Proyecto AGROCYT Caracterización Molecular de las Variedades de Jatropha curcas L. en Guatemala con Fines de Mejoramiento.

Transcripción

1

2 Proyecto AGROCYT Caracterización Molecular de las Variedades de Jatropha curcas L. en Guatemala con Fines de Mejoramiento Informe Final Unidad Ejecutora OCTAGON S.A. Investigadores Ph.D. César Azurdia. Investigador Principal Lic. Ricardo Asturias Pullin. Investigador Principal Ing. Agr. Edgar Barillas. Investigador asociado Ing. Agr. Luis Montes. Investigador asociado Fecha de inicio: enero de 2006 Fecha de finalización: diciembre de 2008

3 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA El presente documento publica los resultados de investigación obtenidos a través del Proyecto de la línea AGROCYT, ejecutado con el apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología FONACYT-, entre los años 2006 y 2008, y se cita de la siguiente manera: Azurdia C., R. Asturias, E. Barillas & L. Montes Caracterización Molecular de las Variedades de Jatropha curcas León Guatemala con Fines de Mejoramiento. Guatemala, Guatemala: Informe Final Proyecto AGROCYT : CONCYT, MAGA, OCTAGON, S.A. & AGEXPORT. pp. 46.

4 Índice Contenido Resumen Summary 1. Introducción 2. Marco teórico 3. Planteamiento del problema 4. Materiales y métodos 5. Resultados y discusión Distribución y conservación Caracterización morfológica y fenológica Contenido y calidad de aceite Caracterización molecular 6. Conclusiones 7. Recomendaciones 8. Bibliografía 9. Apéndice página

5 Caracterización Molecular de las Variedades de Jatropha curcas L. en Guatemala con Fines de Mejoramiento Azurdia, C. 1 ; Barillas, E. 2, Montes, L. 3 Resumen El piñón es una especie nativa de Mesoamérica, que ha cobrado relevancia en los tiempos actuales debido a su importancia como fuente productora de biodiesel a partir del aceite de su semilla. Debido a que es una especie en proceso de domesticación, es necesario conocer su diversidad genética, principalmente aquella contenida en su centro de origen y diversidad. En este sentido, el presente proyecto realizó una colección de materiales nativos de Guatemala y se comparó la diversidad genética de dichos materiales con materiales procedentes de otras regiones del mundo. Los resultados indicaron que en Guatemala existe amplia diversidad genética tanto en el nivel morfológico como molecular. Fue notoria la respuesta en cuanto a producción de semilla ya que se observaron materiales con muy poca producción hasta algunos con producción alta, inclusive mayores que la reportada por el material de referencia mundial conocido como Cabo Verde. La mayoría de caracteres morfológicos medidos muestra en su variación una distribución cercana a la normal, lo cual viene a confirmar la amplia variación y el poco grado de domesticación que presenta el material de origen guatemalteco. Se reporta variación en cuanto a contenido de aceite y al perfil de los ácidos grasos, siendo notorio que el aceite es mas rico en ácidos grasos insaturados, lo cual influye en la calidad del biodiesel producido a partir de este aceite. La formación de diferentes grupos en base a las diferencias identificadas mediante el uso de marcadores moleculares (AFLPs) indica la existencia de diversidad genética. Los materiales genéticos de otros países y áreas del mundo no se diferenciaron de los materiales guatemaltecos, lo cual viene a comprobar que en general el germoplasma de origen guatemalteco es más diverso. Esta información básica permitió identificar a los materiales genéticos mas distantes, los cuales van a ser utilizados como parentales en el desarrollo de cruces necesarios para la elaboración de un mapa genético de la especie. Además, se estableció que desde el punto de vista de diversidad molecular, el sur occidente de Guatemala es la región más variable, por lo tanto dicha región debe de tomarse en 1 Consultor en biotecnología y biodiversidad 2 Biocombustibles de Guatemala 3 Facultad de Agronomía, Universidad de San Carlos de Guatemala

6 cuenta para hacer estudios mas profundos así como desarrollar en dicha área conservación in situ del germoplasma. Molecular Characterization for Improvement of Jatropha curcas L. Varieties in Guatemala Summary Physic nut is a Mesoamerican native species important to produce oil that can be processed for use as a diesel fuel substitute. Due to the fact that this species is under domestication process it is necessary to study its genetic diversity. For this reason, the present research mainly focused on the study of the Guatemalan native germplam. A national germplasm collection was conducted and a germplasm bank was established. All this germplasm was characterized by using morphological and molecular markers (AFLPs markers). The main results indicated that the Guatemalan germplasm showed high genetic diversity in the morphological and molecular level. For example, seed production reported low, intermediate and high levels. The distribution of the morphological traits follow a normal distribution which indicates both the high genetic diversity found and the low domestication level of the studied germplasm. Furthermore, the kernel oil and fatty acids contend showed diversity. Unsaturated acids content is higher than the saturated, which defines some characteristics of the biodiesel produced. The cluster analysis indicated that genetic Asian and African materials do not cluster separated of the Guatemalan genetic materials. In addition, the Guatemalan germplasm collection showed at least 8 different nucleuses. Such information supports the Jatroha curcas Mesoamerican origin. The highest genetic differentiated accessions were identified and they will be used as parental lines in the future genetic improvement program. The south east of the country showed the highest genetic diversity, for this reason, future conservation efforts have to be concentrated in such region. Key words: Jatropha, genetic variability, morphology, oil content, molecular markers, genetic improvement

7 I. Introducción El piñón es una especie probablemente nativa de Mesoamerica, en donde actualmente crece en los cercos de potreros y como delimitante de los huertos familiares de las zonas cálido húmedas y cálido secas. Es poca probable su presencia como parte de la vegetación natural. Debido a los altos costos de los combustibles derivados del petróleo, se ha reconocido la importancia que las fuentes naturales pueden jugar. En este sentido, el aceite obtenido a partir de la semilla del piñón es un importante recurso a considerar en la elaboración de biodiesel. En el nivel mundial se tiene interés en el desarrollo de este cultivo, sin embargo, el mismo carece de información fehaciente sobre su forma de manejarlo así como la inexistencia de variedades mejoradas que pudiesen ser utilizadas. Algunos esfuerzos se están desarrollando en países asiáticos (India principalmente) en donde se conducen estudios de caracterización de germoplasma primordialmente. A sabiendas que el área Mesoamericana es el centro de origen y diversidad de J. curcas, es necesario desarrollar investigación en dicho germoplasma para conocer la diversidad genética presente en el área y utilizarla como materia prima para un programa de mejoramiento y desarrollo de paquetes tecnológicos. Esto es esencial ya que se sabe que la diversidad genética presente en materiales genéticos presentes en otras áreas fuera de su centro de origen, es relativamente reducida. Además, el conocimiento de la diversidad genética y su distribución permitirá tener información básica para planificar de manera más efectiva la conservación de dicho recurso genético. El programa de investigación en piñón fue conducido por la empresa privada Biocombustibles de Guatemala (conocida anteriormente como OCTAGON, S.A.), con el apoyo financiero del programa competitivo AGROCYT, del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) de Guatemala. 2. Marco teórico El conocimiento de la diversidad genética de Jatropha curcas ha sido una preocupación reciente por instituciones e investigadores de diferentes países, en donde ésta especie es importante como una alternativa en la búsqueda de nuevas opciones para el desarrollo de biocombustibles. Un proyecto importante de mencionar es el desarrollado en Nicaragua a partir de 1994 con ayuda financiera de la cooperación Austriaca ( 0Nicaragua.pdf). Este proyecto conducido por el gobierno y la Universidad Nacional de Ingeniería se enfocó en dos componentes, el agrícola y el industrial. Se generó información básica sobre aspectos agrícolas e industriales del cultivo de piñón, sin embargo, al final el

8 proyecto dejó de funcionar por diversas razones. Este fue clausurado en La información inicial conocida para piñón fue sintetizada en la monografía escrita por Heller (1996), en la cual se tratan aspectos relativos a centros de origen, diversidad de germoplasma, usos, mejoramiento, ecología, agronomía y necesidades de investigación, entre otros. Se plantea que el centro de origen y diversidad de esta especie es Mesoamérica. Estudios mas recientes relativos a diversidad genética se condujeron en Nicaragua dentro del programa de piñón ya mencionado (Picado, 1997; Callejas, Jirón y Díaz, 1998; González y Ramos, 2000), estableciéndose la alta diversidad genética existente en materiales de origen mesoamericano. En contraste, Basha y Sujatha (2007) mostraron que en los materiales genéticos provenientes de la India la diversidad genética presente es reducida, por lo cual recomiendan desarrollar estudios con materiales provenientes del centro de origen del piñón. En Guatemala se iniciaron estudios con la variedad Cabo Verde (Alianza en Energía y Ambiente con Centro América AEA- y Octagón, S.A. s.f.), estableciéndose plantaciones en 10 localidades del país. El objetivo fue conocer la respuesta de esta variedad a diferentes condiciones ambientales, específicamente en cuanto a establecimiento de viveros, plantaciones permanentes, presencia de plagas y enfermedades y producción de semilla. Además, se realizaron los primeros análisis de contenido de aceite y perfil de ácidos grasos. Mas recientemente se trabajó en la creación de viveros para la producción de plantas de Jatropha curcas en el nivel regional (AEA y Biocombustibles de Guatemala, 2008). Debido a la importancia que ha adquirido el cultivo del piñón en los años recientes, en el nivel mundial se han desarrollado varias reuniones de expertos para intercambiar información sobre dicha especie. Un evento importante fue el desarrollado en Holanda del 26 al 28 de marzo de 2007 (FACT Foundation, 2007). En él se dieron cita investigadores del mundo relacionados con aspectos relativos a productividad, agronomía y colección de germoplasma. Algunas de las conclusiones más importantes indican que es necesario conocer más a cerca de la agronomía del cultivo así como el desarrollo de materiales genéticos mejorados. 3. Planteamiento del problema Se reconoce que el aceite de Jatropha curcas es una buena fuente alternativa para la elaboración de biodiesel y así disminuir los efectos ambientales y económicos negativos que produce el uso de combustibles fósiles. Sin embargo, se está claro que el piñón es una especie que aún no está domesticada, por lo cual, el establecimiento de plantaciones comerciales requiere del desarrollo de estudios básicos tanto en el aspecto agronómico como industrial. En este sentido, se

9 hace necesario conocer la diversidad genética de dicha especie presente en su centro de origen, tal como lo es Guatemala. Esta información será la base para desarrollar programas de mejoramiento así como para el establecimiento de mecanismos adecuados de conservación de dicho germoplasma. Objetivo general: Conocer la diversidad genética presente en el germoplasma de Jatropha curcas nativo de Guatemala con fines de sustentar un programa de mejoramiento y conservación del germoplasma Objetivos específicos: a. Establecer una colección nacional de germoplasma b. Estudiar la diversidad genética de la colección en base a caracteres morfológicos y moleculares c. Seleccionar los materiales genéticos promisorios que serán la base para un programa de mejoramiento genético 4. Materiales y métodos 4.1 Recolección de muestras y establecimiento del banco de germoplasma Durante el año 2006 se recolectaron tanto muestras de semilla como estacas de piñón distribuidas en todas las regiones del país. Con este material se estableció una colección de germoplasma en la costa sur de Guatemala. 4.2 Caracterización agro morfológica Se elaboró un descriptor que incluía caracteres de tipo morfológico y fenológico. El descriptor utilizado se muestra a continuación: a. Desarrollo vegetativo Altura de la planta (a los 4, 8, 12 y 16 meses). Diámetro de la planta (a los 4, 8, 12 y 16 meses). Patrón de ramificación (abierto, intermedio, cerrado). b. Desarrollo reproductivo Frutos totales por planta. Peso de frutos por planta. Número de semillas por planta. Peso de semillas por planta. Peso de 1000 semillas. Número de semillas por fruto. Tamaño del fruto (largo, diámetro). Tamaño de la semilla (largo, diámetro). Peso de la testa (cáscara).

10 4.3. Contenido y calidad del aceite de la semilla a. Cuantificación del aceite de la semilla. Se utilizó semilla sin cáscara en cantidades variables ( gr), se pusieron en un horno de gas a una temperatura alrededor de 70 grados centígrados, retirándose del mismo al alcanzar la temperatura indicada. Inmediatamente se extrajo la semilla en una prensa hidráulica elaborada en la planta de extracción de biocombustibles de Guatemala. El aceite extraído se peso y se calculó el % presente en la semilla. Además se estableció la cantidad de torta remanente. b. Determinación del perfil de ácidos grasos. La muestra fue derivatizada inicialmente a sus ésteres metílicos, y sometidos a una cromatografía con una columna HP-88 de 100 m x 0.25 um de fase estacionaria, empleando un detector de espectrometría de masas (MSD) y un detector de ionización de llama (FID). Se reporta la composición porcentual basada en el total de ácidos grasos presentes en la muestra. Los datos que se anotan corresponden a los reportados mediante el uso del detector FID. Este análisis se realizó en el Instituto de Investigaciones Químicas, Biológicas, Biomédicas y Biofísicas de la Universidad Mariano Gálvez. c. Análisis complementarios. Se determinó la cantidad de aceite remanente en la torta así como el índice saponificación, humedad y acidez del aceite. Este análisis se condujo en el laboratorio industrial San Cristóbal. 4.4 Caracterización molecular Material vegetal: hojas de brotes nuevos de 53 materiales genéticos de piñón. Extracción de ADN: Método CTAB (Da Silva, 2003), purificación con ribonucleasa A (10mg/mL) y proteinasa K (20mg/mL), y precipitación con etanol absoluto. Verificación de integridad del ADN: Electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Estimación de la concentración y pureza del ADN extraído: Determinación por espectrofotometría utilizando factor de conversión A260nm= 50ug/mL y razón A260nm/A280nm. Amplificación de AFLP: Técnica AFLP (Invitrogen, 2003). Se escogieron 4 combinaciones de partidores para amplificaciones selectivas por PCR de polimorfismos en piñón. Visualización de polimorfismos AFLP: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% desnaturalizante con tinción de nitrato de plata.

11 Lectura de bandas polimórficas (ausencia vrs. presencia) y desarrollo de una matriz básica de datos necesaria para el análisis de grupos y elaboración de un fenograma. El índice de similitud utilizado fue el de DICE (1945), la matriz de similitud se analizó mediante el método UPGMA y los cálculos se realizaron utilizando el programa NTSYS (Exeter Publishing Ltd., Setauket, N. Y. 1992). 5.1 Distribución y conservación 5. Resultados y discusión Recolección y establecimiento del banco de germoplasma Un total de 46 accesiones fueron recolectadas en el territorio nacional proveniente ya sea de semilla botánica o material de reproducción asexual (apéndice I). Las localidades de colecta variaron en un rango altitudinal de 0 a 1600 msnm en cuatro regiones ecológicas (Figura 1). La mayoría de muestras fueron tomadas a partir de cercos que delimitan áreas destinadas a la ganadería y en algunos casos a partir de cercos que delimitan huertos familiares. Figura 1. Distribución de las recolecciones de piñón en la República de Guatemala.

12 5.1.2 Establecimiento de un banco de germoplasma En la Finca San Luis, en el departamento de Retalhuleu, Guatemala, se estableció la colección de campo, la cual incluye el material recolectado así como algunas accesiones procedentes de otros países como India, México, El Salvador, Nicaragua y la variedad comercial denominada Cabo Verde (Figura 2). Figura 2. Establecimiento del banco de germoplasma (colección de campo) Análisis con respecto a áreas potenciales para el cultivo en Guatemala y Centro América En base a los datos de referencia de las accesiones realizadas en el presente proyecto (Figura 1), mediante la utilización del programa Floramap (Jones y Gladkov, 1999), se elaboró el mapa de Guatemala y de Centro América en donde se presentan las áreas potenciales para el cultivo de piñón (Figura 3).

13 Figura 3. Áreas potenciales para la producción de piñón en Centro América Se puede observar que la región comprendida en la bocacosta del Pacífico así como en la parte norte del país que comprende el norte de Alta Verapaz, Izabal y la mayor parte de Petén pueden ser zonas en las cuales el piñón es una especie que se podría adaptar (Figura 3). No necesariamente se indica que son las mejoras zonas para la producción de piñón. La precipitación pluvial es el elemento que define en gran parte las mejoras zonas de producción. Se entiende que las zonas con alta precipitación favorecen el crecimiento del piñón, pero a su vez, la presencia de plagas y enfermedades son factores que complican su cultivo. Por lo tanto, las mejores zonas son aquellas con alta temperatura y lluvias moderadas, en donde, se requerirá de aplicación de riego suplementario. 5.2 Caracterización morfológica y fenológica Desarrollo vegetativo Crecimiento en altura La respuesta en crecimiento de la planta es un factor genético afectado por el ambiente. En este sentido, la Figura 4 muestra la respuesta de cada una de las accesiones del banco de germoplasma sembradas a partir de semilla botánica ante las condiciones ambientales de la localidad en la cual se encuentran ubicados (área de la cabecera departamental de Retalhuleu) durante un período de 349 días después

14 de la siembra de la plántula. Se puede observar en la Figura 5 que las accesiones identificadas por los números 35, 41 y 33 son las que alcanzaron mayor altura de planta, mientras que las identificadas con los números 45, 44 y 43 son las de menor altura. En todo caso la Figura 4 muestra que la tendencia en crecimiento es lineal (curva promedio cercana a los 45 grados). Las que alcanzaron más altura provienen de localidades con alta precipitación (muy similar a las presentes en el área de Retalhuleu) y las de menor de crecimiento son materiales genéticos procedentes de otros países (El Salvador, India y México). MEDICION DE ALTURA Altura (cm) # dias Figura 4. Curvas de crecimiento de las accesiones de Jatropha curcas sembradas a partir de semilla.

15 MEDICION DE ALTURA Altura (cm) # Accesion Figura 5. Alturas reportadas por las accesiones producidas a partir de semilla, después de 349 días de sembradas Crecimiento del diámetro basal de las accesiones obtenidas por semilla Las accesiones identificadas por los números 35, 34 y 33 presentan los mayores diámetros basales (Figura 6), lo cual se debe a la adaptación que han tenido en el área donde se plantaron, la que tiene clima muy similar a sus regiones de origen. A su vez, las accesiones de menor diámetro basal fueron las identificadas como 42, 43 y 44 que proceden de México, Nicaragua e India, respectivamente. Las curvas de crecimiento del área basal del tallo (Figura 7) muestran igual comportamiento para el reportado para crecimiento de tallo.

16 MEDICION DE DIAMETRO BASAL Diametro (mm) # Accesion Figura 6. Crecimiento del diámetro basal de las accesiones obtenida a partir de semilla, a los 349 días después de plantadas. MEDICION DIAMETRO BASAL Diametro (mm) # Dias Figura 7. Curvas de crecimiento del diámetro basal de las accesiones establecidas a partir de semilla.

17 En el cuadro 1 se presenta un resumen de los datos relativos a crecimiento en altura y diámetro del germoplasma de J. curcas estudiado. Cuadro 1 Crecimiento en altura y diámetro de las accesiones de J. curcas sembradas a partir de semilla Identificación Altura promedio Edad promedio Crecimiento diario Diámetro basal Edad promedio Crecimiento diario (cm) (días) (cm/dia) Promedio (mm días) (mm/dia) Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Nicaragua Mexicana India El Salvador Cabo Verde Hábito de crecimiento El hábito de las plantas mas frecuente fue el de tipo arbóreo abierto, sin embargo, una accesión mostró hábito postrado (Figura 8). El material reconocido como Cabo Verde presente un hábito mas compacto, lo cual implica que este material ya ha tenido cierto grado de mejoramiento genético. Figura 8. Izquierda: planta de hábito postrado. Derecha: hábito arbóreo abierto.

18 5.2.2 Desarrollo reproductivo Fruto maduro El cuadro 2 resume las características de los componentes del fruto maduro y húmedo de la colección de germoplasma de J. curcas. Además, las Figuras 9, 10 y 11 proporcionan más información sobre la distribución de la diversidad de los caracteres del fruto. El cuadro 2 muestra que existen algunos materiales genéticos interesantes ya que presentan los frutos mas grandes tales como los identificados como Guatemala 36 y Guatemala 47, sin embargo al revisar la producción de semilla seca de ellos (Cuadro 3) se puede observar que estos no tuvieron buena adaptación a la localidad de caracterización ya que su producción de semilla por planta es casi nula. El material denominado Cabo Verde presenta frutos un poco mas pequeños pero reporta el porcentaje de cáscara mas bajo y el % de semilla por fruto y el peso promedio de semilla húmeda mas altos. Esto viene a comprobar que este material ya tiene cierto grado de mejoramiento, por lo cual es de amplio conocimiento y aceptación mundial. Referente al peso del fruto la Figura 9 muestra que la frecuencia mas alta se encuentra concentrada entre los límites de a gramos. A su vez, la Figura 10 indica que la máxima frecuencia de accesiones presentan un peso de semilla húmeda comprendida entre 1.10 a 1.24 gramos. La distribución de este carácter muestra una grafica tendiente al tipo normal, lo cual significa que los componentes de esta colección han estado principalmente sometidos a la selección natural antes que a selección bajo domesticación. Con respecto al carácter largo del fruto (Figura 11) se estableció que la máxima frecuencia de accesiones presentan los frutos menos largos (rango de a mm) y que dicha frecuencia se va haciendo mas pequeña a medida que los frutos se reportan mas largos.

19 Cuadro 2 Características del fruto maduro de Jatropha curcas % % Peso promedio Peso promedio Nombre Largo (mm) Ancho (mm) Cáscara Semilla Sem. húmeda (g) Fruto h medo (g) Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Madagascar Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Nicaragua India El Salvador Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Cabo Verde

20 Frecuencia Peso fruto humedo (gr) Figura 9. Distribución del peso del fruto de piñón en la colección de campo Frecuencia Peso semilla húmeda Figura 10. Distribución del peso de la semilla (gr) en la colección de campo Frecuencia Largo fruto (mm) Figura 11. Distribución del largo del fruto en la colección de campo

21 Semilla seca El Cuadro 3 muestra que los materiales genéticos identificados como Guatemala 37, Guatemala 9 y Guatemala 10 son aquellos con el peso promedio de semilla seca mas altos. Sin embargo, en el mismo cuadro se puede visualizar que estos materiales no son los de % mas alto de almendra ni tampoco los de mas alta producción de semilla por planta. La figura 12 indica que el carácter peso de semilla seca presenta una distribución normal. Las Figuras 13 y 14 contienen la información referente a la producción de semilla seca por planta. Se puede observar que los materiales genéticos identificados como Guatemala 51 (291 gr.), Guatemala 17 (197 gr.) y Guatemala 15 (187 gr.) son los de mas alta producción. Sin embargo hay que esclarecer que el mejor material genético no solo por su mas alta producción sino porque dicha producción se alcanzó en menor tiempo (316 días) es el Guatemala 51 procedente de Cuilco, Huehuetenango. Por lo tanto, este material viene a constituirse en un material elite a tomarse en cuenta en programas de mejoramiento así como en el establecimiento de plantaciones comerciales Peso gr 14 12No. de accesiones Figura 12. Distribución del peso de la semilla seca de Jatropha curcas

22 Cuadro 3 Datos de semilla seca de Jatropha curcas Semilla seca Peso promedio semilla Edad Semilla Seca Nombre Largo (mm) Ancho (mm) seca (gr) % Almendra % Cascarilla Plantas g/planta Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Madagascar Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Nicaragua Mexicana India El Salvador Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Guatemala Cabo Verde

23 g/semilla seca/planta RENDIMIENTOS X ACCESION (Broton # 1) # Accesion Figura 13. Producción de semilla seca de Jatropha por planta de las diferentes accesiones plantadas por estaca. g/semilla seca/planta RENDIMIENTOS X ACCESION (BROTON # 2) # Accesion Figura 14. Producción de semilla seca de Jatropha de las restantes accesiones del banco de germoplasma plantadas por estaca. De los materiales obtenidos por semilla botánica, se pudo establecer (Figura 15) que los materiales introducidos de otros países como el 53 de Cabo Verde y 31 de Madagascar reportaron los resultados mas altos. La producción reportada para Cabo Verde y para Madagascar se alcanzó durante un período de medición de 407 días. Entonces, se puede adelantar que para la región de Retalhuleu los materiales promisorios en cuanto a producción de semilla seca son los procedentes de Cuilco, Huehuetenango, Cabo Verde y Madagascar. No pudiéndose

24 dejar de lado los materiales procedentes de Tiquisate y Sipacate Escuintla (Guatemala 17 y Guatemala 15 respectivamente) como ya se mencionó. RENDIMIENTOS X ACCESION (SEMILLA) g/semilla seca/planta # Accesion Figura 15. Producción de semilla seca por planta de las accesiones del banco de germoplasma plantadas a partir de semilla. En el Cuadro 4 se anota un resumen de las características de los caracteres morfológicos y fenológicos medidos en la caracterización del germoplasma de J. curcas conducidos en Retalhuleu. Es notorio que los caracteres mas variables son el ancho de la semilla, el % de cáscara y el % de semilla en relación al peso total del fruto. Cuadro 4 Resumen de las características morfológicas de algunos caracteres medidos en el germoplasma de Jatropha curcas Carácter Media Rango Desviación Estándar Coeficiente de Variación Largo fruto (mm) Ancho fruto (mm) % de cáscara % de semilla Peso promedio semilla

25 húmeda (gr) Peso promedio fruto húmedo (gr) Largo semilla seca (mm) Ancho semilla seca (mm) Peso promedio semilla seca (gr) % de almendra % de cascarilla Altura promedio planta a 349 días (cm) Diámetro basal promedio a los 349 días (mm) Contenido y calidad de aceite Cuantificación de aceite de semilla y contenido de torta. Se presentan datos para 43 muestras ya que no todas las accesiones estudiadas produjeron suficiente semilla para su análisis (Cuadro 5). El aceite total reportado (el extraído directamente de la semilla mas el contenido en la torta) varía en un rango de a %, con una media de %. Los materiales con mayor producción de aceite corresponden a uno procedente del departamento de Jutiapa (No.6, 46 % de aceite), del departamento de Escuintla ( No. 16, % de aceite) y del departamento de Santa Rosa (No. 7, % de aceite). Por el contrario, los de menor producción fueron Cabo Verde (No. 53, % de aceite), un material procedente de Sanarate, El Progreso (No. 30, % de aceite) y el procedente de Madagascar (No. 31, % de aceite). La distribución de la variación del carácter contenido de aceite de semilla se aprecia en la Figura 16. La variación del contenido total de aceite y contenido de torta se observa en la Figura 17. La bibliografía reporta diferentes datos para producción de aceite. La mayor información proviene de experimentos realizados en India, en donde se supone que la variabilidad genética existente es baja; sin embargo, dichos datos son sumamente variables (Jongschaap et al., 2007). En este sentido, el dato de contenido de aceite debe ser tomado con sumo cuidado cuando se hacen proyecciones de producción por hectárea ya que es necesario contar con datos efectivos en cuanto a tamaño de la semilla, número de semillas /fruto, no. de frutos/árbol. De lo contrario se pueden hacer estimaciones erróneas. Revisando la producción de frutos reportados en la parte concerniente a caracterización morfológica, es notorio que la accesión con mayor

26 producción de semilla por planta (No. 51, procedente de Cuilco, Huehuetenango) alcanza una producción de aceite por semilla ligeramente por encima de la media reportada para los diferentes materiales caracterizados. Por el contrario, el material denominado Cabo Verde (de alta producción de semilla/planta) reporta el % de aceite mas bajo. Cuadro 5. Contenido de aceite y torta en semilla de piñón (Jatropha curcas) Identificación % aceite % torta % aceite torta Total aceite (%)

27 No. de accesiones % de aceite Figura 16. Variación en el contenido de aceite de semilla en las accesiones de Jatropha curcas % Contenido torta Contenido total de aceite Figura 17. Contenido total de aceite y torta en semilla de Jatropha curcas.

28 Perfil de ácidos grasos. El reporte del laboratorio muestra presencia de varios ácidos, sin embargo, algunos de ellos en cantidades muy pequeñas por lo que se anotan los más importantes (Cuadro 6). Estos resultados varían en cierto grado con datos promedio reportados en la literatura ( esel y Salimon y Abdullah (2008). No hay que olvidar que los resultados del presente trabajo de investigación corresponden a materiales genéticos procedentes de la región considerada como el centro de variabilidad de esta especie. El Cuadro 7 muestra un resumen de los resultados reportados por los principales ácidos saturados e insaturados. Los ácidos saturados representados por palmítico y estéarico reportan valores variables en las accesiones caracterizadas (Figura 18). Se considera que valores altos de ácidos saturados corresponden a alto índice de cetonas lo cual implica mejor habilidad de ignición, sin embargo, en aceite de Jatropha curcas es más alto el contenido de ácidos insaturados (Figura 20). Sin embargo, este último elemento hace que dicho aceite produzca biodiesel que se solidifica a temperaturas mas bajas comparadas con el biodiesel producido con aceite de alto % de aceites saturados. Los ácidos grasos insaturados mas importantes son el oleico y linoleico, estando por lo general el primero en menor cantidad que el segundo (Figura 19), sin embargo, algunas veces se reporta mayor contenido de oleico que linoleico. Este es el caso para las accesiones identificadas como 20, 21, 22 y 25 (Cuadro 6 y Figura 19). Los datos reportados para acidez del aceite (Cuadro 6) van a variar dependiendo del tiempo trascurrido entre la cosecha y el momento de extracción. Enzimas activas en la semilla descomponen los triglicéridos en presencia de agua para convertirlos en ácidos grados. Este proceso se acelera principalmente cuando el clima es cálido. Por esta razón es recomendable extraer el aceite de la semilla de Jatropha curcas lo más antes posible después de la cosecha.

29 No. Accesión Saturados Insaturados Palmítico Estéarico Total Oleico Linoleico Linolénico Palmitoleico Total Acidéz %

30 Cuadro 6. Perfil de ácidos grados del aceite de Jatropha curcas

31 % 8.00 Acido palmítico Acido esteárico Figura 18. Variación de los principales ácidos saturados en aceite de Jatropha curcas % Acido linoleico Acido oleico Figura 19. Variación de los principales ácidos insaturados en aceite de Jatropha curcas.

32 % Acidos grasos saturados Acidos grasos insaturados Figura 20. Variación en el contenido de ácidos grasos saturados e insaturados en aceite de Jatropha curcas Cuadro 7. Resumen de datos relativos a ácidos saturados e insaturados en aceite de Jatropha curcas Acido Media (n= Mínimo Máximo 43) % Palmítico Estéarico Acidos saturados Oleico Linoleico Palmitoleico Acidos insaturados Análisis complementario Los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 8. Referente al índice de saponificación se reporta una media de , con un rango de 191 a 198. Este valor representa la cantidad de ácidos grasos presentes en un gramo de aceite. El valor reportado coincide con los datos disponibles en la literatura

33 32 ( ). El contenido de humedad reportado es variable, sin embargo, se recomienda disponer de aceite con el contenido mas bajo de humedad. Cuadro 8. Otros datos del aceite de Jatropha curcas. Accesiòn Acidéz % Indice de saponificación % de humedad

34 Caracterización molecular La caracterización morfológica y fenológica presenta el problema que la respuesta medida es una función de la interacción genotipo ambiente, especialmente los caracteres de tipo cuantitativo. Por lo tanto, los resultados obtenidos pueden variar de una localidad a otra. En este sentido, se recomienda conducir estudios con marcadores que midan la diversidad a nivel de ADN, es decir, marcadores moleculares, los cuales tienen la ventaja de no ser influenciados por el ambiente. El uso de marcadores moleculares tipo AFLPs permite acceder a una técnica poderosa con la cual se pueden obtener resultados con alta repetitividad en tiempos relativamente cortos. Esta técnica es recomendada en especies que no cuentan con estudios en el nivel bioquímico y molecular (caso del piñón), ya que los resultados obtenidos utilizando AFLPs en otras especies son similares a los que se han obtenido utilizando otras técnicas bioquímicas (proteínas de almacenamiento, isoenzimas) y moleculares (RAPDs y RFLPs) (Azurdia, Bliss y Debouck, 1999; Azurdia et al., 1999; Azurdia et al., 2005; Guzmán et al., 2005). Los resultados mostrados en el Cuadro 9 indican que el germoplasma de J. curcas presenta alta variabilidad, ya que tan solo con la utilización de cuatro amplificaciones selectivas se obtuvieron 38 bandas polimórficas. Esto era de esperarse si se anticipa que esta especie es nativa de Mesoamérica como se ha discutido, así como porque se conoce que el sistema de cruzamiento de esta especie es alógamo predominantemente (Chang-Wei et al., 2007). Detalle de las bandas polimórficas se muestran en las Figuras 21 a 24. Cuadro 9 Combinación de partidores para las 4 amplificaciones selectivas No. Bandas Amplificación Polimórficas Selectiva Visualizadas AS6 10 AS5 9 AS4 6 AS3R 13

35 34 Figura 21. Amplificación del primer AS3R Figura 22. Amplificación del primer AS4

36 35 Figura 23. Amplificación del primer AS5 Figura 24. Amplificación del primer AS6

37 Figura 25. Diversidad genética de Jatropha curcas utilizando marcadores moleculares AFLPs. 36

38 37 El fenograma mostrado en la Figura 25 indica que existe alta diversidad genética entre todos los materiales genéticos analizados. Así, se cuenta con un rango de similitud genética que va desde 0.14 hasta 0.91, siendo el material identificado con el número 28 el más variable y los identificados con los números 18 y 20 como los más similares. Así mismo, se puede observar en dicha figura que se conformaron 8 grupos, siendo el más numeroso el número 1. En este grupo se encuentran localizados todos los materiales genéticos provenientes de otros países, no observándose ninguna formación de subgrupos que los diferencie de los materiales de origen guatemalteco. Por ejemplo, el material reconocido mundialmente como procedente de Cabo Verde es muy parecido a los materiales genéticos procedentes de India, Nentón, Cuilco y Nicaragua. Estos resultados son importantes si se piensa en el origen de esta especie ya que como se ha anotado, los materiales de origen africano y el de Asia (India) no se diferencian de los de origen Mesoamericano (El Salvador, Nicaragua, México y de una buena proporción de materiales de origen guatemalteco). De esta manera esta puede ser una evidencia que el origen de esta especie es precisamente Mesoamérica como ha sido previamente planteado por Heller (1996). Evidencia mas reciente es mostrada por Montes et al. (2008). Dichos autores mencionan que accesiones provenientes de Mesoamérica y sud América muestran mucha mas variación genética que la presente en accesiones provenientes de otras regiones del mundo. En párrafos anteriores se mencionó que los materiales que alcanzaron a producir mayor cantidad de semilla por planta fueron el no. 51 procedente de Cuilco, Huehuetenango y la variedad Cabo Verde (no. 53). Es interesante anotar que en la Figura 25 se puede observar que ambos materiales genéticos reportan bastante similitud ya que ambos se encuentran conformando un mismo cluster perteneciente al subnucleo El núcleo 3 está constituido por materiales de Izabal y de la costa sur occidental de Guatemala. Se sabe que la presencia de piñón está asociada a desarrollo ganadero, por lo cual se puede suponer que los materiales llevados a Izabal puedan provenir de explotaciones ganaderas previamente establecidas en la costa sur occidental. Los núcleos 4 y 5 están constituidos principalmente por materiales genéticos provenientes del sur oriente de Guatemala. Sin embargo, en los otros grupos del fenograma se observan distribuidos materiales genéticos del sur occidente de Guatemala, por lo cual se puede plantear que la región de Guatemala con mayor diversidad es la ubicada precisamente en los departamentos del sur occidente de Guatemala. Este análisis se complementa y comprueba con los análisis de diversidad y riqueza presentes en las Figuras 26 y 27 en donde se precisa que la mayor riqueza y diversidad basada en marcadores moleculares se encuentra en el departamento de Santa Rosa. Por lo cual dicha región deberá de tenerse en cuenta para efectos de conservación in situ (huertos