CULTIVO IN VITRO DEL EMBRIÓN EN EJEMPLARES ABORTANTES DE Ulmus minor Mill.

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1 CULTIVO IN VITRO DEL EMBRIÓN EN EJEMPLARES ABORTANTES DE Ulmus minor Mill. López Almansa, J. C.: Departamento de Silvopascicultura, E.T.S. Ingenieros de Montes, U.P.M, Ciudad Universitaria s/n, 28040, Madrid. Dirección actual: Unidad Departamental de Ciencia y Tecnología Agroforestal y Ambiental, Universidad Católica de Ávila, C/ Canteros s/n, Ávila, jcarlos.lopez@ucavila.es Gil, L.: Departamento de Silvopascicultura, E.T.S. Ingenieros de Montes, U.P.M, Ciudad Universitaria s/n, 28040, Madrid Resumen Para la realización de este estudio se extrajeron, en la primavera de 2002, los embriones de 15 semillas por cada uno de seis ejemplares de Ulmus minor conocidos por abortar la práctica totalidad de la semilla. La extracción se produjo con anterioridad a que se completara el aborto de la semilla. No fue infrecuente la existencia de dos y hasta tres embriones en desarrollo en la misma semilla. A continuación, los embriones se mantuvieron en un cultivo con medio basal B5. Los embriones extraídos progresaron inicialmente en el medio de cultivo, emitiendo la radícula y los cotiledones, aunque en algunos casos presentaron anormalidades debido a la proliferación de tejidos y a la formación de callos. Sin embargo, tras seis semanas de cultivo ninguno llegó a emitir hojas no cotiledonares. Habida cuenta de la dificultad general del cultivo in vitro de embriones de olmo, este ensayo sugiere que el embrión de los ejemplares abortantes es viable, por lo que el aborto de la semilla debe atribuirse a causas de origen materno. Palabras clave: semilla, aborto, olmo, grafiosis, mejora genética INTRODUCCIÓN Una de las causas de la abundancia de sámara vana en Ulmus minor en España es, entre otras, la presencia de aborto generalizado del embrión en un cierto número de individuos de esta especie (LÓPEZ-ALMANSA & al., 2003, 2004). Este aborto parece estar originado por una competencia por los recursos entre embrión y endosperma, de forma que en los individuos abortantes el endosperma se hipertrofia a costa del embrión, impidiendo el desarrollo de éste, que queda muy retrasado y vacualizado, con un gran contenido de agua y una escasa acumulación de proteínas y otras sustancias de reserva, y que finalmente muere como consecuencia de la desecación que se produce en la última fase del desarrollo de la semilla (LÓPEZ-ALMANSA & al., 2004). Esta presencia generalizada de aborto en algunos ejemplares impide su uso como progenitores femeninos dentro del Programa Español de Mejora Genética del Olmo frente a la Grafiosis, que se estableció en 1986 como resultado de un convenio entre el entonces Instituto Nacional para la Conservación de la Naturaleza y la Universidad Politécnica de Madrid, y cuyo objetivo es obtener olmos resistentes a dicha enfermedad. Con el fin de soslayar este inconveniente, en 2001 y 2002 se realizó un estudio, cuyos resultados se presentan aquí, para tratar de desarrollar una técnica de extracción y cultivo in vitro de los embriones de ejemplares abortantes antes de que se produjera el aborto, tanto con el fin de salvarlos y poder utilizarlos en el futuro para la mejora genética, como para comprobar que el aborto de la semilla en estos ejemplares tiene un origen materno, y no se debe a la falta de viabilidad del embrión (LÓPEZ-ALMANSA & al., 2004) MATERIAL Y MÉTODOS En la primavera de 2002 se extrajo los embriones de 15 semillas por individuo en un total seis

2 individuos del banco clonal de olmos situado en el Centro de Mejora Genética Forestal de Puerta de Hierro. Estos ejemplares (CC-VG2, CR-RD1, M-IN5, M-SF1, M-TC6, V-JR1), todos ellos de la especie Ulmus minor, eran previamente conocidos por abortar la práctica totalidad de la semilla. Dado que en algunas semillas se encontraron, al realizar la extracción, dos e incluso, en un caso, tres embriones, el número de embriones extraídos por madre fue de entre 15 y 18. La extracción se realizó la primera semana de abril, aproximadamente a la mitad del desarrollo de la semilla, que suele durar unos dos meses. Como medio de cultivo se usó el medio basal B5 (GAMBORG & al., 1968; GAMBORG & PHILLIPS, 1995), al que se añadió los suplementos orgánicos y reagentes indicados en la tabla 1. Los embriones se extrajeron asépticamente en una cámara de flujo laminar y se cultivaron en placas Petri previamente esterilizadas en autoclave junto con el medio de cultivo. El cultivo se mantuvo en estufa a 25 grados de temperatura con 12 horas de luz y 12 de oscuridad, alternativamente, evaluándose semanalmente el número de embriones en desarrollo. Al cabo de unas dos semanas las plántulas se trasladaron del medio de cultivo a maceta con una mezcla 70:30 en volumen de turba y perlita, con el fin de comprobar si se producía el enraizamiento de las plántulas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La extracción de los embriones de la semilla fue difícil debido a su pequeño tamaño, que generalmente no superaba los dos milímetros de longitud. El endosperma se encontraba ya en descomposición (LÓPEZ-ALMANSA & al., 2004), mientras que los embriones, por lo general, estaban en la fase cotiledonar temprana. Algunos embriones se hallaban más retrasados, en transición entre el estado globular y el acorazonado. Las anormalidades más destacadas fueron la presencia de dos embriones con tres cotiledones en M-SF1 (figura 1a), y la existencia de semillas con dos e incluso, en una semilla de M-TC6, tres embriones. Esta presencia ocasional de varios embriones por semilla había sido ya detectada previamente en los estudios histológicos realizados con anterioridad (LÓPEZ ALMANSA, 2002), y ha sido también descrita en otras especies del género, atribuyéndose a la fertilización de las células antipodales del óvulo (SHATTUCK, 1905; LELIVELD, 1935; EKDHAL, 1941; GUIGNARD & MESTRE, 1967). Los embriones rescatados progresaron inicialmente bien en el medio de cultivo, emitiendo la radícula y los cotiledones, incluso los que habían sido extraídos de la semilla en fases muy tempranas del desarrollo (estado acorazonado). El índice de de supervivencia se mantuvo en todos los casos en torno al 100 %. En los casos de embriones múltiples, todos los procedentes de la misma semilla progresaron de forma similar. En ocasiones, no obstante, se presentaron algunas anormalidades como la proliferación de tejidos (figura 1b) y la formación de callos, tal vez originados como respuesta a heridas producidas en el embrión al ser extraido de la semilla. Esta emisión generalizada de radícula y cotiledones contrasta con lo encontrado por CORREDOIRA & al. (2002), ya que estos autores hallaron en un ensayo con cultivos in vitro de embriones zigóticos de Ulmus minor y Ulmus glabra que el desarrollo de la radícula ocurría únicamente en algunas ocasiones. Esto puede estar relacionado con la ausencia de la auxina 2,4-D en nuestro medio de cultivo, pues CORREDOIRA & al. (2002) encontraron que la emisión de radícula en embriones zigóticos, así como el desarrollo de embriones somáticos, se daba más frecuentemente con bajas concentraciones de esta auxina. Otra posible causa puede estar en la diferencias de comportamiento entre genotipos, pues como han señalado DÍEZ & GIL (2004) en un ensayo de, existen diferencias en la respuesta de distintos genotipos. Los embriones siguieron creciendo a lo largo de las seis semanas del estudio, emitiendo frecuentemente una radícula (figura 1c) que llegó en algunos casos a varios centímetros de longitud. Los cotiledones de estas plántulas comenzaron igualmente a realizar la fotosíntesis. No obstante, ninguno de los 95 embriones estudiados llegó a emitir hojas no cotiledonares y, por tanto, a generar una plántula.

3 Los ensayos realizados para rescatar el embrión parecen indicar que éste puede sobrevivir y crecer fuera de la semilla en desarrollo. Igualmente, y pese a que en ningún caso se ha producido la emisión de hojas no cotiledonares, la emisión y crecimiento de la raíz sugiere que la conversión en plántulas podría darse en las condiciones adecuadas. Debemos tener en cuenta que el desarrollo del embrión comprende un complejo sistema de señales programadas, resultado de la interacción con el ambiente que le rodea, que permiten que embrión alcance la madurez. Como consecuencia de ello, la temprana extracción del embrión puede suponer que este no alcance el nivel de desarrollo adecuado para permitir su transformación en plántula. Todo esto parece sugerir que los embriones de los genotipos abortantes podrían ser viables de por sí, especialmente si tenemos en cuenta las dificultades que presentan los embriones de olmo cultivados in vitro para lograr su conversión en plántula (CORREDOIRA & al., 2002). De confirmarse que, efectivamente, los embriones son plenamente viables, esto demostraría que el aborto generalizado de la semilla y del embrión en algunos genotipos de Ulmus minor se debe no a motivos intrínsecos al propio embrión, sino a la competencia por los recursos entre el embrión y el endosperma, que se desarrolla anormalmente en estos genotipos abortantes. Dado que dos tercios de la carga genética del endosperma es de origen materno, y sólo un tercio es de origen paterno, mientras que en el embrión la carga genética procedente de cada progenitor es equivalente, la viabilidad del embrión sugiere por tanto que el aborto tiene un origen fundamentalmente materno, como ya ha sido hipotetizado por LÓPEZ-ALMANSA & al. (2004). Agradecimientos El presente estudio fue financiado por el Ministerio de Medio Ambiente a través de un convenio con la Universidad Politécnica de Madrid. Deseamos expresar nuestro agradecimiento por su colaboración y apoyo económico al Servicio de Material Genético de la Dirección General de Conservación de la Naturaleza, en particular a Salustiano Iglesias. Igualmente expresamos nuestro agradecimiento a Julio Díez por los comentarios realizados sobre una anterior versión de esta comunicación. J.C.L.A. estuvo financiado por una beca F.P.U. del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. BIBLIOGRAFÍA CORREDOIRA, E.; VIEITEZ, A. M. & BALLESTER, A.; Somatic embryogenesis in elm. Ann Bot 89: EKDAHL, I.; Die Entwicklung von Embryosack und Embryo bei Ulmus glabra Huds. Svensk Bot Tidsk 11: DÍEZ, J. & GIL, L.; Micropropagation of Ulmus minor and U. minor x U. pumila from 4-yearold ramets. Invest Agrar: Sist Recur For 13: GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K.; Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50: GAMBORG, O. L. & PHILLIPS, G.C., eds.; Plant cell, tissue and organ culture. Berlin, Springer Verlag. 358 pp. GUIGNARD, J.-L.; MESTRE, J.-C.; Sur le développement d embryons à partir des antipodes chez l Ulmus campestris L. Bul Soc Bot France 113 : LELIVELD, J.A.; Cytological studies in the genus Ulmus. II. The embryo sac and seed development in the common Dutch elm. Rec Trav Bot Néerl 23: LÓPEZ ALMANSA, J. C.; Biología de la reproducción en Ulmus minor Mill. Y su híbridos en España. Tesis doctoral. Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Montes, Universidad Politécnica de Madrid. LÓPEZ-ALMANSA, J.C.; PANNELL, J.R. & GIL, L.; Female sterility in Ulmus minor (Ulmaceae): a hypothesis invoking the cost of sex in a clonal plant. Am J Bot 90: LÓPEZ-ALMANSA, J.C.; YEUNG, E.C. & GIL, L.; Abortive seed development in Ulmus minor Mill (Ulmaceae). Bot J Linnean Soc 145: SHATTUCK, C.H.; A morphological study of Ulmus americana. Bot Gaz 40:

4 Componente Cantidad Ácido p-aminobenzoico 0,2 mg/l Ácido ascórbico 0,4 mg/l Biotina 0,0005 mg/l Ácido fólico 0,015 mg/l Ácido nicotínico Piridoxina HCl Tiamina HCl L-Arginina 40,0 mg/l L-Asparagina 150,0 mg/l Caseina hidrolizada 250 mg/l Glicina 20,0 mg/l L-Glutamina 500,0 mg/l L-Serina 100 mg/l L-Triptófano 50,0 mg/l NAA 0,1 μm Adenina 30 μm Sacarosa 8 % Carbón activo 0,5 % Tabla 1. Suplementos orgánicos y reagentes añadidos al medio basal B5 para el cultivo in vitro de embriones extraidos de semillas abortantes de Ulmus minor

5 Fig. 1. a - Embrión extraído de la semilla y cultivado in vitro mostrando el desarrollo de tres cotiledones. b - Embriones cultivados in vitro mostrando una anormal proliferación de tejidos. c -. Embrión cultivado in vitro en el que se ha producido la emisión y crecimiento de la radícula, y en la que se observa el desarrollo de los pelos radiculares.