GBS CAPÍTULO 5.- MANUAL DE TRABAJO. TÉCNICA ANALÍTICA. TÉCNICA ANALÍTICA

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1 CAPÍTULO 5.- MANUAL DE TRABAJO. TÉCNICA ANALÍTICA. TÉCNICA ANALÍTICA Por: Eva Rodríguez, Laura Isac, Natividad Fernández, M. Dolores Salas. () FUNDAMENTO El análisis se realiza sobre muestras in vivo del fango activado de una EDAR a la que se le pueden realizar tres tipos de análisis: sobre muestra viva, sobre muestra viva con colorante o sobre muestra fijada y teñida. PROCEDIMIENTO OPERATIVO DE TRATAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS Preparación del microscopio. 1.- Realizar ajuste Köhler. 2.- Ajuste de anillos para contraste de fases. 3.- Limpieza de objetivos y portaobjetos con solución de etanol 4.- Utilizar filtro azul para observar tinciones o resaltar contornos en organismos vivos. 5.- Utilizar filtro verde para contraste de fases y resaltar tinciones Gram y Neisser difíciles de determinar. Toma de muestras 1.- Utilizar botes de plástico limpios de ml. 2.- Toma de muestras a profundidad determinada y fijada. 3.- Punto de muestreo fijo y en zona de máxima homogeneidad del fango. 4.- Dejar siempre el bote de muestreo ¼ de su contenido vacío. 5.- Fijar inmediatamente una submuestra con líquido de Bowin (5 ml Bouin / 100 ml de muestra, o formol al 4%). 6.- Proceder para el transporte y conservación según el protocolo establecido en el Anejo 2. Procedimiento operativo 1.- Agitar con suavidad la muestra para homogeneizar cuando se quieran observar las características del flóculo o cuando se quiera realizar un análisis cuantitativo. 2.- Dejar decantar y tomar la muestra de la porción sedimentada cuando se quiera estudiar diversidad de organismos. 3.- Tomar entre 25 y 50 μl con una micropipeta con punta de boca ancha o una pipeta Pasteur, depositarla en un porta (previamente desengrasado) y colocar encima un cubreobjetos. En caso de no disponer de micropipeta, se puede pesar una gota de fango sobre un portaobjetos, conociendo previamente el peso de éste y la densidad del fango activado. 4.- Proceder al análisis microscópico de la preparación utilizando los distintos objetivos. El último objetivo a utilizar es el de 100X con aceite de inmersión, para observar en detalle las distintas estructuras. 5.- Observar al menos de 2 a 3 preparaciones de la muestra. 6.- Se recomienda como complemento el análisis de los SSLM, V30 e IVF. INTERFERENCIAS La muestra debe ser lo más reciente posible y realizar su análisis cuanto antes. En caso de retraso es necesario mantenerla según lo establecido en el anejo 2 para conservación de muestras. Si el análisis es sobre protozoos no debe retardarse más de 24 horas. Si por el contrario es sobre bacterias filamentosas el margen puede ampliarse, mencionando la bibliografía márgenes de hasta 6 días. Es preferible siempre realizar el análisis cuanto antes a fin de evitar variaciones en la composición biótica del fango así como desestabilizaciones del flóculo. Tratamiento de las muestras 1.- Muestras in vivo: * Para observación de la muestra sin alterar, colocar directamente en un portaobjeto con un cubreobjetos. * Para inmovilizar organismos y observar estructuras visibles sin necesidad de tinción, colocar la gota sobre el porta, poner un cubre y prensar suavemente. También se puede utilizar un inmovilizador tóxico como el sulfato de níquel al 0,01 %. * Estudio ccualitativo de organismos. 2.- Muestras fijadas: * Estudio cuantitativo de organismos. * Observación de las estructuras tal y como estaban en el momento de tomar la muestra al añadir un reactivo de fijación como el líquido de Bouin (existe riesgo de deformación de los organismos). 3.- Muestras teñidas: * Para resaltar estructuras específicas que no se observan fácilmente en la muestra in vivo. PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA HOJA DE TRABAJO El análisis biológico completo consta de varios apartados: 1.- Valoración macroscópica y microscópica de un fango activo: Índice de fango. 2.- Identificación y cuantificación bacteriana (organismos filamentosos). 3.- Identificación y cuantificación protozoaria. 4.- Valoración general del estado del fango: conclusiones 1.- EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE UN FANGO BIOLÓ- GICO: Niveles macroscópicos y microscópicos. Índice de fango. La valoración de las características macroscópicas del fango activado se realiza a través del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango activado que decanta en una probeta o cono Imhoff, tras un periodo de 30 minutos. El análisis consiste en dejar que la muestra de fango activo sedimente los sólidos fácilmente decantables, sin necesidad 57

2 BS de adición de productos químicos (sin coagulación ni floculación), simplemente dejando decantar durante un tiempo determinado (30 min.). Se analizarán tanto las propiedades del proceso de decantación como las características del clarificado. Como características macroscópicas se entienden aquellas características observables a simple vista sobre el aspecto del fango activado y del clarificado de la V30. - Turbidez - Flóculos en suspensión en el clarificado - Sedimentabilidad del fango - Olor A nivel microscópico: - Forma del flóculo - Tamaño del flóculo - Estructura y textura del flóculo - Cobertura de la masa de fango sobre la circunferencia de un objetivo de 10x - Presencia de filamentos en el flóculo y en disolución - Diversidad de protozoos Todas estas observaciones se han de realizar con un objetivo de 10x y, al menos, sobre 2 preparaciones distintas de la muestra, que será homogenizada previamente con suavidad. Con ayuda de una pipeta Pasteur, se toma un pequeño volumen de la suspensión biológica, se deposita sobre un portaobjetos y se coloca encima un cubreobjetos. La información que se deduce de las observaciones microscópicas, junto con la obtenida durante el ensayo de decantación en probeta o V 30, permiten otorgar un valor final de puntuación que permitirá evaluar la calidad del fango, al encontrarse dicha puntuación divida en distintas categorías. Se valoran las siguientes características: Turbidez: Alta: Visibilidad muy baja a través de la probeta Media: Visibilidad media a través de la probeta Baja: Visibilidad alta a través de la probeta Flóculos en suspensión: Alta: abundancia de microflóculos Media: presencia de microflóculos Baja: prácticamente ausencia de microflóculos Sedimentabilidad: Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros minutos del ensayo y el fango está muy compactado Media: la mayor parte del fango decanta entre minutos y se observa un ligero esponjamiento Baja: la mayor parte del fango decanta después de 20 minutos y se observa un claro esponjamiento Olor: característica macroscópica del fango activado que se define como correcto o incorrecto, indicando este último situaciones como septicidad, presencia de vertidos, etc. El máximo valor obtenido por las características macroscópicas es de 30. Si se produce un levantamiento total o mayoritario de la manta de fangos, se indica como valor macroscópico cero. A nivel orientativo y con relación a la turbidez, por su complejidad en la evaluación, se muestran algunas fotografías que permiten ajustar los tres rangos de este parámetro (Figura 1). La turbidez se desglosa en esta valoración de los microflóculos en suspensión del clarificado, valorándose ambos de forma independiente. Por lo tanto la medición directa sobre el clarificado con un turbidímetro nos proporcionará un valor erróneo. Como referencia, tomaremos un objeto que se colocará en la parte trasera de la probeta. Si la forma del objeto se observa claramente, definiremos la muestra como poco turbia (turbidez baja). En este caso se pueden incluso apreciar los dibujos existentes sobre el objeto. Si los contornos se aprecian, pero no es posible observar el dibujo de la superficie, en ese caso hablaremos de turbidez media. Por último, si no es imposible observar ningún dibujo y los contornos del objeto quedan difuminados e incluso no se ven, estaremos hablando de turbidez alta. El conjunto de características microscópicas recogidas durante la observación microscópica se refieren al examen del estado morfológico y estructural del flóculo de fango activo (forma, tamaño, estructura, textura, cobertura, etc.) y al examen del componente biótico del ecosistema fango activo, representado por las poblaciones de bacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados). Figura 1: Distintos niveles de turbidez, evaluados sobre el clarificado La evaluación de estas características proporciona información sobre las propiedades de decantación y compactación del fango activo durante la fase de clarificación del licor mezcla, así como del nivel y estado de colonización de la microfauna, aludiendo, indirectamente, al grado de actividad biológica del proceso de depuración. Procedimiento operativo: Este procedimiento se destina a la observación de la muestra sin alterar, de la estructura flocular y de la disposición del entramado filamentoso. Indicado en la evaluación del estado de formación flocular así como en el reconocimiento de ciertas características morfológicas y estructurales empleadas en la identificación de bacterias filamentosas. Las características estudiadas son: Forma: característica que define la morfología externa del flóculo como regular si aparece de forma redondeada e irregular si difiere de esta configuración. 58

3 Tamaño: Pequeño: tamaño menor de 150 μm Medio: tamaño entre 150 y 500 μm (Incluidos ambos valores) Grande: tamaño mayor de 500 μm Estructura: Compacto: no existen prácticamente huecos en la estructura interna del flóculo Medio: se detectan algunos huecos Abierta: existen bastantes huecos dentro del flóculo que rompen la unidad interna Textura: característica que alude al grado de cohesión entre las partículas que forman el flóculo, estableciéndose las categorías fuerte y débil en función a la ausencia o presencia de disgregación de los flóculos, respectivamente, tras punción sobre el cubreobjetos (Manual de laboratorio, Ayuntamiento de Madrid, 1997). Cobertura: característica que valora si la unión de todos los flóculos presentes en el ocular de 10X cubren menos del 10 % de su superficie, del % o más del 50 %. Filamentos en el flóculo: Menos de 5 filamentos por flóculo Entre 5-20 filamentos por flóculo (Incluidos ambos valores) Más de 20 filamentos por flóculo Filamentos en disolución: característica que cuantifica la existencia de filamentos libres entre los espacios ínter floculares del licor mezcla. Si no son observables será baja, mientras que si se observan normalmente será alta. Diversidad de protozoos: Menos de 4 especies De 4-7 especies (Incluidos ambos valores) Más de 7 especies Otras observaciones presencia/ausencia de crecimiento disperso, presencia/ausencia de fibras orgánicas, presencia/ ausencia de partículas inorgánicas, presencia/ausencia de bacterias helicoidales, presencia/ausencia de Zoogloea sp., etc. El máximo valor obtenido por las características microscópicas es de 70. Todas estas observaciones se han de realizar con un objetivo de 10X sobre al menos 2 muestras previamente homogeneizadas suavemente con ayuda de una pipeta Pasteur. El volumen de muestra se deposita sobre un porta-objetos y se coloca encima un cubre-objetos. Es recomendable realizar una medida del tamaño flocular entre 15 flóculos elegidos al azar, para decidir en que categoría se engloban. Es conveniente realizar otras observaciones de presencia/ ausencia, de: Bacterias helicoidales, fibras orgánicas, Zoogloea sp., partículas inorgánicas, burbujas, color, hinchazón y espumas o natas en superficie. A nivel orientativo y con relación al tamaño, estructura y textura, se muestran algunas fotografías que permiten ajustar los rangos de estos parámetros (Figura 2). La información obtenida tanto del estudio microscópico como del ensayo de decantación (V 30), permiten otorgar un valor final de puntuación (Tabla 2), Índice de Fango, que permitirá evaluar la calidad del fango al encontrarse dicha puntuación dividida en distintas categorías (Tabla 3), obteniéndose como valor final una evaluación del fango comprendida entre que permite definir una categoría de IF entre pésimo y óptimo. El parámetro IF ha resultado ser un buen sistema de control rápido con el que obtener un índice de formación flocular, orientativo del estado del cultivo biológico, que nos aproxima a los rendimientos de depuración en las EDAR de fangos activos. En general, podemos definir el Índice de Fango (IF) como un parámetro indicador del estado de floculación en el reactor biológico, que nos aporta información para modificar las condiciones del cultivo y de esta forma mejorar la eficacia de la reducción de la DQO y los SS en las EDAR, tomándose con reserva las relaciones que mantiene con la DBO, Nitrógeno y Fósforo. Una observación general del fango activado que puede durar unos veinte minutos, nos proporcionará idea del estado de éste y de la respuesta esperable de la EDAR convencional. El IF es un complemento analítico aplicable a plantas depuradoras de fangos activos de grandes núcleos de población, en las que a través de la observación del estado de floculación se podrá valorar la calidad del proceso de depuración, entendida ésta como rendimientos depuradores. En plantas pequeñas se presenta como un sistema idóneo, dónde con reducidos costes un mismo especialista puede controlar las condiciones de explotación de varias EDAR Si a esto último añadimos que muchas de estas plantas pequeñas se encuentran localizadas en zo- ESTRUCTURAS FLOCULARES Figura 2: Distintos raangos de tamaños y estructura floculares. 59

4 BS nas sensibles (Oron et al., 2002), la aplicación del IF como parámetro complementario sería muy deseable. La valoración del estado de floculación de la materia orgánica permite tomar medidas encaminadas a la mejora de este proceso para así obtener buenos clarificados y reducir de esta forma la emisión de contaminantes. Por otra parte, es sabido que una gran proporción de la estructura del flóculo de fango activo está compuesta por polímeros extracelulares (EPS, extracellular exopolymers), los cuales son considerados como los principales responsables de la adhesión de las células microbianas a la estructura flocular y de la cohesión del conjunto. Las propiedades adsorbentes de los EPS han sido bien documentadas por distintos autores en términos de bioadsorción de contaminantes y tóxicos (iones metálicos, por ejemplo). Sin embar- Turbidez CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Alta Media 4,5 Baja 9 Flóculos en suspensión Alta 0 Media 4,5 Baja 9 Sedimentabilidad Alta 9 Media 4,5 Baja 0 Olor Correcto 3 Incorrecto 0 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS Forma Regular 4 Irregular 0 Tamaño Grande 4 Medio 7 Pequeño 0 Estructura Compacta 18 Media 9 Abierta 0 Textura Fuerte 4 Débil 0 Cobertura < 10% % 7 >50% 3,5 Filamentos en flóculos > <5 14 Filamentos en disolución Alta 0 Baja 3 Diversidad de Protozoos <7 especies 13 ÍNDICE DE FANGO 4-7 especies 7 <4 especies 0 TOTAL Tabla 2: Valoración del índice de fango. Los extremos de los intervalos pertenecen a las categorías intermedias. Es necesario revisar los apartados de filamentos y protozoos tras los recuentos, para reajustarlos a los valores obtenidos. 0 60

5 go, el papel de los EPS en la eliminación biológica de nutrientes como el nitrógeno o el fósforo no ha sido abordado hasta muy recientemente debido a la falta de herramientas adecuadas. Cloete y Oosthuizen (2001) haciendo uso del análisis mediante EDS (Energy Dispersive Spectrometry) y microanálisis con rayos X, han estimado que la proporción de fósforo en los cúmulos bacterianos de una muestra de fango activo procedente de una planta en la que existe eliminación biológica de fósforo, es de un 57-59% del total. Estos mismos autores encontraron que los EPS aislados de muestras biológicas de igual procedencia, retuvieron, por sí solos, entre el 27-30% del total del fósforo estimado. Estos resultados sugieren que la eliminación de fósforo en el fango activo podría ser debida no sólo a los organismos acumuladores de fosfato, sino también al EPS como reservorio de este elemento. Con esta explicación, lo que quiere significarse es que la detección precoz mediante el IF de alteraciones en el estado de floculación, evitará en buena proporción no sólo la liberación de sólidos con el efluente, sino también de nutrientes a los cauces receptores. En definitiva, el IF se establece como un sistema práctico del control de la formación flocular en la EDAR y como un útil complemento en la determinación de las condiciones de explotación, repercutiendo positivamente sobre el medio ambiente. ÍNDICE DE FANGOS 0-20 pésimo malo regular bueno óptimo Tabla 3: Categorías de Índice de Fango. Pertenecen los extremos de los intervalos a las categorías intermedias. Es necesario revisar los apartados de filamentos y protozoos tras los recuentos, para reajustarlos a los valores obtenidos. 2.- EVALUACIÓN DEL DESARROLLO DE BACTERIAS FI- LAMENTOSAS EN UN FANGO ACTIVO Los organismos filamentosos ocupan, a baja concentración, un papel fundamental en la formación del entramado adecuado del flóculo. Un crecimiento excesivo de estos microorganismos provoca alteraciones en la relación superficie/ volumen del flóculo que se traduce en problemas de sedimentabilidad del fango con el consiguiente empeoramiento de la calidad del efluente. La respuesta de los organismos filamentosos a las Tinciones Gram, Neisser, PHB, etc., realizadas sobre frotis fijos de fango activo, permiten, junto con las características morfológicas y estructurales deducidas de la observación in vivo, su identificación. Procedimiento operativo: 1. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis, perfectamente seco, que ha sido teñido según el protocolo convenido (capítulo 3). 2. Seleccionar el objetivo de inmersión o 100x y proceder a la observación. 3. Una vez concluido el análisis microscópico, retirar el objetivo con cuidado y limpiarlo con un paño suave impregnado en la solución éter-etanol 3:1. Estudiaremos los siguientes puntos: Organismo filamentoso dominante Organismo filamentoso secundario Otros filamentos de interés La identificación bacteriana se realizará fundamentalmente sobre el filamento dominante y el secundario. Determinación de los efectos de dichos microorganismos sobre la estructura flocular: Formación de puentes ínter floculares Disgregación flocular Filamentos libres en los espacios ínter floculares La proliferación total de filamentos se valorará según la Tabla 4, en función de la abundancia relativa, principalmente, de los organismos dominante y secundario, aunque dejando constancia de la presencia de otras filamentosas que, por su abundancia, se consideren de interés. Paralelamente, se pueden realizar dos aproximaciones más exactas de la cantidad de filamentos: una valoración semicuantitativa en la que se contabiliza el número de filamentos observados que interceptan la circunferencia del objetivo de 40x, para la cual la muestra debe estar teñida con cualquier tinción in vivo; o una valoración cuantitativa de los m/ml de filamentos según el recuento de los cortes en la diagonal de la cámara Neubauer improved a 20x para lo cual la muestra debe estar in vivo. La metodología de este último procedimiento, que viene expuesta con más detalle en Arnáiz et al. (1999), requiere de la realización de cuatro réplicas de la muestra, en la que se cuentan los cortes de los filamentos sobre la cuadrícula definida en los 16 cuadrados de la diagonal de la cámara, valor que hay que multiplicar por el factor 37,12. La media del número de cortes por el factor valora los m/ml de filamentos. Esta técnica no es adecuada para Nocardia sp. Ambos sistemas no son comparativos, siendo más exacto el recuento sobre la cámara Neubauer improved. En cualquier caso, estos sistemas pueden servir de referencia si se practican de forma metódica en la EDAR, al detectar la proliferación de bacterias filamentosas y las oscilaciones en la abundancia de éstas. Debido a que determinadas bacterias originan problemas de turbidez (Bacilllus sp., Tipo ) se realizará una determinación cualitativa independiente y una cuantificación para este tipo de organismos, según la tabla 5. Esta valoración se realizará sobre los filamentos que se encuentren situados en el espacio ínterflocular. 3.- EVALUACIÓN DE LA MICROFAUNA PRESENTE EN FANGOS ACTIVOS En esta hoja de trabajo se pretende valorar la diversidad de la microfauna presente (Índice Biótico de fango (SBI) e Índice de Diversidad de Shannon (H)) e identificar y cuantificar los organismos presentes (protozoos y metazoos) en la muestra. 61

6 BS VALORACIÓN DE FILAMENTOS EN FUNCIÓN DE LA ABUNDANCIA RELATIVA VALOR ABUNDANCIA SIGNIFICADO NUMÉRICO 0 Ninguno 1 Pocos 2 Alguno 3 Comunes 4 Muy comunes 5 Abundantes 6 Excesivos Hay filamentos pero se observan sólo en algunos flóculos Se ven filamentos en los flóculos, pero no en todos ellos Se observan filamentos en todos los flóculos pero en pequeña cantidad (1-5 filamentos por flóculo) Se observan filamentos en todos los flóculos, pero con una densidad media (5-20 por flóculo) Hay filamentos en todos los flóculos y con densidad alta (>20/flóculo) Filamentos presentes en todos los flóculos; hay más filamentos que flóculos. Tabla 4: Cuantificación de microorganismos filamentosos, Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (2004). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. Lewis Publishers. De estos organismos se han clasificado en la hoja de trabajo correspondiente los más comunes en aparición, a fin de simplificar el trabajo. La observación se hará a 10X/40X aumentos con volúmenes de 25 µl y en dos réplicas. La metodología a seguir es la establecida por Madoni (1994) para el cálculo del SBI complementado con el reparto ABUNDANCIA RELATIVA PARA FILAMENTOS LIBRES VALOR NUMÉRICO ABUNDANCIA 0 Pocos 1 Medio 2 Muchos Tabla 5: Cuantificación de microorganismos filamentosos en el espacio interflocular. porcentual de los organismos y el Índice de Shannon (H = - (Pi(log2Pi) (bit)); Siendo Pi = nº organismos SPA/ nº total organismos. El Índice de Shanon de biodiversidad permite completar este estudio aportando otro parámetro más en el estudio biótico. Aporta las unidades de información que circulan por el sistema en bit. Queda definido en la Teoría de los sistemas Ecológicos de Margalef (1992). Descripción del índice Madoni (Madoni, 1994). Desarrollo *Visu preliminar: 50 µl o 1 gota de pipeta Pasteur de la muestra, para valoración cualitativa de las especies presentes *Recuento de pequeños flagelados: 25 µl (2 réplicas) a 200x con la cámara de Fuchs-Rosenthal en la diagonal completa (16 cuadrados) *Recuento de organismos: 25 µl (2 réplicas) a 100x Datos a tener en cuenta: *Es recomendable utilizar cubres de 18 x 18 mm para evitar la desecación de la muestra *Organismos a considerar en el recuento: grandes flagelados, tecamebas y metazoos *Organismos no considerados: Amebas desnudas, algas, crustáceos... *En los ciliados coloniales se contabiliza cada organismo *Los organismos detectados en el visu, pero no en el recuento, tienen una abundancia de uno *No es necesario identificar a nivel de especie a flagelados, rotíferos y nematodos * No afectan al porcentaje de grupos funcionales los ciliados carnívoros y suctores Los resultados que se emplearán para determinar el valor final, según la tabla del anejo 1 (tabla para la determinación del índice biótico), son: *Grupo dominante *Densidad de la microfauna en número de individuos/ml *Número de especies detectadas *Recuento de pequeños flagelados * Índice biótico de fango: SBI Clase de Madoni correspondiente al valor de SBI. Consideraciones a tener en cuenta para el SBI y el H. - Rotíferos y nematodos, debido a la complejidad que supone identificarlos a nivel de especie, contribuyen cada uno a una sola unidad sistemática; sin embargo, si somos capaces de distinguir géneros es importante reflejarlos para el cálculo de H. - La determinación de amebas testáceas se realiza sólo a nivel de género para el SBI. Sin embargo, si es posible llegar a diferenciar especies hay que señalarlo para determinar H. - En cuanto a los grupos-clave sólo los ciliados bacteriófagos se engloban dentro de los 3 grupos funcionales (nadadores de vida libre, reptantes o móviles de fondo y sésiles o pedunculados). - Los ciliados carnívoros tan sólo contribuyen a la densidad y diversidad total de la microfauna. Así pues, ciliados nadadores predadores, tales como Litonotus sp., Amphileptus sp., 62

7 Coleps hirtus, Acineria incurvata y Sphathidium sp. deben ser apartados del grupo de los ciliados nadadores de vida libre. De la misma forma, los ciliados predadores sésiles o pedunculados, como los suctores Podophrya sp., Tokophrya sp. y Acineta sp. deben ser igualmente apartados del grupo de los ciliados sésiles o pedunculados, considerándose tan sólo a la hora de computar densidad y diversidad total de la microfauna. - No se tienen en cuenta las larvas telotrocas, pero se reseña en observaciones su abundancia. - Es necesario realizar los recuentos de organismos contando también los contenidos en el rebose que se pueda producir en el cubreobjetos. - Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están incluidas en el mismo grupo para el SBI, no así para H. - Colonias muy numerosas de peritricos falsean los resultados finales de los recuentos. Por ello, el procedimiento a seguir cuando aparecen es: realizar los dos recuentos normales de organismos y si aparece una colonia grande se obvia en el resultado final. Una vez terminado, se realizan de nuevo dos conteos y esta vez sólo se contabiliza el organismo colonial. Una vez terminado se sustituyen los valores del colonial en los dos recuentos iniciales y se realiza el resultado final. - La lista de especies observadas se realiza con al menos dos organismos vistos de cada especie. - El SBI es adecuado para tratamientos convencionales de fangos activos, contacto-estabilización y aireación prolongada. La medida de diversidad, H, es adecuada para cualquier ecosistema. -Las amebas testáceas deben contabilizarse solo cuando están vivas, por ello se prestará especial atención a su transparencia y si es necesario aplicaremos Rosa de Bengala. Como idea general: se tomarán las testáceas oscuras como inertes. Sin embargo, esto plantea un problema para aquellas testáceas que utilizan material extracelular (piedras, diatomeas...) para generar su teca (testas aglutinadas), pues casi siempre son oscuras. En el caso de un fango activo con abundancia de testáceas se procederá a realizar la prueba de actividad con el Rosa de Bengala, la fórmula (Figura 3) C 2 OH 2 O 5 T 4 Cl 2 Na 2. Este reactivo se absorbe por la superficie protoplasmática, coloreándose de rosa. Se añade un poco de reactivo a 50 ml de fango activo y se deja reposar unos 15 minutos, tras lo que se realiza el recuento. Situaciones anómalas en el SBI: La presencia masiva de grandes flagelados por un lado o de nematodos y rotíferos por otro, plantea dificultades a la hora de aplicar el SBI. En estos casos se pueden plantear dos situaciones: 1.- Sólo existen estos organismos anteriormente citados, en cuyo caso no se puede aplicar el SBI. Se indicarían las densidades de tales organismos. 2.- Existen otros organismos que sí están recogidos en el SBI. En este caso se aplicaría el SBI a estos grupos de organismos, puntualizando que existen determinadas densidades de organismos no recogidos en dicha clasificación. Otra situación dificultosa es la aparición de Vorticella microstoma más V. infusionum o de Opercularia no dominante, pero sí abundantes. En este caso se aplica el SBI normalmente y se puntualiza que aparecen estos grupos de organismos a tales densidades. 4.- EVALUACIÓN TOTAL DEL FANGO ACTIVO: CONCLU- SIONES En esta última hoja de trabajo se recogen las conclusiones parciales de cada una de las hojas anteriores de forma que nos AMEBA ENQUISTADA: CITOPLASMA OSCURO, ESFÉRICO Y REGULAR. AMEBAS TESTÁCEAS INACTIVAS ACTIVAS AMEBA DESNUDA Figura 3: Reacción al rosa de Bengala de distintas amebas. 63

8 BS aporten una visión clara de la calidad del fango y de la calidad previsible del agua de salida, así como de los parámetros de los cuales son bioindicadores los organismos presentes. En este apartado se recogerán todas las anomalías de aplicación de los índices antes citadas, así como todas las consideraciones que el operador crea que es necesario tener en cuenta. BIBLIOGRAFÍA (Se recoge en este listado tanto la bibliografía utilizada en el texto, como otras citas de interés) Antonietti R., Broglio P. Y Madoni P. (1982).- Valutazione di parametri biologici come indici di efficienza di depurazione in impianti a fanghi attivi. Ingegneria Ambientale, 11: APHA, AWWA, WPCF (1992). Métodos Normalizados para el análisis de aguas potables y residuales. Ed. Díaz de Santos, Madrid. Arnáiz, C., Jiménez, C. y Estévez, F. (1999). Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activos. Tecnología del Agua 193, Cloete, T. E. y Oosthuizen, D. J. (2001). 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9 Madoni, P. y Ghetti, P. F. (1981). The structure of ciliated protozoa conmunities in biological sewage-treatment plants. Hidrobiologia 83, Margalef, R. (1983). Limnología. Ed. Omega. Barcelona. Margalef, R. (1989). Ecología. Ed. Omega, Barcelona. Medio Ambiente (2001). Informe de Medio Ambiente en Andalucía. Consejería de Medio Ambiente. Junta de Andalucía. Moro, P. y Fernández-Leborans, G. (1988). Aparición de microroganismos filamentosos en fangos activos. Ingeniería Química, Junio 1988, Oron, G., Bicj, A. y Gillerman, L. (2002). Trends and opportunities for small-scale wastewater treatment and reclamation plants in the Eastern Mediterranean Basin. Libro de ponencias principales del Congreso Internacional de Tecnologías de Pequeña Escala para la Depuración y Gestión de aguas residuales en el Ámbito Mediterráneo, Sevilla, de marzo, Ratsak, C. H., Maarsen, K. A. y Kooijman, S. A. L.M. (1996). Effects of protozoa on carbon mineralization in activated sludge. Wat. Res. 30, 1, Rodríguez, E (2004). Otros índices de calidad aplicados a los fangos activos: comparativa de resultados. Marzo Curso especializado de la Fundación EMASESA titulado Protozoos en el fango activado. Rodríguez, E. (2004). Objetivos y propuestas para la realización de la sesión interlaboratorios Comunicación oral en la Jornada de Transferencia de Tecnología sobre Ejercicios interlaboratorios en fangos activos como sistema de control de calidad en la EDAR (Sevilla, Octubre de 2004). Rodríguez, E., Fernández, N., Isac, L. y Salas, M.D. (2002). Ecology and the role of microorganims: work sistem to optimize the small treatment plants. Congreso Internacional sobre Tecnologías de pequeña escala para la depuración y gestión de las Aguas residuales en el ámbito Mediterráneo. Marzo de 2002, CENTA. Rodríguez, E., Fernández, N., Isac, L., Salas, M.D. (2003). Seminario Teórico-Práctico sobre microbiología del fango activo e índices bióticos. Máster Universitario en Análisis y Tecnologías del agua. Facultad de Química. Universidad de Sevilla. Nº SE Rodríguez, E., Fernández, N., Salas, M.D. Isac, L (2003). Informe de los ensayos interlaboratorios de fangos activos. Nº SE Rodríguez, E., Isac, L., E., Álvarez, M., Zornoza, A., y Fernández, N. (2005). Tratamiento y conservación de muestras para análisis microbiológicos de fangos activos. Tecnología del Agua (En publicación). Schonborn, W. (1992). The role of protozoan conmunities in freshwater and soil ecosystems. Acta protozoologica 31, Sponza, D. T. (2002). Extracellular polymer substances and physicochemical properties of flocs in steady- and unsteady-state activated sludge systems. Process Biochemistry 37, Stanier, R., Ingraham, J. L., Wheelis, M. L. y Painter, P. R. (1996). Microbiología, 2ª Edición. Ed Reverté, Barcelona. Stapleton, C. M., Kay, D., Jackson, G. F. y Wyer, M. D. (2000). Estimated inorganic nutrient inputs to the coastal waters of Jersey from catchment and waste water sources. Wat. Res. 34, 3, Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed.Omega, S.A. (Barcelona). 65

10 BS ANEJOS ANEJO 1 : FORMATOS DE RECOGIDA DE DATOS 66

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12 BS ANEJO 2: TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE MUES- TRAS Transporte El transporte se realizará en nevera, con el bote, lo más estable posible, rodeado de material envolvente para evitar roturas floculares y movimientos bruscos. No es recomendable la refrigeración excesiva, aunque sí mantener una temperatura en torno a 13º C. En la medida de lo posible realizar el transporte mediante envío urgente. ENSAYO MICROSCÓPICO Conservación de las muestras Inmediatamente a la recepción de las muestras se tomarán tres alícuotas con distintos tratamientos: Alícuota 1: Destinada a la caracterización del flóculo. Mantenida a temperatura ambiente y sin airear. Alícuota 2: Destinada a la caracterización de la microfauna (protozoos). Mantenida a temperatura ambiente, con oxigenación mediante piedra porosa (compresor de aire). La oxigenación debe colocarse en superficie una vez que ha decantado la muestra, de forma que exista oxígeno para el metabolismo protozoario, pero sin que se modifique el fango por la agitación. Alícuota 3: Destinada a la caracterización bacteriana. Mantenida en frigorífico, sin agitación. Previamente se realizarán 5 frotis bacterianos para su tinción posterior. En todos los casos es recomendable realizar el análisis antes de 5 horas desde la toma de muestras, sobre todo para el caso de los fangos jóvenes (muy inestables). Es admisible un periodo de 24 horas y en oxidación total incluso de 48 horas. ANEJO 3 : LÁMINAS FOTOGRÁFICAS ENSAYO DE LA V30 Distintos estados de formación flocular A: Flóculo de fango activo ideal ; 100x, contrastes de fases B: Flóculo de fango activo bien formado en sistema con elevada edad de fangos; 100x, campo claro C: Estructura flocular abierta por la proliferación del filamento Sphaerotilus natans; 400x, campo claro. Tinción de Gram. D: Disgregación flocular ocasionada por episodio de bulking filamentoso; 100x; Contraste de fases. E: Crecimiento disperso local; 400x, campo claro, tinción de gram. Distintos ensayos de decantabilidad del fango activo. 68

13 CARACTERISITICAS Y REACCIONES BACTERIANAS ALTERACIONES EN LA DECANTABILIDAD Respuesta a la tinción de Gram: 1.- Gram positiva; 1000 x, campo claro 2.- Gram negativo; 1000 X. Campo claro Flóculo en alfiler o Pin-Floc. Respuesta a la tinción de Neisser: 1.- Neisser positivo. 400 x, campo claro 2.- Neisser negativo; Gránulos Neisser positivo; 1000 X. Campo claro Bulking filamentoso. Respuesta a la tinción de PHB: 1.- PHB negativo x, campo claro 2.- PHB positivo; 1000 X. Campo claro Desnitrificación Ramificación: 1.- Ramificación falsa x, campo claro 2.- Ramificación verdadera; 1000 X. Campo claro Crecimiento bacteriano: 1.- Crecimiento disperso. 400 x, campo claro 2.- Crecimiento epifítico; 1000 X. Campo claro 69

14 BS PROTOZOOS Y METAZOOS: GRUPOS FUNCIONALES Flagelados: pequeños y grandes PROTISTAS PROTISTAS FLAGELADOS o EUGLÉNIDOS o BODÓNIDOS o COANOFLAGELADOS Amebas: Desnudas y con teca. Ciliado nadador Ciliado reptante PROTISTAS AMEBOIDES o AMEBAS DESNUDAS o AMEBAS TESTÁCEAS o ACTINÓPODOS PROTISTAS ALVEOLADOS o HETEROTRICOS o ESPIROTRICOS: HIPOTRICOS Y ESTICOTRICOS o LITOSTOMADOS: HAPTÓRIDOS Y PLEUROSTOMÁTIDOS o FILOFARÍNGEOS Y SUCTORES o NASOFÓREOS o COLPÓDEOS o PROSTOMADOS o OLIGOHIMENÓFOROS METAZOOS ROTÍFEROS GASTROTRICOS NEMATODOS ANÉLIDOS TARDÍGRADOS Ciliado sésil: solitario, colonial y lorigado Ciliado carnívoro: Nadador y sésil Metazoos: nematodo, rotífero y anélido. 70

15 GRUPOS DE PROTISTAS PRESENTES EN FANGOS ACTIVOS FLAGELADOS ZOOFLAGELADOS Bodo saltans, Pequeños flagelados sin identificar, Coanoflagelados Pequeños flagelados EUGLENOFITOS Euglena sp., Entosiphon sp., Peranema sp. Grandes flagelados RIZÓPODOS AMEBOIDES Mayorella sp., Familia Amoebidae Amebas desnudas AMEBAS TESTÁCEAS Euglypha sp., Euglypha alveolata, Trinema sp., Arcella sp., Arcella hemisphaerica, Arcella vulgaris, Arcella gibbosa, Arcella arenaria, Arcella discoides, Pyxidicula sp., Hyalosphenia papilio, Hyalosphenia elegans, Difflugia elegans, Difflugia bacillifera, Amebas testáceas Centropyxis sp., Centropyxis aculeata ACTINÓPODOS HELIOZOOS Actinosphaerium sp., Actinophrys sp. Heliozoos CILIADOS Spirostomum sp., Spirostomum teres, Blepharisma sp. Nadadores ESPIROTRICOS Euplotes sp., Euplotes aediculatus, Euplotes affinis, Euplotes patella, Euplotes moebiusi, Aspidisca cicada (sinónimo de A. costata), Aspidisca sp., Aspidisca lynceus, Holosticha sp., Oxytricha sp., Parurosoma sp., Stylonychia sp., Stylonychia Reptantes mytilus-complex Stentor sp. Sésiles Colpoda ecaudata, Prorodon teres*, Plagiocampa sp.*, Holophrya sp.*, Paramecium caudatum, Paramecium aurelia-complex, Paramecium bursaria, Uronema sp., Uronema nigricans, Cinetochilum margaritaceum, Cyclidium sp., Tetrahymena sp., Colpidium sp. Nadadores HOLOTRICOS Acineria uncinata, Chilodonella uncinata, Gastronauta membranaceus, Trochilia minuta, Drepanomonas sp. Reptantes Paradileptus sp., Spathidium sp., Perispira sp.*, Litonotus sp., Litonotus fasciola, Litonotus crystallinus, Litonotus cygnus, Litonotus lamella, Coleps sp. Carnívoros PERITRICOS Complejo Vorticella convallaria, Vorticella gracilis (Complejo V. convallaria), Vorticella picta, Vorticella campanula, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella microstoma, V. alpestris (Complejo V. microstoma), Complejo Vorticella aquadulcis, Vorticella striata (Complejo V. aquadulcis), Carchesium sp., Epistylis sp., Epistylis chrysemydis, Epistylis plicatilis, Epistylis entzii, Epistylis procumbens Sésiles (sinónimo de E. rotans), Campanella umbellaria, Zoothamnium sp., Opercularia sp., Opercularia microdiscum, Opercularia articulata, Opercularia minima, Opercularia solitaria (O. hebes), Vaginicola sp., Thuricola kellicottiana SUCTORES Podophrya sp., Podophrya fixa, Solenophrya sp., Acineta sp., Tokophrya sp., Tokophrya infusionum, Tokophrya quadripartita, Tokophrya lemnarum, Periacineta sp. Sésiles (carnívoros) Tabla I: Listado de especies más usuales, asignación a los grupos de protistas tradicionalmente conocidos y denominación de éstas en cuanto a su relación con el flóculo y hábitos alimenticios. 71

16 BS EUGLÉNIDOS BODÓNIDOS COANOFLAGELADOS AMEBAS DESNUDAS AMEBAS TESTÁCEAS (con filópodos) AMEBAS TESTÁCEAS (Incertae sedis) ACTINÓPODOS HETEROTRICOS ESPIROTRICOS: HIPOTRICOS Y ESTICOTRICOS LITOSTOMADOS FILOFARÍNGEOS Y SUCTORES NASOFÓREOS COLPÓDEOS PROSTOMADOS OLIGOHIMENÓFOROS ROTÍFEROS GASTROTRICOS NEMATODOS OLIGOQUETOS ARTRÓPODOS TARDÍGRADOS PROTISTAS GRUPO: PROTISTAS FLAGELADOS Euglena sp., Entosiphon sp., Peranema sp. Bodo saltans, Pequeños flagelados Coanoflagelados GRUPO: PROTISTAS AMEBOIDES Mayorella sp., Familia Amoebidae Euglypha sp., Euglypha alveolata, Trinema sp. Arcella sp., Arcella hemisphaerica, Arcella vulgaris, Arcella gibbosa, Arcella arenaria, Arcella discoides, Pyxidicula sp., Hyalosphenia papilio, Hyalosphenia elegans, Difflugia elegans, Difflugia bacillifera, Centropyxis sp., Centropyxis aculeata Actinosphaerium sp., Actinophrys sp. GRUPO: PROTISTAS ALVEOLADOS Stentor sp., Spirostomum sp., Spirostomum teres, Blepharisma sp. Hipotricos: Euplotes sp., Euplotes aediculatus, Euplotes affinis, Euplotes patella, Euplotes moebiusi, Aspidisca cicada (sinónimo de A. costata), Aspidisca sp., Aspidisca lynceus Esticotricos: Holosticha sp., Oxytricha sp., Parurosoma sp., Stylonychia sp., Stylonychia mytilus-complex Haptóridos: Paradileptus sp., Spathidium sp., Perispira sp. Pleurostomátidos: Litonotus sp., Litonotus fasciola, Litonotus crystallinus, Litonotus cygnus, Litonotus lamella, Acineria uncinata Filofaríngeos: Chilodonella uncinata, Gastronauta membranaceus, Trochilia minuta Suctores: Podophrya sp., Podophrya fixa, Solenophrya sp., Acineta sp., Tokophrya sp., Tokophrya infusionum, Tokophrya quadripartita, Tokophrya lemnarum, Periacineta sp. Drepanomonas sp. Colpoda ecaudata Coleps sp., Prorodon teres, Plagiocampa sp., Holophrya sp. Paramecium caudatum, Paramecium aurelia-complex, Paramecium bursaria, Uronema sp., Uronema nigricans, Cinetochilum margaritaceum, Cyclidium sp., Tetrahymena sp., Colpidium sp. Oligohimenóforos peritricos Complejo Vorticella convallaria, Vorticella gracilis (Complejo V. convallaria), Vorticella picta, Vorticella campanula, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella microstoma, V. alpestris (Complejo V. microstoma), Complejo Vorticella aquadulcis, Vorticella striata (Complejo V. aquadulcis), Carchesium sp., Epistylis sp., Epistylis chrysemydis, Epistylis plicatilis, Epistylis entzii, Epistylis procumbens (sinónimo de E. rotans), Campanella umbellaria, Zoothamnium sp., Opercularia sp., Opercularia microdiscum, Opercularia articulata, Opercularia minima, Opercularia solitaria (O. hebes), Vaginicola sp., Thuricola kellicottiana METAZOOS Rotaria sp., Philodina sp., Lecane sp., Testudinella sp., Cephalodella sp. Gastrotrico Nematodo Aelosoma variegatum Copépodo y ácaro Tardígrado Tabla II: Listado de especiesmás usuales y su asignación a grupo (denominación vernacular) 72