Proyecto Nº SC Equivalente de jornada completa: 2,50

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1 Proyecto Nº SC ACTIVIDAD Y EFICACIA DEL CONTROL INTEGRADO DE LOS HONGOS DEL SUELO Y DE LA CONSERVACION DE LOS CITRICOS MEDIANTE ANTAGONISTAS MICROBIOLOGICOS Y SUSTANCIAS ANTIFUNGICAS NATURALES Equipo Investigador: Juan José Tuset Barrachina (Dr. I.A.) Concha Hinarejos Montero (I.T.A.) Jose Luis Mira Vidal (I.T.A.) José María Martínez Jávega (Dr. I.A.) Vicente Cebolla Rosell (I.A.) Equivalente de jornada completa: 2,50 Centro de Investigación: Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. (IVIA). Valencia. Duración: Coste:. Enero Diciembre 1997 Miles de pesetas: Fianciación INIA 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS 1. Valoración in vitro e in vivo de las posibilidades antagonistas de hongos comunes de nuestros suelos, como son Trichoderma spp. y Myrothecium spp. sobre diferentes hongos fitopatógenos importantes y ampliamente distribuidos en todas las zonas agrícolas, como: Phytophthora spp., Armillaria spp., Rhizoctonia spp., etc. 2. Mejora del conocimiento de los mecanismos de la actividad antagonista (antibiosis y lisis) de estos hongos en cultivos duales y mediante filtrados culturales. 3. Valoración antifungica de los filtrados culturales de Myrothecium spp. 4. Formación de suelos supresivos con estos antagonistas, posibilidades de su aplicación para controlar los hongos Phytophthora. 5. Actividad del calor, tanto húmedo como seco, en la presencia del podrido parasitario en frutos cítricos durante la postrecolección. RESULTADOS En el trabajo se ha demostrado la potencialidad de los géneros Trichoderma y Myrothecium como posible agentes de biocontrol de A. mellea, R. solani, S. sclerotiorum y Phytophthora spp., tanto in vitro como in vivo. En Trichoderma spp. se da una acción de competición por el espacio, ya que ambos micelios, el del antagonista y el del patógeno, llegan a entrar en contacto, resultando cero la distancia d entre ambas colonias en cultivo dual, lo que demuestra que no existe una acción antibiótica. Además, los filtrados culturales que fueron obtenidos a partir del crecimiento de los diferentes aislados de las cuatro especies de Trichoderma en medio líquido pobre en glucosa, han confirmado os resultados obtenidos en los cultivos duales. Tan sólo un aislado de T. harzianum muestra una eficacia del 33.91%. En el resto de aislados se produce un crecimiento igual o mayor de las colonias en las placas de Petri a las que se les había añadido el filtrado cultural. Este hecho es explicable por la escasísima o nula producción de antibióticos que puedan frenar el desarrollo de P. capsici, y por la adición de sales minerales y glucosa que se produce al añadir al medio PDA los 2 ml de filtrado cultural, que es un medio rico en sales. Ha habido diferencias en la respuesta antagonista de los ocho aislados de Trichoderma con las distintas especies de patógenos. Así, R. solani ha resultado ser mucho más sensibles a la acción antagónica de Trichoderma spp., mientras que A. mellea ha sido mucho menos sensible. Este hecho diferencial ya había sido observado por otros muchos investigadores, los cuales habían encaminado siempre sus trabajos hacia el control de estos patógenos, y no hacia el de A. mellea. Así mismo, han existido diferencias de comportamiento en cada uno de los aislados con los de hongos a combatir. T. viride (T.V. 1) se ha mostrado muy eficaz con A. mellea pero no con R. solani. Esta especialidad a había sido señalada anteriormente en T. harzianum, el cual sera altamente efectivo, in vitro, contra Sclerotium rolfsii, pero inefectivo contra R. solani. Es, por ello, muy importante efectuar una selección previa de los aislados obtenidos mediante ensayos fáciles de llevar a cabo y rentables, antes de realizar pruebas en invernadero o en el campo. 2

3 La acción de las distintas especies de Trichoderma no es una acción antibiótica, sino enzimática de ataque. Esto se pne de manifiesto en cultivos duales sobre membrana de celofán, donde se observa que Trichoderma ataca el micelio de R. solani, pero no el de A. mellea. In vivo, las especies del género Trichoderma ensayadas por nosotros no son eficaces en el biocontrol de algunos de los patógenos fúngicos del suelo. Así, sobre R. solani ninguno de los aislados de Trichoderma spp. ejerció un control eficaz, resultando afectadas todas las plantas a los 20 días de iniciar la experiencia. La poca o nula eficacia podría atribuirse a que el sistema de acción de Trichoderma, el micoparasitismo, requiere la presencia de grandes cantidades de inóculo en los alrededores de las plantas, además de su existencia previa a la del patógeno, para conseguir así una colonizació de todos los nichos ecológicos e impedir la colonización por agentes micóticos. Este hecho, además de difícil consecución, es casi imposible de mantener durante largos períodos de tiempo. Myrothecium spp. ha desarrollado un tipo de antagonismo diferente al mostrado por Trichoderma spp., es decir, actúa por medio de la antibiosis. Cuando ambos micromicetos (Myrothecium spp. y el hongo patógeno) so situados en una placa de Petri en cultivo dual, los micelios nunca llegan a entrar en contacto. Se produce una zona de inhibición que demuestra la emisión de toxinas por parte de Myrothecium. En Phytophthora spp., M. roridum produce una inhibición que demuestra la emisión de toxinas por parte de Myrothecium. En Phytophthora spp., M. roridum produce una inhibición entre el 8.70% y el 98.55% después de 11 días en cultivo dual; M. verrucaria, en el mismo tiempo tiene unas eficacias entre el 65.64% y el 100%. En A. mellea y R. solani la eficacia de M. verrucaria es también elevada, entre el 85.71% y el 83.33% respectivamente. Filtrados culturales de M. roridum y M. verrucaria, obtenidos por distintos procedimientos, se han mostrado muy eficaces en la inhibición del crecimiento de distintas especies de Phytophthora. En todas las concentraciones el crecimiento de Phytophthora ha sido virtualmente suprimido. No ocurre lo mismo con A. mellea y R. solani, donde las eficacias a las dosis mayores, del 20%, han sido del 21% y 30% respectivamente. Esto puede ser debido a que las toxinas emitidas por Myrothecium spp., son celulolíticas, y la base de las paredes de las hifas de Phytophthora es la celulosa, mientras que A. mellea y R. sonai son hongos quitinosos, con escasa celulosa en sus paredes. Es por ello que una emisión constante de toxinas por parte de Myrothecium, como ocurre en los cultivos duales, puede detener su crecimeinto, pero no ocurre así en los filtrados culturales. Algunas especies de Phytophthora, por su parte, han resultado más sensibles a la acción antibiótica que otras, y esto se mantiene de forma similar en ambas especies de Myrothecium. Así, P. capsici, P. parasitica y P. syringae, se han mostrado, por lo general, más resistentes a esta acción antibótica, mientras que P. cactorum, P. cinnamomi y P. katsurae han sido más sensibles. Esta mayor tolerancia a las tóxinas de Myrothecium podría tener un origen genético. En posteriores investigaciones se deberían estudiar los factores genéticos implicados en la resistencia a estas toxinas. Los antibióticos Roridin-A y Verrucarin-A producen in vitro una importante reducción del crecimiento de P. cinnamomi. Verrucarin-A se muestra entre un 5% y un 8% más efectiva que Roridin-A. Los filtrados culturales obtenidos por crecimento de M roridum y M. verrucaria en medio Richard, fueron entre un 35% y un50% más efectivos a la misma concentración. Esto nos indica que el efecto antagonista no sólo reside en estas dos substancias, sino que deben existir más substancias que actúan en la inhibición del crecimiento de Phytophthora spp. 3

4 In vivo, el riego con filtrados culturales de M. roridum y M. verrucaria reduce enormente la infección de P. capsici en las plantas de pimiento. La incorporación de Myrothecium spp. al suelo por medio de salvado de trigo o como una suspensión concentrada de conidios no inhibe significativamente el ataque de P. capsici. Los antibióticos o toxinas son capaces de alcanzar el micelio de Phytophthora y provocar su inhibición. La actividad de los antibióticos o toxinas, producidos por M. roridum, ha permitido el control de chancros y gomosis producidos por P. nicotianae var. parasitica. Naranjos o clementinos afectados por Phytophthora (con infección natural o artificial) detuvieron completamente el desarrollo de esta enfermedad cuando discos de agar ymicelio de M. roridum fueron inoculados en la corteza de las principales raíces o en la parte basal de los troncos. Ambos experimentos confirman que los antibióticos o toxinas de M. roridum se mueven en sentido acróptero a través del sistema vascular (xilema) en raíces y troncos. Myrothecium spp. han mostrado una gran habilidad para dispersarse en sentido vertical, hacia capas más profundas del suelo. Además, la larga conservación en el suelo de los conidios de ese hongo son un punto a favor de la fácil y rápida colonización que se puede obtener con estos hongos en suelos naturales. Debido a que las enfermedades causadas por Phytopththora y otros hongos fitopatógenos, como R. solani, A. mellea etc., son muy importantes y las pérdidas que originan bastante cuantiosas, el potencial antagonista in vivo de los hongos del género Myrothecium contra éstos y otros patógenos debe ser especialmente tenido en cuenta. Esto nos fuerza a desarrollar nuevas estrategias que permitan a M. roridum y M. verrucaria mejorar su eficacia antagonista en los tejidos de las plantas. Futuras investigaciones tendrán que poner su interés y atención en las toxinas y antibióticos, su obtención y determinación, así como su aplicación tanto en el suelo (área de la rizosfera) como en los órganos de las plantas (hojas, raíces, tallo, frutos, etc.) Tratamientos térmicos para el control de las podredumbres de los frutos cítricos en postcosecha. Las medidas de control de los hongos de las postrecolección de los agrios consisten principalmente en la aplicación de fungicidas durante el proceso de selección, conservación y empaquetado de los frutos. Esta práctica, realizada durante un tiempo prlongado (varios quinquenios), favorece el desarrollo de las resistencias de los hongos y el control del podrido se ve debilitado. Lo anterior, junto con la presencia de tasas elevadas de residuos que permanecen en la piel de los frutos, ha causado recientemente dificultadas en os mercados de fresco, especialmente en los consumidores y, tamien, en las autoridades sanitarias. Existe un actualizado interés en utilizar una planificación integrada del control de las enfermedades de la postrecolección utilizando combinaciones de tratamientos físicos, químicos y biológicos para reducir los problemas antes expuestos. Los tratamientos térmicos, especialmente al curado ( curing ) y el agua caliente, son prometedores porque, de por sí, estimulan los mecanismos de defensa natural del propio fruto (piel) a la infección y colonización de los patógenos fúngicos. Estos tratamientos son capaces de elicitar la biosíntesis de la lignina y sus precursores fenólicos en las capas externas del pericarpio, así como diferentes sustancias endógenas (especialmente fitoalexinas) que inhiben 4

5 el desarrollo fúngico. También estos tratameitnos permiten reducir las concentracones de fungicidas sin pérdida de eficacia y, con ello, la disminución de los residuos. El propósito de la investigación es comprobar la eficacia del agua caliente y del curado en la presencia del podrido en frutos cítricos: a) naturalmente contaminados, b) artificialmente inoculados con Penicillium digitatum, botrytis cinerea y Phytophthora citrophthora, principales hongos de las postrecolección de los cítricos en España, así como el efecto de la reducción de la concentración de fungicidas suspendidos en agua caliente sobre estos mismos hongos. Como resultados de la investigación tenemos: 1.- Incidencia del podrido en los tratamientos con agua caliente 1.a) Infección natural. El agua caliente reduce ligeramente el podrido pero influye claramente en los agentes fúngicos causantes del mismo. En naranjas mantenidas tres minutos en un baño de agua a 53ºC, la incidencia del podrido disminuyó en un 14% a los 21 días de conservación a 20.22ºC. P. digitatum, Alternaria citri y Colletrotrichum gloesosporioides fueron hongos aislados en los frutos de la experiencia. El efecto del agua claiente fue pequeña en P. digitatum (una disminución de la incidencia del prodrido de un 6% en el tratameitno del agua caliente en comparación co el agua a temperatura ambiente) y en A. citri (una disminución del 2%), pero importante en C. gloesosporioides, hongo que fue controlado totalmente. 1.b) Infección artificial. En los experimentos la tendencia fue muy parecida. El agua caliente por si sola es capaz, únicamente en P. digitatum, de reducir a los 21 días a 20ºC el desarrollo del hongo a niveles significativos, pero en B. cinerea y P. citrophthora no detiene el crecimiento en la corteza de las naranjas W. Navel. En P. digitatum, el tratamiento a las naranjas con tiabendazol (TBZ) a 1000 ppm y 53ºC incrementó significativamente el efecto fungicida con relación al realizado a temperatura ambiente (empleando aquí 2000 ppm de fungicida) y el podrido a los 5 días a 20-22ºC disminuyó del 14% al 2,4%. El tratamietno con benomilo a 500 ppm o con imazalil a 500 ppm, ambos en suspensiones en agua a 53ºC, también resultaron ser mucho más efectivos que los realizados a 1000 ppm en suspensiones en agua a temperatura ambiente, para controlar las infecciones incipientes del moho verde en las naranjas artificialmente inoculados. En B. cinerea, el tratamiento con imazalil a 1000 ppm y 53ºC redujo significativamente el desarrollo de este hongo en las naranjas frente al tratamiento a 1500 ppm y agua a la temperatura ambiente. El podrido observado descendió del 49% al 12%. Los frutos tratados con benomilo no impidieron el podrido. En P. citrophthora, el tratamiento con fosetil-a1 a 1200 ppm en suspensión en agua caliente a 53ºC resultó ser tan efectivo como el fosetil-a1 a ppm en suspensión en agua a temperatura ambiente, para controlar las infecciones iniciales del Aguado en las naranjas maduras e inoculadas artificialmente con micelio joven del hongo. Metalaxil a 300 ppm y 53ºC redujo en un 97% el podrido por Phytophthora. 2.- Incidencia del prodrido en el curado 5

6 2-a) Infección natural. Las naranjas W. Navel que recibieron el tratameinto del curado a 35ºC durante 72 h. fueron menos afectados (aproximadamente un 30% por el podrido después de 21 días a 20-22ºC (fig. 5), Los frutos de los cajones que no se cubrieron con una lámina de polietileno tuvieron una tasa de podrido del 8% frente al 31,3% de los que fueron cubiertos con la lámina de plástico. Los patógenos fúngicos presentes en los frutos empleados en la experiencia fueron: P. digitatum, P. italicum, A. citri y B. cinerea. Con una reducción aproximada del 12% en los Penicillium y un posible control de B. cinerea, el curado se ha mostrado como un tratamiento térmico interesante para los frutos cítricos. Se observaron a los 21 días, en un número considerable, manchas en la corteza de variable tamaño que interesaban la epidermis y la capa glandular (flavedo) en los frutos curados. 2-b) Infección artificial. El curado únicamente controló el crecimeinto de P. citrophthora en la corteza de las naranjas conservadas 5 días a 20-22ºC P. digitatum, con un 78% de frutos que mostraban crecimiento miceliar y esporulación y B. cinerea, con un 100% de frutos afectados no respondieron al efecto térmico. La reducción del área de corteza podrida fue interesante en B. cinerea, pasando de 8,43 cm 2 de medida en los frutos no curados a 2,14 cm 2 en los curados. La disminución de las concentraciones de los fungicidas en las suspensiones en agua caliente claramente incrementa el efecto fungitóxico y la incidencia del prodrido es siempre menor que el producido en los tratamientos con concentraciones normales en agua temperatura ambiente. Los resultados obtenidos con agua caliente, especialmente en P. digitatum, están en la línea de los obtenidos por otros autores, si bien, en B. cinerea y P. citrophthora, estos son más discordantes. Nuestras experiencias han demostrado, no obstante, que las suspensiones de los fungicidas en agua caliente so convenientes para mejorar el control de B. cinerea y P. citrophtora con los fungicidas hoy disponibles. La disminución del podrido empleando bajas concentraciones de fungicidas debe de incluir siempre una mejora de la tecnología de postrecolección (frutos sin herida, corto periodo de tiempo entre la recogida en campo y la entrada en el almacén, buena sanidad de las instalaciones, etc.), así como la modificación de las técnicas de aplicación de los fungicidas para incrementar su efecto antifúngico. Los resultados del curado concuerdan en Penicillium con los obtenidos por otros autos. El curado es ineficaz para Alternaria y el posible efecto fungitóxico observado en B. cinerea podría deberse a la ausencia del hongo en los frutos que recibieron este tratamiento. El bajo resultado conseguido en los Penicillium estaría relacionado con el periodo transcurrido entre la incoculación y el curado que fué de 24-26h. En este tiempo, la producción de susancia volatiles en los frutos contaminados mediante herida, han favorecido la germinación de los conidios de P. digitatum y, con ello, la infección, provocando que el curado no produjese los efectos esperados. Esta técnica esta indicada para los frutos con una corteza en buenas condiciones (con muy pocas heridas) y transportados el almacén inmediatamente después de ser cosechados. 6

7 El crecimiento de B. cinerea no está influenciado por estas sustancias volátile. La temperatura alcanzada en el curado (35ºC) no es suficiente para detener el desarrollo miceliar pero si para ralentizarlo. P. citrophthora si que es influenciada por el calor. El curado detiene el desarrollo miceliar de este hongo en la corteza de los frutos en las primeras etapas de la nfección, tanto en el flavedo como en el albedo. Posiblemente algunos mecanismos de resistencia presentes en el flavedo (sustancias antifúngicas preformadas o inducidas) sean la causa de la inactivación del hongo. El calor por si solo no induce a producción de sustancias antifúngicas inducidas (fitoalexinas), pero inhibe las producidas por la actividad del hongo patógeno. Esto explicaría lo sucedido en B. cinerea y P. citrophthora. La inhibición del podrido parasitario por el curado (calor), es una de las posibilidades de interés al reducir los tratamientos fungicidas y, de esta forma, poder comercializar frutos mucho menos contaminados por los residuos y, además, conseguir poblaciones de patógenos fúngicos menos resistentes. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES Los resultados obtenidos son muy interesantes pues demuestran que existe un gran potencial antagonista en los hongos del género Myrothecium, que debe ser desarrollado paulativamente. Su actividad por antibiosis es clara y existen fundadas esperanzas que alguna de las substancias o antibióticos producidos por este hongo se puedan aplicar semicomercialmente en un tiempo no muy largo. Por el contrario este potencial en Trichoderma resulta mucho menos claro y con ello, existen considerables dudas de que pueda ser, tanto actualmente como en un futuro próximo, utilizado como biocontrol de forma generalizada y con porcentajes aceptables de eficacia. Los tratamientos térmicos para el control de los podridos de los frutos cítricos, si bien con un desarrollo lento (hacen falta muchos más estudios) pero sin pausas importantes, es una técnica que debe ser aplicada en algunos almacenes, especialmente los que están acogidos a la producción integrada. También la posibilidad de reducción de la concentración de fungicida, hace de estas técnicas un recurso que no debe ser olvidado. El sector citrícola lo conoce y ha comenzado a emplearlas. Todos los resultados que se han obtenido se vienen difundiendo con publicaciones, conferencia, cursos monográficos y consultas oficiales. La implantación real de los mismos es una cuestión de tiempo. FORMACION DE PERSONAL Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Alfredo Molins Palanca, titulada Contribución al conocimiento de la potencialidad de los hongos de los géneros Trychoderma y Myrothecium como posibles agentes de biocontrol de los hongos del suelo, en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Valencia Apto cum laude. PUBLICACIONES 7

8 Artículos de divulgación Tuset, J.J La incidencia de las especies de Phytophthora en los agrios. Phtytoma España, Tuset, J.J., Hinarejos, C., Mira, J.L., Martínez, J.M Tratamientos térmicos a los frutos cítricos para el control de las enfermedades de la postrecolección. Levante Agrícola, Tuset, J.J., Hinarejos, C., Mira, J.L Las enfermedades fúngicas de la post-recolección de los agrios actualmente en progreso. Phytoma España, Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Tuset, J.J., Hinarejos, C., Mira, J.L., Molins, A. Postharrest decay of mandarins: behaviaur of the Trychoderma fungi. Symposium Mandarins. Córcega (Francia). Marzo, Ed.: INRA. Tuset, J.J., Hinarejos, C., Mira, J.L., Molins, A.. Postharrest decay in mandarins caused by Trychoderma fungi. VIII International Citrus Congress. Sun City (South Africa). Mayo, Ed.: International Society of Citimetars. Tuset, J.J., Hinarejos, C., Mira, J.L., Martínez, J.M. Tratamientos térmicos a los frutos cítricos para el control de las enfermedades de la post-recolección. IV Simposio Nacional, I Ibérico, sobre maduración y post-recolección de frutos y hortalizas. Valencia (España). Septiembre, Ed.: Universidad Politécnica de Valencia. 8