25,4 b 5,9 pr 19,5 c 23,7 1

Transcripción

1 25,4 b 5,9 pr 19,5 c 23,7 1

2 Objetivos tema 8: Cartografía (mapas) genéticos Deberán quedar bien claros los siguientes puntos En qué se fundamenta un mapa genético Cómo calcular las frecuencias de recombinación en loci ligados Construcción de mapas genéticos a partir de cruzamientos pruebas de 2 y 3 factores (puntos) Interferencia y coeficiente de coincidencia Análisis de tétradas en hongos ascomicetos Cartografía genética en humanos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 2

3 Dos mapas mejor que uno. Mapa del metro y de calles de Londres Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 3

4 Mapas genéticos y físicos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 4

5 A A a a B B b b Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 5

6 Cartografía genética (gene mapping) La cartografía genética asigna el lugar cromosómico de un gen (o locus) y su relación de distancia con otros genes (o loci) en un cromosoma dado A. Sturtevant (1913). La distribución y el orden lineal de los genes se pueden establecer experimentalmente mediante el análisis genético Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 6

7 Gametos resultantes de doble heterocigoto de genes no ligados 50% parentales y 50% recombinantes A B a b AB ab AB Ab ab ab AB Ab ab ab 25 % 25 % 25 % 25 % Gametos resultantes de doble heterocigoto de genes ligados x % y % y % x % La fracción de gametos recombinantes es impredecible a priori X e Y dependen de los genes considerados Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 7

8 Supuesto: las frecuencias de entrecruzamiento, y por tanto la frecuencia de recombinación, depende de la distancia entre genes A B C Unidad de distancia: La unidad de mapa (u.m.) o el centimorgan (cm) --> La distancia entre genes (loci) en los que la frecuencia de recombinación es del 1% Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 8

9 Meiosis A C B C Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 9

10 Mayor distancia entre loci --> Mayor número de entrecruzamientos Más Entrecruzamientos ---> Más Recombinación A mayor frecuencia de recombinación mayor la distancia entre loci El número de entrecruzamientos por meiosis y por cromosoma se puede representar por una distribución aleatoria de Poisson, con media p( i) Distancia e i i! p( ) FR 1 FR (1 e ) 2 ln(1 2FR) Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 10

11 Mapa a partir de cruzamientos prueba de dos puntos (dos loci en el mismo cromosoma) Se determina la distancia 2 a 2 entre loci y éstas se suman para estimar la distancia genética total de un cromosoma A B Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 11

12 Cruzamiento de T. Morgan Ejemplo: pr = Ojos Púrpura vg = Alas vestigiales Ambos alelos son recesivos respecto al salvaje P pr + pr + vg + vg + X pr pr vg vg F 1 pr + pr vg + vg X pr pr vg vg Fenotipos F 2 pr + vg pr vg 1195 pr + vg 151 pr vg Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 12

13 Mapa de dos puntos Metodología 1. Normalmente heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> AB/ab X ab/ab 2. No se observa en la F 2 la proporción fenotípica 1:1:1:1, y la proporción no es predecible a priori porque depende de la distancia entre los genes estudiados 3. Las dos clases mayoritarias corresponden a los gametos no recombinantes (parentales), y las minoritarias a los recombinantes (no parentales) 4. La frecuencia de recombinación (recombinantes/total X 100) refleja la distancia genética entre los dos genes. Una unidad de mapa o centimorgan (1cM) = 1% de recombinantes 5. Se pueden ordenar tres genes o más genes cuyas distancias se han medido dos a dos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 13

14 Fenotipos F 2 pr + vg pr vg 1195 pr + vg 151 pr vg parentales recombinantes Proporción no igual a 1:1:1:1. Un test de 2 = 1037,18 es muy significativo, p < FR (frecuencia de rec) = 305/2839 = 0,107 = 10,7 cm pr vg 10,7 cm Tema 8: Cartografía genética Antonio Barbadilla 14

15 The first genetic linkage map (A.H. Sturtevant 1913 Journal experimental Zoology) Cuál es la distancia entre ambos genes? Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 15

16 Orden de los genes Se han estudiado tres pares de genes en experimentos de dos puntos y éstas son las distancias entre ellos (los genes se comparten entre experimentos): distancia A-B = 12; distancia B-C = 7; distancia A-C = 5 y Cuál es el orden de los genes? Las distancias deben ser aditivas y consistentes entre sí Supongamos las tres ordenaciones posibles Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 16

17 Orden de los genes Ordenaciones posibles Caso 1: Marcador A está en el medio: B A A 12 5 B C 7 C Caso 2: Marcador B está en el medio: A A 5 12 C Caso 3: Marcador C está en el medio: A A 5 12 C 7 C Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 17 B B B B C 7 Aditividad

18 Las distancias de mapa no son completamente aditivas A B C A FR = x FR = y C FR < x + y 25,4 La mejor estima distancia, suma (b-pr) + (pr-c) b 5,9 pr 19,5 c 23,7 Distancia experimento dos puntos b-c Antonio Barbadilla 18

19 Relación entre frecuencia de recombinación y entrecruzamiento (o distancia real de mapa) Las distancias de mapa no son completamente aditivas porque los dobles recombinantes entre dos marcadores A y C no se detectan en un cruce de dos puntos, subestimándose la distancia A y C A B C A B C A B C A b C a b c a b c a B c a b c La relación entre la distancia real de mapa (número de entrecruzamientos) y la frecuencia de recombinación entre dos marcadores o loci no es lineal. Cuanto más lejos están los marcadores peor es la estima La frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50% FR 0,5 Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 19

20 Función de mapa (de Haldane) Es una función que permite estimar la distancia de mapa mejor que empleando solamente la frecuencia de recombinación, pues corrige los intercambios (entrecruzamientos) no detectados FR observada (%) FR (1 e 2 ) =1 =2 =3 =4 Número medio de entrecruzamientos por meiosis entre los dos loci Unidades de mapa reales Antonio Barbadilla 20

21 Demostración función de mapa FR 1 (1 e ) 2 ln(1 2FR) λ = Número medio de entrecruzamientos por meiosis entre los dos loci (suponemos distribución de Poisson para el número de entrecruzamientos por meiosis) Antonio Barbadilla Probabilidad uno o más entrecruzamiento entre los dos loci 1 FR (1 e 2 ) 1 = 2 (1 e ) 21

22 Por qué la frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50%? Demostración 1: caso completo para 1 ó 2 entrecruzamientos 3 entrecruzamientos pueden descomponerse en 1 + FR promedio de un doble 2 entrecruzamientos y por entrecruzamiento = 8/16 = tanto darán lugar también a 50% recombinantes. El 50% razonamiento es generalizable a n entrecruzamientos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 22

23 Por qué la frecuencia de recombinación (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50%? Demostración 2: Muchos entrecruzamientos (infinito en el límite) entre a y b Es igual de probable cualquier combinación, ++, ab, a+, +b, es como si segregaran independientemente ambos loci. Luego, la FR máxima es 50% Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 23

24 Función de mapa Es una función que permite estimar la distancia de mapa mejor que empleando solamente la frecuencia de recombinación, pues corrige los intercambios (entrecruzamientos) no detectados FR observada (%) FR (1 e 2 ) Zona de linealidad =1 =2 =3 =4 Número medio de entrecruzamientos por meiosis entre los dos loci Unidades de mapa reales Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 24

25 Aplíquese la corrección de Haldane en este mapa de tres marcadores 1 FR (1 e ) 2 ln(1 2FR) 25,4 La mejor estima distancia, suma (b-pr) + (pr-c) b 5,9 pr 19,5 c 23,7 Distancia experimento dos puntos b-c De la corrección efectuada, a qué conclusión se llega si se quieren elaborar mapas genéticos fiables? Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 25

26 Mapa a partir de cruzamientos prueba de tres puntos (tres loci en el mismo cromosoma) Metodología 1. Triple heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> ABC/abc X abc/abc 2. Si hay ligamiento, no se observa en la F 2 la proporción fenotípica 1/8 para cada tipo de gameto A B C 3. Se agrupan las clases recíprocas (aquellas que tienen un fenotipo mutante en el par recíproco, como el par de fenotipos fenotipos ABC-abc ó Abc-aBC. Las clases recíprocas deben ser de frecuencia parecida 4. Orden de los genes: Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los más frecuentes Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados, el gen del medio es el que está cambiado 5. Distancias de mapa: a la distancia entre genes consecutivos debe sumarse las frecuencias de los dobles entrecruzamientos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 26

27 Ejemplo 1. Triple heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> ABC/abc X abc/abc 2. Si hay ligamiento, no se observa en la F 2 la proporción fenotípica 1/8 para cada tipo de gameto Tres mutantes marcadores pr = Ojos Púrpura; b = Cuerpo negro; c = curved, alas curvadas Los tres alelos son recesivos respecto al salvaje P pr + pr + b + b + c + c + X prpr bb cc F 1 pr + pr b + b c + c X pr pr bb vg vg F 2 Si no están ligados 1/8 prpr bb cc 1/8 prpr bb c+c 1/8 pr+pr bb cc 1/8 pr+pr bb c+c 1/8 prpr b+b cc 1/8 prpr b+b c+c 1/8 pr+pr b+b cc 1/8 pr+pr b+b c+c Si están ligados completamente 1/2 pr+pr b+b c+c 1/2 prpr bb cc Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 27

28 Resultados del cruzamiento prueba, F 2 3. Se agrupan las clases recíprocas (aquellas que tienen un fenotipo mutante en el par recíproco, como el par de fenotipos fenotipos ABC-abc ó Abc-aBC. Las clases recíprocas deben ser de frecuencia parecida Fenotipo Genotipo Número Número de recombinantes entre b-pr pr-c b-c Salvaje pr + pr b + b c + c 5701 Black, purp, cur prpr bb cc 5617 Purp,curved prpr b + b cc Black pr + pr bb c + c Curved pr + pr b + b cc Black,purp prpr bb c + c Purp prpr b + b c + c Black,curved pr + pr bb cc Total Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 28

29 Resultados del cruzamiento prueba, F 2 4. Orden de los genes: Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los más frecuentes Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados (los que difieren sólo en un fenotipo), el gen del medio es el que está cambiado A B C A B C a b c a b c A B C A b C a B c a b c Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 29

30 Resultados del cruzamiento prueba, F 2 4. Orden de los genes: Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los más frecuentes Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados (los que difieren sólo en un fenotipo), el gen del medio es el que está cambiado Fenotipo Genotipo Número Número de recombinantes entre b-pr pr-c b-c Salvaje pr + pr b + b c + c 5701 Black, purp, cur prpr bb cc 5617 Purp,curved prpr b + b cc Black pr + pr bb c + c Curved pr + pr b + b cc Black,purp prpr bb c + c Purp prpr b + b c + c Black,curved pr + pr bb cc Antonio Barbadilla El gen pr está en el medio Tema 8: Cartografía genética 30

31 Resultados del cruzamiento prueba, F 2 4. Orden de los genes: Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los más frecuentes Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados (los que difieren sólo en un fenotipo), el gen del medio es el que está cambiado Fenotipo Genotipo Número Número de recombinantes entre b-pr pr-c b-c Salvaje pr + pr b + b c + c 5701 Black, purp, cur prpr bb cc 5617 Purp,curved prpr b + b cc Black pr + pr bb c + c Curved pr + pr b + b cc Black,purp prpr bb c + c Purp prpr b + b c + c Black,curved pr + pr bb cc Antonio Barbadilla El gen pr está en el medio Tema 8: Cartografía genética 31

32 Resultados del cruzamiento prueba, F 2 5. Distancias de mapa: a la distancia entre genes consecutivos debe sumarse las frecuencias de los dobles entrecruzamientos Fenotipo Genotipo Número Número de recombinantes entre b-pr pr-c b-c Salvaje b + b pr + pr c + c 5701 Black, purp, cur bb prpr cc 5617 Purp,curved b + b prpr cc Black bb pr + pr c + c Curved b + b pr + pr cc Black,purp bb prpr c + c Purp b + b prpr c + c Black,curved bb pr + pr cc Total Porcentaje 5,9% 19,5% 23,7% Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 32

33 Tetrada meiótica Gametos Distancia b-pr = frec rec sencillos + frec rec dobles Entrecruzamiento entre b y pr b pr c b pr c b pr c 388 b pr + c + b + pr + c b + pr c b + pr + c + b + pr + c + Doble entrecruzamiento en la región b-pr-c b pr c b pr c b pr c b pr + c b + pr + c + 60 b + pr + c + 72 b + pr c + b + pr + c Distancia b-pr = 887/15000 = 0,059 = 5,9 % = 5,9 cm Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 33

34 Mapa genético de los marcadores 25,4 La mejor estima distancia entre los extremos es la suma (b-pr) + (pr-c) b 5,9 pr 19,5 c 23,7 Distancia b-c sin considerar los dobles recombinantes Se podría hacer una corrección para mejorar la estima de las distancias? Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 34

35 Coeficiente de coincidencia: mide si los entrecruzamientos son independientes entre sí Si los múltiples entrecruzamientos suceden independientemente los unos de los otros, la frecuencia de los dobles entrecruzamientos será al producto de la frecuencia de los intercambios sencillos Antonio Barbadilla Coeficiente coincidencia (CC) = (número de dobles entrecruzamientos observados)/(número de dobles entrecruzamientos esperados) Si CC < 1, dobles disminuidos Si CC > 1, dobles incrementados Interferencia: 1 - CC Ejemplo A B C D A-B = 20 cm D B-C = 10 cm Proporción dobles recomb. observados = 0,005 Proporción dobles recomb. esperados = 0,02 CC = 0,005/0,02 = 0,25 I = 1- CC = 0,75 Tema 8: Cartografía genética 35

36 Mapa de ligamiento parcial de los 4 cromosomas de Drosophila melanogaster Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 36

37 Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 37

38 Mapas genéticos (de recombinación) versus mapas físicos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 38

39 Importancia mapas de recombinación Describir las tasas de recombinación a lo largo del genoma Predecir la transmisión genética de un gameto Localización de genes que influyen el fenotipo (QTLs) Marco de referencia para cartografía física Marco de referencia para la cartografía de genes asociados a enfermedades Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 39

40 Mapas genéticos versus mapas físicos Frecuencia de recombinación por unidad de DNA Especies Tamaño haploide Unidades de mapa Tamaño unidad mapa Distancia media del genoma entrecruzamientos consecutivos Fago T4 1.6 x 10 5 pb pb 1.0 x 10 4 pb E. coli 4.2 x 10 6 pb pb 1.2 x 10 5 pb Levadura 2.0 x 10 7 pb pb 2.5 x 10 5 pb Hongo 2.7 x 10 7 pb pb 1.3 x 10 6 pb Nemátodo 8.0 x 10 7 pb pb 1.2 x 10 7 pb Mosca de la fruta 1.4 x 10 8 pb pb 2.5 x 10 7 pb Ratón 3.0 x 10 9 pb pb 9.0 x 10 7 pb Humanos Varón 3.3 x 10 9 pb pb 6.0 x 10 7 pb Mujer 3.3 x 10 9 pb pb 3.5 x 10 7 pb Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 40

41 Análisis de tétradas Los hongos ascomicetos retienen los cuatro productos haploides de cada meiosis en un saco denominado asca Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 41

42 Hongos ascomicetos Estos organismos son únicos porque se puede analizar meiosis individuales, permitiendo estudiar aspectos básicos de la genética de la meiosis (un proceso central de la biología de los eucariotas) Cartografiar los centrómeros como si fuesen loci Investigar la posibilidad de interferencia de cromátida Examinar los mecanismos de entrecruzamiento Aspergillus nidulans Coprinus lagopus Saccharomyces cerevisiae Ustigalo hordei Ascobolus immersus Neurospora crassa Basidiomiceto Basidiomiceto Tétradas Octadas Tétradas Octadas No ordenadas Lineales Patrones distintos de ascosporas y ascas en Neurospora Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 42

43 Crecimiento de las hifas en N. crassa Fenotipos mutantes de Neurospora crassa Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 43

44 Meiosis y mitosis postmeiótica en la tétrada lineal de Neurospora Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 44

45 Distancia de un locus al centrómero en Neurospora No recombinación entre el locus y el centrómero 4:4 Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 45

46 Distancia de un locus al centrómero en Neurospora Recombinación entre el locus y el centrómero 2:2:2:2 Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 46

47 Distancia de un locus al centrómero: estímese el porcentaje de tétradas que muestran patrones de segregación en la segunda división para ese locus y divídase por 2 Patrones M II = = 42 o sea 14% Puesto que sólo la mitad de los cromosomas que sufren entrecruzamiento son recombinantes, la distancia de mapa (medida como frecuencia de recombinación) será 14/2 = 7 unidades de mapa ó cm Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 47

48 Cartografía genética en humanos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 48

49 Cartografía a través de la herencia ligada al cromosoma X Xg Proteína grupo sanguíneo Ictiosis (un efermedad de la piel) Albinismo ocular Angioqueratoma (crecto celular) Centrómero Fosfoglicerato-quinasa Alfa-galactosidasa Xm Deutan (ceguera color rojo-verde) G6PD Protano (ceguera color rojo-verde) Hemofilía A Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 49

50 Cartografía genética en humanos Estudios familias Herencia ligada al cromosoma X marcadores clásicos Autosómicos marcadores clásicos Cartografía marcador-enfermedad (estudios de asociación) La caza de genes asociados a enfermedades Cartografía marcador-marcador Estudios marcadores polimórficos asignados a colecciones de familias (CEPH). (SNPs, Microsatélites, RFLPs, RAPDs,...) Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 50

51 Mapa genético de alta resolución del Cromosoma 1 Homo sapiens. The Cooperative Human Linkage Center Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 51

52 Por qué Mendel no encontró ligamiento? Blixt, S Why didn't Gregor Mendel find linkage? Nature 256, 206 (1975) doi: /256206a0 (enlace al artículo) Clásicos de la genética: The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila, as shown by their mode of association Alfred Sturtevant creates the world's first genetic map Vídeos Genetic Recombination and Gene Mapping Lecture on Linkage and Recombination, Genetic maps MIT 7.01SC by Professor Eric Lander Lecturas de Scitable Nature Education Thomas Hunt Morgan, Genetic Recombination, and Gene Mapping Lista de problemas del tema 8: Mapas genéticos Antonio Barbadilla Tema 8: Cartografía genética 52