6. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: 5 x 14 ml de tampón citrato-acetato conteniendo peróxido de hidrógeno y sulfato de gentamicina 0,002%.

Transcripción

1 LEER CAMBIOS SOMBREADOS bioelisa RUBELLA IgG colour tests Test de ELISA para la detección cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG anti-rubéola en suero humano. Sumario La rubéola, o sarampión alemán, es una enfermedad infecciosa causada por un togavirus. Cuando afecta a adultos es generalmente trivial y benigna. Sin embargo, la enfermedad tiene implicaciones graves cuando se presenta en mujeres embarazadas, especialmente durante el primer trimestre del embarazo. El virus de la rubéola puede producir una infección intrauterina pudiendo causar muerte fetal, aborto espontáneo o gran diversidad de anomalías congénitas. La identificación e inmunización de mujeres susceptibles es muy importante para prevenir el síndrome de rubéola congénita. La presencia de anticuerpos de la rubéola es indicadora de una infección previa y de supuesta inmunidad. 1,2 La detección de anticuerpos de la rubéola por métodos serológicos permite determinar el estado inmunitario de un individuo respecto a su resistencia o susceptibilidad frente a una infección primaria por virus de la rubéola. Principio bioelisa RUBELLA IgG colour es un test de ELISA para la detección cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG anti-rubéola en suero humano. El ensayo se realiza incubándose la muestra a analizar en un pocillo recubierto con antígeno de rubéola. Si la muestra presenta anticuerpos anti-rubéola, estos se combinarán con el antígeno fijado al pocillo. A continuación, se lavan los pocillos para eliminar la muestra residual y se añaden anticuerpos anti-igg humana marcados con un enzima (conjugado). El conjugado se fijará inmunológicamente a las IgG anti-rubéola que se han unido a los antígenos del pocillo durante la primera incubación. A continuación se lava nuevamente el pocillo para eliminar el material no unido y se incuba con sustrato de enzima que contiene un cromógeno. Esta solución desarrollará color azul si la muestra presenta IgG anti-rubéola. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de IgG anti-rubéola presente en la muestra. La concentración de anticuerpos en la muestra puede estimarse a partir de una curva de calibración. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 5 microplacas de 12 x 8 pocillos recubiertos con antígeno de rubéola inactivado. Pocillos separables individualmente. 2. CONJ 51x CONJUGADO CONCENTRADO: 1 x 1,3 ml de anticuerpos de conejo anti-igg humana conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo, proteínas estabilizadoras, mertiolato sódico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. A diluir 1/51 con el diluyente del conjugado antes de usarse. 3. DIL CONJ DILUYENTE DEL CONJUGADO: 1 x 70 ml de tampón Tris que contiene colorante amarillo, aditivos, mertiolato sódico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. 4. DIL SAMP DILUYENTE DE LAS MUESTRAS: 1 x 120 ml de tampón Tris con detergente. Contiene conservante, colorante púrpura y mertiolato sódico al 0,01%. Listo para usar. 5. WASH SOLN 10x SOLUCIÓN DE LAVADO: 3 x 100 ml de tampón fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sódico al 0,01%. A diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse. 6. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: 5 x 14 ml de tampón citrato-acetato conteniendo peróxido de hidrógeno y sulfato de gentamicina 0,002%. 7. SOLN TMB CROMÓGENO: 1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfóxido (DMSO). Contiene colorante rojo. 8. CONTROL + H CONTROL POSITIVO ALTO: 1 x 5 ml de gammaglobulina humana diluida anti-rubéola. Contiene proteínas estabilizadoras, azida sódica < 0,1%, Triton X-100 < 1,0% y colorante verde. Listo para usar.

2 9. CAL + M CALIBRADOR POSITIVO MEDIO: 1 x 5 ml de gammaglobulina humana diluida que contiene 50 UI/ml de IgG anti-rubéola. Calibrado frente al 1 er Standard Internacional para inmunoglobulina de rubéola suministrado por el NIBSC (Reino Unido). Contiene proteínas estabilizadoras, azida sódica < 0,1%, Triton X-100 < 1,0% y colorante verde. Listo para usar. 10. CAL + L CALIBRADOR POSITIVO BAJO: 1 x 7 ml de gammaglobulina humana diluida que contiene 10 UI/ml de IgG anti-rubéola. Calibrado frente al 1 er Standard Internacional para inmunoglobulina de rubéola suministrado por el NIBSC (Reino Unido). Contiene proteínas estabilizadoras, azida sódica < 0,1%, Triton X-100 < 1,0% y colorante verde. Listo para usar. 11. CONTROL CONTROL NEGATIVO: 1 x 5 ml de gammaglobulina humana diluida, negativa en IgG anti-rubéola. Contiene proteínas estabilizadoras, azida sódica < 0,1%, Triton X-100 < 1,0% y colorante azul. Listo para usar. 12. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la microplaca durante las incubaciones. 13. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. 14. GRAPH HOJA DE PAPEL SEMILOGARÍTMICO: Para realizar la técnica cuantitativa. Precauciones bioelisa RUBELLA IgG colour es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. El Control Positivo Alto, el Calibrador Positivo Medio, el Calibrador Positivo Bajo y el Control Negativo contienen < 0,1% azida sódica y < 1,0%Triton X-100. A continuación figuran las correspondientes frases de riesgo (R) y seguridad (S): R22 S46 Nocivo por ingestión. En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al médico y muéstresele la etiqueta o el envase. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución: - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua. - Usar guantes. - No pipetear ningún reactivo con la boca. - No fumar. - Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121 C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico). - Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. - No usar los reactivos una vez hayan caducado. - No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre los reactivos.

3 - Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. - Es muy importante preparar la solución de sustrato-tmb justo 5-10 minutos antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. - Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-tmb, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable. Conservación y estabilidad Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8 C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8 C. Una vez diluido, el conjugado debe ser utilizado en el mismo día. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustrato-tmb una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utilización. Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada. - Pipetas multicanal y micropipetas (10 µl, 100 µl, 1000 µl) y puntas desechables. - Incubador a 37 C ± 1 C. - Cronómetro. - Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 ó 630 nm. - Sistema de lavado manual o automático. - Solución de parada (ácido sulfúrico 1N). Recolección de la muestra Usar suero fresco o plasma (EDTA). Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20 C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. Procesamiento automático Esta prueba permite su uso de modo automático o semiautomático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25 C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos líquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos. Diluir la solución de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa, mezclar 50 ml de solución de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa, preparar el volumen proporcional de solución. Diluir el conjugado concentrado 1/51 con el diluyente del conjugado, de acuerdo con la tabla 1. Si se utiliza la placa entera, añadir 300 µl del conjugado concentrado directamente al vial que contiene 15 ml de diluyente del conjugado. Mezclar suavemente. TABLA 1 Tiras requeridas Diluyente del conjugado ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Conjugado concentrado µl

4 Monitorización de la adición de las muestras y reactivos El hecho de que el tampón de dilución de las muestras contiene un indicador de color y que todos los controles y reactivos son coloreados permite la monitorización de su adición en la microplaca tanto visualmente como mediante su lectura espectrofotométrica. El diluyente de las muestras tiene un color violeta. Después de la adición del suero o plasma cambiará a color azul. El cambio de color aparece unos segundos después de la adición de la muestra. La intensidad puede variar entre muestras pero el cambio siempre será apreciable. Las muestras diluidas u otro tipo de muestras preparadas puede que no provoquen un cambio de coloración. Para comprobar la adición de la muestra, los pocillos se pueden leer a 620 nm sin filtro de referencia. El conjugado de trabajo es de color naranja. Para monitorizar su adición, los pocillos se pueden leer a 450 nm sin filtro de referencia. El sustrato de trabajo es de color rosa. Para monitorizar su adición, los pocillos se pueden leer a 450 nm sin filtro de referencia. No están validadas monitorizaciones a otras longitudes de onda. NOTA: Cada laboratorio ha de establecer sus propios rangos de referencia. El hecho de que un pocillo no cumpla las especificaciones establecidas, es indicativo de que puede haber ocurrido un problema en la dispensación, que ha de investigarse. Realización de la prueba 1. Utilizar solamente el número de tiras necesario para el test. Reservar 8 pocillos para el blanco, el calibrador positivo bajo y los controles. Si se desea realizar un ensayo cuantitativo, reservar 2 pocillos para el calibrador positivo medio (50 UI/ml). Usar 2 pocillos para probar los controles negativo y positivo alto y tres pocillos para el calibrador positivo bajo. Para el ensayo cuantitativo, usar dos pocillos para el calibrador positivo medio. Pipetear 200 µl de cada control y calibrador en los pocillos correspondientes. Pipetear 200 µl de diluyente de las muestras al resto de los pocillos y 10 µl de cada muestra en los pocillos previamente designados. NO DILUIR LOS CONTROLES Y CALIBRADORES. ESTÁN LISTOS PARA USAR. Dejar vacío un pocillo para el blanco del sustrato. 2. Cubrir la microplaca con una lámina adhesiva, mezclar suavemente, e incubar durante 1 hora a 37 C. 3. Quitar y desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 350 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración y lavado 3 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. 4. Transferir 100 µl de conjugado a cada pocillo a excepción del destinado al blanco de sustrato. Evitar la formación de burbujas. 5. Cubrir la placa con una lámina adhesiva e incubar durante 30 minutos a 37 C. 6. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato-cromógeno. Para una placa, añadir 280 µl de la solución de cromógeno (TMB) a un vial de tampón sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria según indica la tabla 2. LA SOLUCIÓN FINAL ES DE COLOR ROSADO, descartar en caso de que se vuelva azul. TABLA 2 Tiras requeridas Tampón sustrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromógeno (TMB) µl NOTA: El TMB está disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusión del DMSO es de 18 C, el cromógeno debe alcanzar una temperatura de C y agitarse bien antes de usarlo. 7. Quitar y desechar la lámina adhesiva. Aspirar y lavar la placa como en el paso Añadir 100 µl de sustrato-tmb a todos los pocillos, incluso el blanco. 9. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25 C).

5 10. Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-tmb. 11. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromática utilizando filtro de referencia de nm. Control de calidad Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios: 1 Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0, Control negativo: absorbancia menor que 0,100 después de restar el blanco. 3. Control positivo alto: absorbancia igual o mayor que 0,700 después de restar al banco. 4. Calibrador positivo medio: absorbancia igual o mayor que 0,500 después de restar el blanco. 5. Calibrador positivo bajo: absorbancia igual o mayor que 0,150 después de restar el blanco. 6. Relación calibrador positivo medio/calibrador positivo bajo: igual o mayor que 1,4. Resultados cualitativos 1. Calcular la absorbancia promedio del calibrador positivo bajo. El valor que se obtiene es el valor umbral. Valor umbral = CPBx 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: relación absorbancia/valor umbral 1,0 Negativo: relación absorbancia/valor umbral < 0,9 Dudoso: relación absorbancia/valor umbral 0,9 < 1,0 Resultados cuantitativos Para la determinación cuantitativa de la concentración de anticuerpos IgG anti-rubéola: 1. Calcular la absorbancia promedio del calibrador positivo bajo. La concentración de IgG anti-rubéola del calibrador positivo bajo es de 10 UI/ml. 2. Calcular la absorbancia promedio del calibrador positivo medio. La concentración de IgG anti-rubéola del calibrador positivo medio es de 50 UI/ml. 3. Representar en coordenadas lineal-log las medias de las absorbancias de los calibradores en la ordenada (eje de y, lineal) frente a sus respectivas concentraciones en UI/ml en la abscisa (eje de x, log) en la hoja de papel gráfico semilogarítmico incluida en el kit. 4. Trazar una línea pasando por los 2 puntos si se utiliza la hoja de gráfico. Otra opción es realizar una regresión semilogarítmica. 5. La concentración de las muestras entre 10 y 50 UI/ml puede derivarse a partir de las absorbancias respectivas, utilizando la gráfica o regresión semilogarítmica. NOTA: Este test ha sido diseñado para cuantificar la concentración de IgG anti-rubéola entre 10 y 50 UI/ml. La cuantificación fuera de este rango producirá imprecisión. Las muestras de sueros cuyo valor de absorbancia sea superior al del calibrador positivo medio deben ser debidamente diluidas con el diluyente de muestras y reanalizadas, los resultados se multiplicarán por el factor de dilución. Resultado en UI/ml 10 < 9 9 < 10 Interpretación Positivo (inmune) Negativo (no inmune) Dudoso Interpretación de resultados Un ensayo cualitativo realizado en una única muestra puede utilizarse para valorar el estado inmunológico del individuo. Una reacción negativa debe interpretarse como ausencia de anticuerpos frente a rubéola o en una concentración inferior a 10 UI/ml.

6 Una reacción positiva indica la presencia de anticuerpos IgG anti-rubéola, que pueden reflejar tanto una infección antigua como una aguda. Para el diagnóstico serológico de rubéola aguda se recomienda proceder a la determinación cuantitativa en muestras pareadas obtenidas en un intervalo de tiempo de 2-4 semanas. Ambas muestras (de fase aguda y convalecencia) deben probarse al mismo tiempo, en pocillos adyacentes. Un aumento en la concentración de IgG anti-rubéola de 4 veces o más es muy sugestivo de infección reciente. Sin embargo, es aconsejable asociar este procedimiento con la detección de anticuerpos IgM específicos anti-rubéola. Limitaciones del procedimiento Como ocurre con otras pruebas serológicas, los resultados obtenidos con el bioelisa RUBELLA IgG colour sirven solamente como ayuda al diagnóstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clínica del paciente. Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviación puede dar origen a resultados aberrantes. En caso de resultados dudosos se recomienda reanalizar las muestras y si el resultado es equívoco otra vez, debe ensayarse con otro método. Las lecturas de absorbancia son proporcionales al logaritmo de la concentración de anticuerpos (UI/ml). Variaciones menores en las absorbancias pueden llevar a mayores variaciones en el título de anticuerpos. Resultados esperados Cerca del 80% de los adultos jóvenes ya son inmunes a la rubéola, ya sea por infección natural o por vacuna. Los adultos raramente se ven afectados por la rubéola, sin embargo las mujeres en edad fértil pueden adquirir una infección primaria por contacto con niños pequeños. 6 Los datos de prevalencia de la rubéola varían en función del país. Un estudio de revisión indica que la seroprevalencia de la rubéola en mujeres en edad fértil varía desde el 81,1% (Corea), 83,9% (Camerún), 89,6% (España) hasta el 94,3% (Suiza). 7 Características funcionales Evaluaciones El funcionamiento del bioelisa RUBELLA IgG colour se evaluó en estudios comparativos con otros ensayos comerciales. - En una evaluación externa, se probaron 145 muestras previamente caracterizadas con otro método comercial (76 positivas y 69 negativas). De las 76 muestras positivas, 75 lo fueron también con el bioelisa RUBELLA IgG colour y 62 de las 69 negativas fueron también negativas. La concordancia entre ambos métodos fue del 94,4% (137/145). Las 8 muestras discrepantes se comprobaron con otro ensayo comercial. 1 de las muestras fue considerada negativa por consenso mientras que las otras 7 se consideraron positivas. Con referencia al resultado de consenso, la sensibilidad fue del 98,8% (81/82) y la especificidad fue del 98,4% (62/63). Precisión Reproducibilidad intra-ensayo: Los coeficientes de variación obtenidos para los valores de absorbancia de 32 replicados de una muestra positiva fueron del 4,2%, 4,3% y 6,3% en tres lotes estudiados. Reproducibilidad inter-ensayo: Tres muestras positivas de distintos niveles se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos para los ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 6,3%, 2,1% y 3,0%. Interferencias Con el objeto de estudiar posibles interferencias se han analizado muestras con riesgo potencial de producir reacciones cruzadas. Tales muestras incluían sueros positivos de factor reumatoide (RF) y de mujeres embarazadas. No se han observado evidencias de interferencias.

7 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrectos. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 1c. Contaminación cruzada entre controles. 1d. Filtro de lectura incorrecto. 1e. Interferencia en el camino óptico. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Comprobar que el filtro de lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades. Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura. 1f. Se han utilizado No utilizar componentes de componentes de lotes lotes diferentes puesto que diferentes. están ajustados para cada lote en particular. 1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del 2a. Uno o más reactivos no añadidos o añadidos en secuencia equivocada. 2b. Conjugado inactivo: dilución incorrecta o mala conservación. 2c. Microplaca inactiva: conservación incorrecta. 2d. Sustrato inactivo: conservación o dilución incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminación cruzada con la solución de parada. kit. No utilizar kits caducados Comprobar si ha habido contaminación. Comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa bien cerrada, con el descante dentro. Utilizar siempre una dilución fresca de TMB en tampón sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol y enjuagados con agua desionizada.

8 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente. Comprobar que el sustrato de trabajo sea rosa, descártelo si está azul. Asegúrese que el TMB está completamente líquido antes de utilizarlo. Asegurar la correcta mezcla del TMB en el tampón sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solución ácida. 4. Reproducibilidad pobre o elevado número de muestras reactivas que no se repiten. 3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente. 3c. Solución de lavado (1x) contaminada. 3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado. 3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro fabricante. 3f. Dilución incorrecta de las muestras. Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo. Utilizar sólo la solución de lavado de biokit. 4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas o puntas mal encajadas. Técnica de pipeteo incorrecta. 4c. Reactivos y muestras no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar. 4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones. 4e. Demasiado tiempo en la adición de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire. 4f. Interferencia en el camino óptico. Utilizar pipetas calibradas con puntas bien ajustadas. Pipetear cuidadosamente sin burbujas ni salpicaduras. Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos. Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire. Desarrollar una técnica uniforme y consistente. Ver 1e.