extinción promedio del control de corte. 2 Dividir la extinción de la muestra del paciente por el valor de extinción promedio calculado para el control de corte. Por ejemplo: Control de corte 1 DO = 0,440 Control de corte 2 DO = 0,420 Valor promedio: = 0,430 Muestras DO = 1,591 Índice de la muestra = 1,591 x10 = 37 0,430 Tabla 4: Análisis del índice de la muestra Negativo Límite Positivo Índice de la muestra < > Limitaciones del método RIDASCREEN Chikungunya Virus ELISA detecta los anticuerpos IgG e IgM contra el virus del chikunguña. No se puede establecer una conexión entre la cantidad del valor de extinción medido y la presencia o intensidad de los síntomas clínicos. Los resultados obtenidos deben interpretarse siempre en combinación con el cuadro y los síntomas clínicos. Un resultado negativo no permite descartar la existencia de infección. Durante la primera etapa de la infección, la producción de anticuerpos puede ser todavía tan baja que la prueba de anticuerpos dará negativo. Por tanto, si existe sospecha clínica, debe ensayarse una muestra de suero de seguimiento. Por norma general, en las pruebas serológicas deben analizarse dos sueros consecutivos del paciente para mejorar la validez del diagnóstico. Para la interpretación de un resultado es muy importante la evolución del título. Un resultado positivo no permite descartar la presencia de otro patógeno infeccioso como causa de una enfermedad. No pueden excluirse reactividades cruzadas con anticuerpos contra Borrelia, CMV, Toxoplasma, VEB y otros alfavirus RIDASCREEN Chikungunya Virus
11 13. Características del rendimiento Tabla 5: Varianza interensayo (n = 12) Varianza interensayo IgG IgM U/ml CV U/ml CV Suero 1 42,7 7,2 % 32,4 4,9 % Suero 2 58,3 8,5 % 27,0 5,8 % Suero 3 2,9 9,6 % 6,0 12,8 % Tabla 6: Varianza intraensayo (n = 24) Varianza intraensayo IgG IgM DO CV DO CV Suero 1 0,384 7,9 % 0,287 8,5 % Suero 2 1,405 5,2 % 0,769 5,8 % Suero 3 1,877 6,3 % 0,618 5,5 % Tabla 7: Sensibilidad y especificidad IgG IgM Sensibilidad 98,7 % 100 % Especificidad 100 % 100 % RIDASCREEN Chikungunya Virus
12 14. Historial de versiones Número de versión Capítulo y designación Versión de lanzamiento 15. Explicación de los símbolos Símbolos generales Para el diagnóstico in vitro Consulte las instrucciones de uso Número de lote Caducidad Temperatura de almacenaje Número de producto Número de ensayos Fecha de fabricación Fabricante RIDASCREEN Chikungunya Virus
13 Símbolos específicos del ensayo Plate Diluent Wash Control IgG + Control IgG - Cut-off IgG Control IgM + Control IgM Cut-off IgM Conjugate IgG Conjugate IgM Ag LYO Ab SOLN Substrate Stop Placa de pocillos Diluyente de muestras Búfer de lavado Control positivo IgG Control negativo IgG Control de corte IgG Control positivo IgM Control negativo IgM Control de corte IgM Conjugado de estreptavidina IgG Conjugado de estreptavidina IgM Antígeno del chikunguña, liofilizado Solución de anticuerpos contra el chikunguña Sustrato Solución de parada RIDASCREEN Chikungunya Virus
14 16. Bibliografía 1. Schlesinger S, Schlesinger MJ. Togaviridae: the viruses and their replication. Fields Virol. 2001;1: Parola P, De Lamballerie, Jourdan J, Rovery C, Vaillant V, Minodier P, u. a. Novel chikungunya virus variant in travelers returning from Indian Ocean islands. Emerg Infect Dis. 2006;12(10): Hochedez P. Chikungunya Infection in Travelers-Volume 12, Number 10 October 2006-Emerging Infectious Disease journal-cdc. 2006; 4. de Lamballerie, Leroy E, Charrel RN, Ttsetsarkin K, Higgs S, Gould EA. Chikungunya virus adapts to tiger mosquito via evolutionary convergence: a sign of things to come? Virol J. 2008;5(1): Epidemiologisches Bulletin 10 / _06.pdf [Internet]. [zitiert 7. April 2017]. Verfügbar unter: blob=publicationfile RIDASCREEN Chikungunya Virus
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