Detección de Piscirickettsia salmonis en heces de alevines de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) infectados por transmisión vertical

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1 Detección de Piscirickettsia salmonis en heces de alevines de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) infectados por transmisión vertical Finding of Piscirickettsia salmonis in alevins feces of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) infected by vertical transmission Julio Larenas*, Eugenio Zamorano, Pedro Smith Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile jlarenas@uchile.cl Casilla 2 Correo 15, La Granja, Santiago, Chile * Autor para correspondencia Financiado por FONDECYT y Resumen En el presente trabajo se utilizaron 100 alevines de salmón coho, de 5 g de peso promedio, provenientes de la cruza de reproductores machos y hembras positivos a la presencia de Piscirickettsia salmonis, provenientes de la Décima Región de Chile. Los alevines fueron utilizados con el fin de detectar si eran infectados vía vertical y si éstos eran capaces de eliminar el agente vía fecal. Ninguno de los peces demostró signos clínicos o lesiones de piscirickettsiosis. Cada pez fue eutanasiado, para tomar muestras en duplicado, de riñón (R) y de heces (H), las que fueron fijadas en metanol absoluto y procesadas para inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para la detección de la bacteria. Del total de muestras analizadas, un 21% de los peces resultaron positivos a la infección. Los frotis renales fueron positivos en 12 de las 100 muestras (12%), mientras que los frotis de heces resultaron positivos en 11 peces (11%). De acuerdo con estos resultados, sólo un alevín fue positivo para ambas muestras (R+H+) y 78 resultaron negativos (R-H-). Los resultados indicarían que los peces se infectaron probablemente vía vertical y que algunos de ellos eliminan la bacteria vía fecal, actuando como portadores asintomáticos de P. salmonis y por ende favoreciendo la diseminación del agente patógeno en condiciones naturales de cultivo, aun cuando sus muestras de riñón resulten negativas a la presencia del microorganismo. Abstract In this study, 100 coho salmon fry with a mean weight of 5 g, obtained from male and female brooders positive to Piscirickettsia salmonis from Chile s Tenth Region, were utilized to study whether infection was vertical and whether they were capable of eliminating the agent through feces. None of the fry presented clinical symptoms or lesions characteristic of piscirickettsiosis. Each fish was euthanized and duplicate samples of kidneys (K) and feces (F) were obtained and fixed in absolute methanol to be processed by indirect immunofluorescence (IFAT) to detect the presence of the bacterium. 21% of fish 59

2 tested were positive to infection when all samples were taken into account, while only 12% of kidney smears and 11 % of fecal smears were positive. According to our results, only one fish was positive for both samples(k+f+), and 78 were negative (K-F-). The results seem to indicate that the fish were infected vertically, and that some did eliminate the bacteria through feces, acting as asymptomatic carriers of P. salmonis and thus favoring the spread of the agent under natural conditions of cultivation, even though their kidney smears tested negative for the presence of the causal agent. Palabras claves: Piscirickettsiosis, Transmisión vertical, Excreción, Piscirickettsia salmonis Key words: Piscirickettsiosis, Vertical transmission, Excretion, Piscirickettsia salmonis Introducción La piscirickettsiosis es una enfermedad septicémica producida por Piscirickettsia salmonis, la cual corresponde a una bacteria intracelular obligada que afecta seriamente los cultivos de especies salmonídeas en Chile. Las pérdidas sólo por mortalidad se han estimado que superan los 50 millones de dólares (Smith et al. 1995). Los primeros brotes de piscirickettsiosis se presentaron a fines del año 1989, aunque se ha sugerido que ésta habría estado presente desde 1981 (Bravo y Campos, 1989). Inicialmente se describió sólo en salmón coho ( Síndrome del salmón coho ), pero pronto se afectaron todas las especies salmonídeas cultivadas en Chile, llegando a producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros (Bravo y Campos, 1989; Fryer et al., 1990; Branson y Nieto Díaz- Muñoz, 1991; Cvitanich et al., 1991). La enfermedad se ha descrito principalmente en agua de mar y estuarina (Bravo y Campos, 1989; Fryer et al., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Cvitanich et al., 1991) y muy ocasionalmente en agua dulce (Bravo, 1994; Gaggero et al., 1995). El agente etiológico corresponde a un microorganismo gramnegativo, inmóvil, no encapsulado, pleomórfico, habitualmente cocoide, en pares o en forma de anillo y de un tamaño variable entre 0,5-1,5 µm de diámetro (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). En frotis de sangre y tejidos la bacteria se tiñe con hematoxilina-eosina (HE), Giemsa y azul de metileno (Bravo y Campos, 1989; Cvitanich et al., 1991), observándose dentro de vacuolas citoplasmáticas rodeadas por una membrana (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991), en forma esparcida o agrupaciones que le dan un aspecto de mórula (Cvitanich et al., 1991). Mediante microscopía electrónica se ha observado que el agente posee en su superficie dos membranas, una externa ondulada y una interna citoplasmática, lo que es característico de agentes rickettsiales (Fryer et al., 1990). Posee además estructuras similares a ribosomas cerca de la membrana plasmática, un ADN fibrilar en la región central y 60

3 estructuras esféricas electro densas (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). Para la detección de P. salmonis se utilizan diferentes tinciones, como naranja de acridina, Giemsa, Gram y azul de toluidina (Fryer et al., 1990, Cvitanich et al., 1991, Larenas et al., 1995), sin embargo, son poco sensibles y específicas. La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) desarrollada por Lannan et al. (1991) ha resultado ser una técnica sensible y específica. Larenas et al. (1996a) han modificado la prueba utilizando microondas, lo que reduce los tiempos de incubación para los anticuerpos, sin perder sensibilidad o especificidad. También se ha descrito la detección mediante PCR (Mauel et al., 1996; Marshall et al., 1998; Reid et al., 2004). Se han descrito diversas cepas de P. salmonis, sin embargo la cepa de referencia corresponde a la LF-89, la cual corresponde al primer aislado realizado en 1989 por Fryer et al. (1990). Pequeñas diferencias en la secuencia del 16 ARNr permiten diferenciar cepas, (Mauel et al., 1996; Reid et al., 2004). Los trabajos realizados por Smith et al. (1996) y House et al. (1999) han establecido diferencias entre la virulencia de diferentes aislado tanto nacionales como extranjeros. Larenas et al. (2003) han demostrado experimentalmente que el agente puede penetrar a las ovas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) durante el periodo de fertilización, uniéndose inicialmente a ellas mediante estructuras que han sido denominadas Complejo de Adhesión Piscirickettsial o CAP. Además, en el mismo experimento se demostró que se podían obtener alevines viables, que no presentaban signos clínicos de la infección. Sin embargo, hasta la fecha, no hay antecedentes de transmisión vertical en salmones de cultivo, razón por la cual en el presente trabajo, se utilizaron alevines de salmones coho (O. kisutch), cuyos progenitores eran positivos a la infección y pertenecían a una empresa de cultivo de la Décima Región de la zona sur de Chile, con el propósito de establecer si presentaban la bacteria en sus heces y riñones. Materiales y Métodos Peces. Se utilizaron 250 alevines de salmón coho, con un peso aproximado de 5 g, clínicamente sanos, provenientes de la cruza de reproductores machos y hembras, los que se obtuvieron a partir de una población de reproductores con una prevalencia mediante frotis renal (IFAT) del 21,5% (35,8% para las hembras y 7,4% para los machos) frente a P. salmonis (Solís, 2002). Los peces provenían de una Piscicultura de Castro, Décima Región de Chile. Los peces fueron sometidos a un período de cuarentena y adaptación de 3 semanas previos a las tomas de muestras. Con este propósito, se eligieron al azar 100 alevines, que fueron eutanasiados con una sobredosis de etil-4-aminobenzoato 61

4 (Benzocaína, Veterquímica, Santiago, Chile) y analizados mediante un estudio de necropsia y frotis renales. Todas las muestras fueron fijadas en metanol absoluto por 3 min y se les realizó la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para la detección de P. salmonis de acuerdo a lo descrito por Lannan et al. (1991) y modificado por Larenas et al. (1996a). El anticuerpo primario, policlonal obtenido en conejo, fue donado gentilmente por el Prof. Dr. John L. Fryer, Universidad Estatal de Oregon, Estados Unidos. Además, cada frotis fue evaluado mediante IFAT con anticuerpos anti-renibacterium salmoninarum de acuerdo a la metodología propuesta por Bullock et al. (1980). El anticuerpo primario, policlonal obtenido en conejo, fue desarrollado en el Laboratorio de Patología de Peces, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Chile. Adicionalmente, a los alevines se les tomaron muestras de heces, que fueron fijadas en metanol absoluto por 3 min y procesadas por IFAT para la detección de P. salmonis. Resultados Los peces no presentaron signos clínicos durante la fase de cuarentena de tres semanas. Los 100 alevines eutanasiados y analizados, no evidenciaron alteraciones anátomo-patológicas a la necropsia y los frotis de riñón presentaron escasa a regular cantidad de R. salmoninarum a la prueba de IFAT. Por otra parte, frente a P. salmonis, los frotis renales (R) fueron positivos en un 12% y los de heces (H) en un 11% (Tabla 1). De acuerdo con estos resultados sólo un alevín fue positivo para ambas muestras (R+H+) (Tabla 2). Discusión Los alevines provenientes de la cruza de reproductores machos y hembras positivas a P. salmonis, resultaron ser positivos por IFAT en 12 de 100 muestras renales (12%) (Tabla 1). Estos resultados concuerdan con los descritos por Larenas et al. (1996b), quienes detectaron alrededor de un 10% de infectividad en ovas fértiles, provenientes de reproductores de trucha arco iris machos y/o hembras inoculados intraperitonelamente (IP) con el agente. A pesar de que no sé determinó posteriormente si estas ovas infectadas daban origen a alevines viables y si la infección persistía en ellos, las ovas muestreadas estaban en estado de ojo, etapa en que se determina en gran medida la viabilidad futura (Estay et al., 1994), por lo que se podría suponer una persistencia de la infección en una etapa posterior (Larenas et al., 1996b). Recientemente Larenas et al. (2003), demostraron que todos los grupos de ovas fertilizadas provenientes de machos y/o hembras reproductoras inoculadas IP con P. salmonis fueron capaces de generar alevines de saco, viables, así como también alevines de 1 g de peso; detectándose en ambos grupos de alevines la persistencia de la infección. El hecho de que, en algunos casos, la bacteria haya sido encontrada sólo en la muestra de heces y no en el frotis de riñón, podría deberse a que P. salmonis 62

5 pudiese estar realizando algún tipo de ciclo hepático o que la bacteria presenta una mayor afinidad por el intestino de los peces huéspedes. Al respecto, Cvitanich et al. (1991), reportaron la existencia de una abundante cantidad de bacterias en las células hepáticas y del intestino de salmón coho, sugiriendo que la bacteria podría estar siendo eliminada a través de las heces y sobrevivir por largo tiempo para infectar otros peces. Por otra parte, Salinas et al. (1997) han demostrado la excreción de P. salmonis en heces, orina y bilis de truchas arco iris experimentalmente infectadas, tanto en peces aparentemente sanos como en moribundos. Esta eliminación fue mayor en peces con signos clínicos y un mayor porcentaje de peces clínicamente sanos fue positivo en la medida que avanzaban los días postinoculación. La presencia de P. salmonis en las heces, en el presente trabajo, confirma los datos obtenidos por Salinas et al. (1997) e indican que esta vía puede ser factible en la diseminación del agente en condiciones naturales. Al respecto, Cvitanich et al. (1991), Almendras et al. (1997) y Salinas et al. (1997) han comprobado experimentalmente la transmisión horizontal de la enfermedad, sin la presencia de vectores. Si bien es cierto de que P. salmonis, in vitro, tiene una baja viabilidad en agua dulce (Lannan y Fryer, 1994), Almendras et al. (1997) lograron reproducir la enfermedad en peces cohabitantes sin contacto físico, sugiriendo para dichos autores de que P. salmonis de alguna manera pudiese estar siendo protegida, del ambiente hipotónico del agua dulce, por material mucoide proveniente de branquias, piel o intestino al momento de ser eliminada al medio ambiente acuático y de esta forma ser capaz de transmitirse horizontalmente. Por otro lado, Lannan y Fryer (1994) han demostrado una supervivencia in vitro relativamente prolongada del agente en agua salada, lo cual sugiere que la bacteria presente en el contenido fecal, en condiciones marinas, podría a través de esta forma producir la infección horizontal. De acuerdo a lo descrito anteriormente y basándonos en los resultados obtenidos, estos indicarían que los alevines de salmón coho, provenientes de la cruza de reproductores machos y hembras positivos se infectan vía vertical y eliminan la bacteria vía fecal, actuando como portadores asintomáticos de P. salmonis y por ende favoreciendo la diseminación del agente patógeno en condiciones naturales de cultivo, aun cuando sus muestras de riñón resulten negativas a la presencia de P. salmonis. Referencias Almendras FF, Fuentealba LC, Jones SRM, Markham F, Spangler E. Experimental infection and horizontal transmission of Piscirickettsia salmonis in freshwater-raised Atlantic salmon, Salmo salar. J Fish Dis 1997; 20: Branson EJ, Nieto Díaz-Muñoz D. Description of a new disease condition 63

6 occurring in farmed coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), in South America. J Fish Dis 1991; 14: Bravo S, Campos M. Síndrome del Salmón Coho. Chile Pesquero 1989; 54: Bravo, S. Piscirickettsiosis in freshwater. Bull Eur Assoc Fish Pathol 1994; 14: Bullock GL, Griffin BR, Stuckey HM. Detection of Corynebacterium salmoninus by direct fluorescent antibody test. Can J Fish Aquat Sci 1980; 37: Cvitanich JD, Garate ON, Smith CE. The isolation of rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch s postulate. J Fish Dis 1991; 14: Fryer JL, Lannan CN, Garcés HL, Larenas JJ, Smith PA. Isolation of a rickettsiales-like organism from diseased coho salmon (Oncorhynchus kisutch) in Chile. Fish Pathol 1990; 25: Gaggero A, Castro H, Sandino AM. First isolation of Piscirickettsia salmonis from coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), during the freshwater stage of their life cycle. J Fish Dis 1995; 18: House ML, Bartholomew JL, Winton JR, Fryer JL. Relative virulence of three isolates of Piscirickettsia salmonis for coho salmon Oncorhynchus kisutch. Dis Aquat Org 1999; 35: Lannan CN, Ewing SA, Fryer JL. A fluorescent antibody test for detection of the rickettsia causing disease in chilean salmonids. J Aquat Anim Health 1991; 3: Lannan CN, Fryer JL. Extracellular survival of Piscirickettsia salmonis. J Fish Dis 1994; 17: Larenas J, Hidalgo L, Garcés H, Fryer JL, Smith P. Piscirickettsiosis: Lesiones en salmón del Atlántico (Salmo salar) infectados naturalmente con Piscirickettsia salmonis. Av Cienc Vet 1995; 10: Larenas J, Astorga C, Contreras J, Garcés H, Fryer JL, Smith P. Rapid detection of Piscirickettsia salmonis using microwave irradiation. Fish Pathol 1996a; 31: Larenas J, Astorga C, Contreras J, Smith P. Detección de Piscirickettsia salmonis en ovas fertilizadas provenientes de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) experimentalmente infectadas. Arch Med Vet 1996b; 28: Larenas, JJ; Bartholomew J, Troncoso O, Ledezma H, Fernández S, Vera P, Contreras J, Smith P. Experimental vertical transmission of Piscirickettsia 64

7 salmonis and an in vitro study of the attachment and mode of entrance of the bacterium into the fish ovum. Dis Aquat Org 2003; 56: Marshall S, Heath S, Henríquez V, Orrego C. Minimally Invasive Detection of Piscirickettsia salmonis in cultivated salmonids via the PCR. Appl Environ Microbiol 1998; 64: Mauel MJ, Giovannoni SJ, Fryer JL. Development of polymerase chain reaction assays for detection, identification, and differentiation of Piscirickettsia salmonis. Dis Aquat Org 1996; 26: Reid HI, Griffen AA, Birkbeck TH. Isolates of Piscirickettsia salmonis from Scotland and Ireland Show Evidence of Clonal Diversity. Appl Environ Microbiol 2004; 70: Salinas G, Contreras J, Smith P, Larenas J. Horizontal transmission and excretion of Piscirickettsia salmonis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in fresh water condition. In: VIII th International Conference. Diseases of Fish and Shellfish. Abstracts Book. Heriot-Watt University, Edinburgh, European Association of Fish Pathologists. 1997; pp. P-57. Smith PA, Lannan CN, Garcés LH, Jarpa M, Larenas J, Caswell-Reno P, Whipple M, Fryer JL. Piscirickettsiosis: A bacterin field trial in coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Bull Eur Ass Fish Pathol 1995; 15: Smith P, Contreras J, Garcés H, Larenas J, Oyanedel S, Caswell-Reno P, Fryer J. Experimental challenge of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) and rainbow trout (Onchorynchus mykiss) with Piscirickettsia salmonis. J Aquat Anim Health 1996; 8: Solís AP. Comparación del nivel de presencia de Piscirickettsia salmonis en muestras de frotis renal, fluido celómico y seminal de reproductores de salmónidos de la Décima Región de Chile. Memoria Título Médico Veterinario. Santiago, Chile. Universidad de Chile, Fac. Cs. Veterinarias y Pecuarias. 2002; 67p. 65

8 Tabla 1. Detección mediante inmunofluorescencia de Piscirickettsia salmonis en frotis de riñón y de heces de alevines de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) provenientes de progenitores positivos a la bacteria. Nº Alevín Resultado Nº Alevín Resultado Nº Alevín Resultado Riñón Heces Riñón Heces Riñón Heces 1 (--) (--) 36 (--) (--) 71 (+) (--) 2 (--) (--) 37 (--) (--) 72 (--) (--) 3 (--) (--) 38 (--) (--) 73 (--) (--) 4 (+) (--) 39 (+) (+) 74 (--) (--) 5 (+) (--) 40 (--) (--) 75 (--) (--) 6 (+) (--) 41 (--) (--) 76 (--) (+) 7 (--) (--) 42 (--) (--) 77 (--) (--) 8 (--) (--) 43 (--) (--) 78 (--) (--) 9 (--) (--) 44 (--) (--) 79 (--) (--) 10 (+) (--) 45 (--) (--) 80 (--) (--) 11 (--) (--) 46 (--) (--) 81 (--) (--) 12 (--) (--) 47 (--) (--) 82 (--) (--) 13 (--) (+) 48 (+) (--) 83 (--) (--) 14 (--) (--) 49 (--) (--) 84 (--) (--) 15 (--) (--) 50 (--) (--) 85 (--) (+) 16 (--) (--) 51 (--) (--) 86 (--) (+) 17 (+) (--) 52 (--) (--) 87 (--) (--) 18 (--) (--) 53 (--) (--) 88 (--) (--) 19 (--) (--) 54 (--) (--) 89 (--) (--) 20 (+) (--) 55 (--) (--) 90 (--) (--) 21 (--) (+) 56 (--) (--) 91 (--) (--) 22 (--) (--) 57 (--) (--) 92 (+) (--) 23 (--) (--) 58 (--) (--) 93 (--) (--) 24 (--) (--) 59 (--) (--) 94 (--) (+) 25 (--) (--) 60 (--) (+) 95 (--) (--) 26 (--) (--) 61 (--) (--) 96 (--) (--) 27 (+) (--) 62 (--) (+) 97 (--) (--) 28 (--) (+) 63 (--) (--) 98 (--) (--) 29 (--) (--) 64 (--) (--) 99 (--) (--) 30 (--) (--) 65 (--) (--) 100 (--) (--) 31 (+) (--) 66 (--) (+) 32 (--) (--) 67 (--) (--) 33 (--) (--) 68 (--) (--) 34 (--) (--) 69 (--) (--) 35 (--) (--) 70 (--) (--) Interpretación de IFAT= +: Positivo a la presencia de P. salmonis; --: Negativo. Todas las muestras fueron analizadas en duplicado, examinando un total de 50 campos por preparación con un aumento de 1000x. 66

9 Tabla 2. Número de alevines de salmón coho según detección por IFAT de Piscirickettsia salmonis en frotis renales y de heces. Riñón (+) Riñón (--) Total Heces (+) Heces (--) Total : Presencia de P. salmonis - : Negativo Recibido 23/mayo/2005 Aceptado 30/julio/2005 Editor Responsable Gustavo Farías. 67