Mapeo genético en Drosophila. Mapeo de tres puntos

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1 Mapeo genético en Drosophila. Mapeo de tres puntos Coordinadora: Dra Beatriz Goñi Sección Genética Evolutiva OBJETIVOS: Determinar la posición de cada mutación incógnita en el mapa de recombinación de genes ligados al cromosoma X mediante el cruzamiento de tres puntos. CRITERIOS 1. El genotipo del organismo que produce los gametos productos del crossingover debe ser HETEROCIGOT PARA TODOS LOS LOCI. 2. El cruzamientos debe construirse de tal manera que EL GENOTIPO DE TODOS LOS GAMETOS PUEDAN DETERMINARSE DE MANERA PRECISA al observar el fenotipo de la progenie. Cada clase fenotípica debe reflejar el genotipo de los gametos producidos por los parentales 3. Se produzca un suficiente número de progenie en el mapeo experimental que recobre una muestra representativa de todas las clases de crossingovers.. CONCEPTOS El cruzamiento de tres puntos permite determinar el ORDEN de los genes. Los tipos de gametos parentales estarán necesariamente en mayor frecuencia. Detemine el tipo de configuración de las marcas (cis o trans) parentales. La habilidad de identificar las dos clases recíprocas de progenie parental y las dos clases de progenie dobles crossing-over le permitirá determinar el orden de los genes de los tres loci. El cruzamiento de tres puntos permite hallar la DISTANCIA en el mapa de ligamiento por la frecuencia de crossing-over o cromosomas recombinantes entre loci ligados. Si uno asume que la probabilidad de que ocurra un crossing-over entre dos loci, ello es directamente proporcional a la distancia entre los dos loci, Probabilidad de crossing-over = K (distancia) donde K es una constante proporcional, entonces uno podría PREDECIR que las distancias de mapa serían aditivas. CERTEZA en los experimentos de mapeo. Como la frecuencia máxima de recombinación detectable entre pares de genes ligados es de 50 %, para genes a distancias mayores a las 20 unidades de mapa, la ocurrencia de múltiple crossing-over no se detectaría y subestimaría las distancias reales entre loci. Por lo tanto, la construcción de mapas genéticos certeros provienen de experimentos con genes que están muy próximos unos de otros. La predicción de las distancias de mapa entre pares de loci funciona para distancias menores a 10 ó 20 unidades de mapa. Hay otro factor que afecta los datos de mapeo. Este factor involucra la reducción del número esperado de dobles crossing-over cuando los genes están bastante cerca unos de otros en el cromosoma. Esta reducción, de denomina INTERFERENCIA, y puede ilustrarse en experimentos de mapeo de tres puntos. 1

2 La interferencia es el efecto en el cual la ocurrencia de un crossing-over en cierta región reduce la probabilidad de un crossing-over en una región cercana. El concepto de interferencia es cuantificada mediante la proporción entre los DCOobs/DCOesp. Esta proporción se llama coeficiente de coincidencia: C= DCOobs /DCOesp Una vez que C esta calculada, interferencia (I) se cuantifica usando una ecuacion simple: I= C Si la interferencia es completa, no se producen dobles crossing-overs, entonces I= 1.0. Si se observan menos crossing-over dobles (DCOobs) que los esperados (DCOesp), entonces I es un número positivo, y la Interferencia es positiva. Si se observan mas dobles crossing-overs esperados que los esperados, entonces I es un número negativo y la Interferencia en negativa. En los sistemas eucariotas, la interferencia positiva es la mas frecuentemente observada. Mapeo de tres puntos. TAREAS EXPERIMENTALES Se conformarán grupos de trabajo de DOS alumnos. Se analizarán TRES LOCI incógnitas con ligamiento en el cromosoma X. La posición de estos loci en el mapa de recombinación se hallará experimentalmente mediante el cruzamiento de tres puntos. Para ello se utilizará una cepa marcadora que porta DOS mutaciones (que afectan genes diferentes a las mutaciones incognitas ) ellos son: crossveinless, cv y forked, f. Obtenga información genética sobre estos dos genes en la pagina web: Ello será importante para discutir el mapa de recombinación de los loci involucrados en este práctico. PROCEDIMIENTO: El experimento de mapeo de tres puntos consta de: DOS cruzamientos y un total de TRES generaciones (Parental, F1 y F2). (SEMANA 1) Primer cruzamiento (parental) EXAMINE moscas de las cepas mutantes #1, #2, y #3, cepa marcadora, cv f Identifique el carácter mutante en cada una de ellas con respecto a moscas cepa salvaje. Construya TRES cruzamientos, empleando individuos de las CEPAS PURAS (parentales). Realice un cruzamiento por cada cepa mutante (locus incógnita), #1, #2, y #3, de la siguiente manera (llene TABLA): Cruce hembras vírgenes cv f x machos incógnita #1 ó #2 ó #3 Prepare un tubo por cada tipo de cruzamiento. Utilice 8-10 vírgenes (se las brinda el docente) y por cada tubo. Proporcione Ud los machos en este cruzamiento. Anestesie individuos de las cepas mutabtes y examine cuidadosamente el sexo de los individuos. 2

3 (SEMANA 2) Elimine las moscas parentales antes de los siete días siguientes al cruzamiento. Tire las moscas a la morgue. Coloque papel absorbente en el medio de cultivo para proporcionar superficie para la pupación de las larvas. (SEMANA 3) Observación de la F1 y segundo cruzamiento. Anestesie SUAVEMENTE la progenie del cruzamiento anterior Cual es el fenotipo observado en los individuos F1, y qué conclusiones obtiene? Si su mutación se encuentra en el cromosoma X no necesita colectar F1 vírgenes para el siguiente cruzamiento, porque? Cruce F1 x F1 del cruzamiento anterior, realice DOS tubos con 8-10 moscas de cada sexo por loci incógnita (total seis tubos). (SEMANA 4) Elimine las moscas F1, siguiendo el procedimiento = SEMANA 2. (SEMANA 5 ) Observación y análisis de la F2 y mapeo de los loci incógnitas Anestesie la progenie F2 del cruzamiento realizados en la clase anterior. Siga un orden establecido, primero los tubos cruzamiento #1, luego #2, y #3. Examine UN TUBO por vez. En cada caso, separe los machos de las hembras ( porque?). Luego clasifique los individuos en las distintas clases fenotipicas. COMO CLASIFICAR las moscas? Para facilitar este trabajo, separe PRIMERO el fenotipo de más fácil identificación, luego, el siguiente. Dentro de cada grupo identifique a su vez si porta algun(s) carácter(es) mutante(s) no considerados en la clasificación previa, y así sucesivamente. Coloque los datos en la TABLA, donde ha determinado previamente las clases fenotipicas y los genotipos esperadas en la progenie de cada experimento. En base a SUS DATOS, calcule el orden correcto de los genes en cada experimento y la distancia entre los loci involucrados. Calcule el coeficiente de coincidencia y determine si hubo interferencia positiva, neutra o negativa. Dibuje el mapa genético y muestre las distancias de recombinación entre los pares de loci adyacentes en cada experimento. Finalmente, CONSTRUYA el mapa de recombinación PROBABLE para el total de CINCO loci empleados en el práctico. Discuta los datos obtenidos utilizando los datos del mapa genético conocido para los genes marcadores utilizados, cv f. Podría identificar los genes candidatos a cada loci analizados con los datos obtenidos, provea de hipotesis? BIBLIOGRAFIA A Database of Drosophila Genes & Genomes. Essentials of Genetics (5th Edition) [Paperback] William S. Klug (Author) and Michael R Cummings. Ver Chaper: Linkage and Chromosome mapping. Concepts of Genetics...William S. Klug (Author) and Michael R Cummings. Ashburner, M. (1989). Drosophila: A Laboratory Handbook and Manual. Two volumes. : xliii pp; 434pp. ( Recombinacion en hembras Drosophila ). 3

4 TABLA DATOS del Cruzamiento de Tres Puntos para el Mapeo Genético del LOCUS #... Cruzamiento x parental (genotipo) (genotipo) Fecha: Cruzamiento F1* x F1 (genotipo) (genotipo) Fecha: *Indique el genotipo de la hembra F1, mostrando el orden correcto de los genes: Progenie F2, Fecha: Fenotipo: Genotipo: Número de moscas: Parental Parental Crossing-over, Región I Crossing-over, Región I Crossing-over, Región II Crossing-over, Región II Crossing-over Doble, RI+RII Crossing-over Doble, RI+RII TOTAL: Describa AQUÍ el mapa genético obtenido: 4

5 Diagrama del mapa genético parcial de los cuatro cromosomas de D. melanopgaster y la correspondencia con los cromosomas mitóticos. 5

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