INFORME PROYECTO DE MEJORAMIENTO DE GANADO DE ALTURA

Transcripción

1 UNIVERSIDAD TECNICA DE ORURO MINISTERIO DE DESARROLLO RURAL Y TIERRAS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y VETERINARIAS CENTRO EXPERIMENTAL AGROPECUARIO CONDORIRI INFORME PROYECTO DE MEJORAMIENTO DE GANADO DE ALTURA (AGOSTO 2011 JULIO/2013) 1

2 1. JUSTIFICACIÓN El 6 de Junio del 2011 se firma el Convenio de Cooperación entre el Ministerio de Desarrollo Rural y Tierras y la Universidad Técnica de Oruro, para la Implementación y Ejecución del Programa Nacional de Fomento y Desarrollo Pecuario de Carne y Leche (Componente Mejoramiento Genético de Ganado Bovino), para la producción de 9600 pajuelas/año, en el Laboratorio del CEAC, de Semen de Toros de dos Razas Priorizadas para la Región del Altiplano (Holstein y Pardo suizo), por el lapso de 2 años, con recursos económicos compartidos, y con un costo subvencionado de la pajuela. Y bajo este convenio suscrito entre estas dos instituciones con sus diferentes artículos, incisos y compromisos por ambas partes se desarrollaron actividades de gran importancia en cuanto se refiere al manejo adecuado de equipos y del material genético el cual servirá para la inseminación artificial con semen de animales adaptados al medio. Y por otra parte el laboratorio trabaja con mejoramiento genético en ganado ovino y camélido, realizando actividades de recolección, evaluación y crio conservación de semen y poder realizar inseminación artificial con semen fresco y congelado. 2. OBJETIVOS Para el cumplimiento se planteo los siguientes objetivos: Calibración de equipos de manejo y crio conservación de semen (para tener un protocolo adecuado sobre estos equipos) Evaluación de protocolos de recolección de semen Evaluación de protocolos de dilución de semen Evaluación de protocolos de congelación y crio conservación de semen Entrega de pajuelas y sincronizadores de celo a los Municipios dentro el Convenio Asistencia técnica y capacitación 2

3 3. CALIBRACIÓN DE EQUIPOS DE MANEJO Y CRIO CONSERVACIÓN DE SEMEN 3.1. Introducción. El manejo y uso adecuado de equipos es de mucha importancia para el proceso de manejo y conservación de semen. Es importante la calibración de estos equipos para darles un buen uso y funcionalidad y para esto se tuvo que realizar la graduación y evaluación de cada uno de estos y de esta manera tener un protocolo adecuado para el uso y funcionamiento Sellador de pajuelas El equipo de sellado de pajuelas mecánico manual tubo un proceso de calibración donde se realizo el ingreso de pajuelas en cada giro e ingreso de tinta, es necesario este ajuste para evitar el doble sellado de las pajuelas o mal ingreso y la entrada de tinta necesario para evitar manchar la pajuela en el sellado. Foto 1 y 2. Equipo de Sellado de pajuelas Además de que se regulo la altura de los sellos ya que se están utilizando varios toros donadores y es necesario tener esta característica bien definida para que el sello de goma pueda pasar por el área de la tinta y pueda realizar la impresión sin provocar manchas. 3

4 Resultados Con el regulado del equipo de sellado de pajuelas se tiene sellos con registros de 5 animales donadores de semen, además de pajuelas selladas con estos datos. Foto 3. Pajuelas selladas Este material nos facilita el proceso de llenado e identificación en la etapa de congelación y crio conservacion de semen Llenador y sellador de pajuelas El equipo de llenado y sellado de pajuelas es un instrumento de mucha ayuda ya que podemos colocar 36 pajuelas en el porta pajuelas con un llenado de 6 pajuelas en cada sección de vaciado, y el sellado se lo realiza con la ayuda de perdigones en secuencia de 6 pajuelas por prensado. La calibración es muy importante ya que necesitamos que cargue el semen diluido completo a la pajuela que es de 0.5 ml de capacidad y evitar el ingreso de aire o succione el semen a través del sello de mechas hasta el frasco vacio. Foto 4. Llenador y sellador de pajuelas Resultados El ajuste del equipo a 200 mbar nos dio como resultado el poder llenar las pajuelas con la cantidad respectiva de semen diluido, el llenado y la cantidad de semen dentro de la pajuela es de 4

5 mucha importancia ya que necesitamos tener un espacio de aire para que en el momento de la congelación no ocurra que salte el perdigón o la mecha de algodón por el cambio brusco de temperatura y la tensión que ocurre en el material de la pajuela Fotómetro El equipo electrónico de conteo de espermatozoides y calculo de diluyentes fotómetro, es un instrumento de rápida evaluación del material ya que podemos tener el resultado de una muestra en segundos además de la impresión de este resultado y esto nos ayuda a poder trabajar con mas efectividad a diferencia de la cámara de New bauwer en el cual se requería un tiempo de 15 minutos para el trabajo de esta evaluación Resultados El fotómetro se lo calibro para que este pueda calcular el contenido de espermatozoides por pajuela el cual es de 40 millones de células espermáticas por pajuela y con esta dosis poder asegurar la preñes del animal inseminado. Foto 5. Fotómetro imprimiendo resultados 5

6 Esterilizador El laboratorio cuenta con dos tipos de esterilizadores de materiales: El primero, autoclave instrumento para esterilizar diferentes tipos de materiales en vapor el cual funciona colocando agua en el interior y los materiales en el canastillo este se lo sierra herméticamente y el vapor va subiendo la presión Es segundo es un esterilizador en seco para esterilizar todo tipo de materiales este instrumento tiene la facilidad de programar el tiempo y la temperatura de acuerdo al material que se va esterilizar. Foto 6 y 7. Autoclave, esterilizador en seco Resultados Para el uso de la autoclave en la esterilización de equipos de recolección (fundas, conos tubos) la presión tiene que llegar a 7.5 psi y la temperatura máxima a 240 F porque pasado estas medidas el material comienza a derretirse y malograrse. Para el esterilizador en seco, este ya cuenta con su respectivo manual de requerimientos de temperatura y tiempo por la cual se tiene que tomar en cuenta todos los pasos y precauciones para el manipuleo de este. 6

7 Agitador con calentador Para poder tener una dilución uniforme del semen con el dilutor el agitador es un instrumento de mucha ayuda ya que esta cuenta con una platina atemperada el cual evita el shock térmico de la muestra además es graduable de acuerdo al requerimiento y un agitador con las mismas características. Foto 8. Agitador con platina atemperada Resultados Para una dilución adecuada sin provocar algún tipo daño a las células este equipo se lo graduó de la siguiente manera: Temperatura de la platina 37 C y el agitador a 100 rpm, con estos mandos podemos tener un semen diluido en forma uniforme Microscopio con planita calentadora Las características de este equipo son las siguientes: Es un microscopio compuesto con una capacidad de visión de 100x además este cuenta con una platina porta pajuelas atemperada con controlador Tiene una cámara incorporada el cual está conectado a un monitor y esto nos facilita la evaluación del semen 7

8 También la cámara tiene un puerto para conectar a un PC Se cuenta también con una platina atemperada de porta y cubre objetos con regulador de temperatura Foto 9 y 10. Microscopio completo, platina atemperadora Resultados Las platinas fueron regulados a 37 C temperatura ideal para calentar los materiales Para una observación con mayor detalle se utilizo el contraste de luz verde el cual nos da una mejor imagen de lo observado. El tornillo de desplazamiento vertical fue calibrado a una determinada altura ya que de esta manera se tiene una mejor observación Cámara de congelación de semen El equipo de congelación cuenta con un software el cual tiene una curva de enfriamiento que va descendiendo de 0 a 110 C con nitrógeno en movimiento el cual es absorbido desde un tanque conectado a la cámara. 8

9 El congelamiento del material ocurre en un tiempo de 10 minutos una vez procesado estos son colocados en canastillos y llevados a los tanques de nitrógeno líquido (TNL) para su crio conservación. Foto 11 y 12. Tanque de congelación, colocado de pajuelas en gradilla Resultados Se tiene una capacidad de 100 pajuelas por bandeja y 400 pajuelas por nivel, teniendo una capacidad total de 1200 pajuelas congeladas por sesión en 3 niveles Para cada proceso de congelación el equipo gasta 20 Kg de NL Las pajuelas congeladas tiene que ser transportadas rápidamente al TNL para su almacenamiento y evitar shock térmicos y perdida del material genético El equipo cuenta con un solo protocolo de congelación por lo que se tuvo que adecuar el material y los diluyentes para poder tener un buen porcentaje de motilidad pos descongelación. 9

10 4. RECOLECCION, EVALUACION, DILUCION, CONGELACION Y CRIOCONGELACION DE SEMEN DE BOVINOS 4.1. RECOLECCION; Métodos de recolección de semen Para cumplir esta actividad se utilizo 2 métodos de recolección de semen, los cuales fueron empleados en la recolección de semen de ganado bovino, ovino y camélido Resultados Vagina artificial, para bovinos Este equipo tiene las siguientes características: 10

11 La Vagina Artificial para bovinos esta construido de un tubo plástico flexible de 8.18 cm de diámetro exterior y 5,5 cm diámetro inferior y de 29.8 cm de largo con una válvula para el ingreso de agua atemperada y aire, en la parte interna lleva un funda de latex, en uno de los extremos tiene un cono recolector incorporado con un tubo recolector graduado. Toda la parte del cono y tubo recolector se cubre con una frazadilla térmica para mantener la temperatura. La cantidad de agua que se requiere para la vagina es de 420 ml de agua atemperada a 40 C. La presión de VA tiene que ser igual a la de la vulva de una hembra. Esta es cubierta por una frazadilla atemperada durante 5 minutos en el calentador de ambiente para mantener la temperatura del cono y del tubo recolector. En el extremo contrario al cono y tubo se lubrica con gel neutro para la recolección de semen. Foto 13. Vagina artificial (VA) 11

12 Foto 14. Vagina artificial con frazadilla Electro eyaculador, para bovinos Este equipo de recolección de semen tiene las siguientes características: Foto 15. Electro eyaculador El equipo de electroeyaculación está diseñado para estimular la inervación pélvica simpática y parasimpática con impulsos de bajo voltaje y amperaje, para inducir una erección peniana y la eyaculación. El electroeyaculador está constituido por los siguientes componentes: la caja de transporte, la sonda rectal, la unidad de control, el cargador de baterías, el cable de conexión a red, el cable de conexión a la sonda, el mango, el cono y el envase de colección Técnica: a. Se lleva el toro al brete y se posiciona la vara detrás de él, se instala el electroeyaculador a su lado y deja listo para su uso. b. Utilizando un guante de palpación, se vacía las heces del recto y se realiza por 1 a 2 minutos un masaje longitudinal sobre las ámpulas y músculos uretrales. c. Se introduce la sonda lubricada al recto, con los electrodos dirigidos ventralmente, asegurándose de que el electroeyaculador no esté conectado antes de efectuar este pasó. Si es conectado antes de insertar la sonda rectal, el toro puede recibir una fuerte descarga eléctrica, que aumentará el nivel de estrés del animal. 12

13 d. La estimulación eléctrica es iniciada lentamente, hasta que el toro muestre una mínima respuesta. Luego se da estímulos consecutivos, aumentando cada uno gradualmente en intensidad. Los estímulos deberán durar 1 2 segundos, discontinuándolos por 0,5 1 segundo, antes de iniciar el siguiente. e. Tras algunos estímulos comienza a fluir secreción preseminal transparente desde el pene protruido. Esta fracción preseminal no debiera colectarse. f. Tan pronto comienza a fluir del pene la fracción turbia, rica en espermios debe posicionarse el cono de colección con el vaso de colección sobre el pene, para colectar la muestra. g. Tras colectar una muestra suficiente, se suspende la estimulación y se retira la sonda rectal. La muestra de semen es, entonces, llevada al laboratorio para su evaluación y procesamiento. Foto 16 y 17. Introducción de la sonda en el recto, recolección de semen 13

14 4.2. EVALUACION; Macroscópico y microscópica Para el cumplimiento de esta actividad se fue realizando diferentes pruebas para poder tener un protocolo adecuado para evaluación del semen. Para la evaluación del semen primeramente se debe atemperar el ambiente a 20 C donde se va a trabajar, preparar el baño maría a 37 C, atemperar las platinas porta y cubre objetos, tener todo los materiales esterilizados Resultados; Evaluación Macroscópico Volumen La evaluación del semen recolectado se lo realiza por simple inspección verificando la cantidad de material eyaculado en el tubo recolector graduado el cual está en ml además de que el tubo recolector debemos cubrirlo con un papel aluminio para evitar la contaminación de la muestra. Foto 18 y 19. Semen de bovinos evaluando el volumen 14

15 Grafico 1. Volumen de semen por razas de bovinos VOL ml % volumen eyaculado frank 5,19 walker 6,4 2,26 2,4 gaston pachuco psuiso psuiso holstein holstein 0 psuiso psuiso holstein holstein Razas El volumen recolectado de semen el de la raza Pardo suizo en relación a la holstein esta fue superior con un promedio de 5.79 ml de la otra raza de 2.33 ml. Estos datos nos da un parámetro para poder estimar de acuerdo al volumen que cantidad de pajuelas podemos obtener. Densidad La densidad o concentración se clasifico de la siguiente manera: Muy buena (MB): semen cremoso, veteado con 750 a 1 mil millones de espermatozoides/ml o más. Buena (B): semen lechoso con 400 a 750 millones de espermatozoides/ml Suficiente (S): semen semejante a leche descremada con 250 a 400 millones de espermatozoides/ml Pobre (P): semen translúcido con menos de 250 millones de espermatozoides/ml El semen colectado mediante VA suele ser más concentrado y limpio que las muestras de semen colectadas por electroeyaculación o por masaje. Con los últimos dos métodos, el volumen y la concentración pueden ser no representativos para la capacidad normal del toro para producir espermios; sin embargo, con una buena técnica, es a menudo posible lograr 15

16 eyaculados limpios de buena concentración, cuando los toros han estado en reposo sexual y son tratados en forma correcta. Raza Densidad Color Pardo Suizo Holstein Fuente: Elaboración propia Muy buena (MB) a Buena (B) De Muy buena (MB) a Buena (B) y Suficiente (S) De cremoso veteado a blanco lechoso De cremoso veteado a blanco lechoso y semejante a la leche descremada Según los resultados obtenidos podemos indicar que las mejores características de la densidad de semen son de la raza Pardo Suizo. Ph Para la evaluación del Ph se utilizo láminas de papel indicador universal, el cual se introduce un extremo de la tira en el semen durante unos segundos, se sacude el exceso en el borde del tubo recolector de semen y tras unos 30 segundos se comparo con la escala de colores que tiene. Grafico 3. % de Ph en el semen % de Ph 7,2 7,15 7,1 7,05 7 6,95 6,9 6,85 6,8 6,75 7,16 6,9 PS H Razas de bovinos PS H El Ph encontrado en las muestras de semen esta dentro el rango de neutro con un poco variación Resultados; Evaluación Microscópico 16

17 Motilidad a) Movimiento de masa Se coloca una gota de semen de 5 mm de diámetro sobre un portaobjetos precalentado, observando el movimiento de masa bajo microscopía de campo claro a 40x de aumento, con el diafragma de campo cerrado. Los factores que influyen sobre el movimiento de masa de los espermios incluyen la concentración, el porcentaje de células con movimiento progresivo y la rapidez y vigor del movimiento de los espermios. Si uno o más de estos factores se encuentran comprometidos, el movimiento de cardumen del movimiento de masa se reducirá. Calificación descriptiva del movimiento de masa: Muy Bueno (MB): remolinos oscuros y rápidos Bueno (B): remolinos más lentos Regular (R): sin remolinos, pero movimiento individual de células visible Pobre (P): poco o nada de movimiento celular individual Grafico 3. % de motilidad masal 88 MOTILIDAD MASAL EN % ,27 FranK 86 85,5 walker gaston pachuco psuiso psuiso holstein holstein Razas de bovinos psuiso psuiso holstein holstein En cuanto a la evaluación de motilidad masal el semen de los de los animales de la raza holstein presenta mejores características en esta evaluación con características de muy bueno a bueno. 17

18 b) Motilidad individual progresiva Para la evaluación de esta característica se procedió con la siguiente metodología. Se coloca una gota de 5 µl sobre un porta objetos y se tapa con un cubre objetos. La muestra es observada bajo microscopía de contraste (color verde) de fases con aumento de 40x, determinando el porcentaje de células espermáticas con movimiento progresivo lineal. Si el semen está muy concentrado, la muestra de semen puede diluirse con una solución tampón o diluyente de semen. Evaluación descriptiva de la motilidad individual: Muy Buena (MB): % motiles Buena (B): 60 79% motiles Regular (R): 40 59% motiles Pobre (P): < 40% motiles Evaluación de la morfología espermática Las células espermáticas son translúcidas al ser observadas con microscopía de campo claro; por ello, para el análisis de la morfología de espermios, es necesario el uso de microscopía de contraste de fases o el uso de tinciones. La tinción de EosinaNigrosina es comúnmente utilizada como una tinción de "vivos/muertos", debido a que, por el componente de Nigrosina, proporciona, además, un fondo de contraste para las células espermáticas. La penetración de Eosina a los espermios, o la falta de penetración, es un indicador de la integridad de sus membranas y, en consecuencia, de su viabilidad. Técnica: 1. Se pone el portaobjetos sobre la platina temperada (+37 C) por segundos. 2. Se pone una gota de colorantes Eosina/Nigrosina de 56 mm de diámetro sobre un extremo del portaobjetos. 3. Se deposita una gota de semen junto a la gota de colorante. El tamaño de la gota dependerá de la densidad del semen. Ejemplo: 18

19 3 mm para densidad MB. 4 mm para densidad B. 5 mm para densidades R o P. Se mezcla los colorantes con el semen sobre el portaobjetos. Se extienda inmediatamente la mezcla sobre el portaobjetos (frotis), desde uno al otro extremo, utilizando un palillo aplicador de madera o el canto de otro portaobjetos. Secamos rápidamente el frotis al aire y se cubre. La evaluación de la morfología espermática se evaluó con un aumento de 40x, contando al menos 100 espermios por muestra. Si se observara un número mayor de anomalías, el conteo de 300 o más espermios darán un resultado más exacto. El colorante Eosina/Nigrosina es muy hipotónico, por lo cual puede causar artefactos en la morfología espermática. Se puede minimizar esta formación de artefactos, utilizando los portaobjetos precalentados y soplando sobre el frotis extendido para lograr un rápido secado. En semen de buena calidad, el porcentaje de espermios con motilidad individual progresiva está altamente correlacionado con el porcentaje de espermios no teñidos con Eosína (vivos). Foto 19 y 20. Realizando frotis y evaluación de morfológica Concentración del semen Para determinar la concentración espermática se utilizo el siguiente método: 19

20 Recuento electrónico Para esta evaluación se utilizo el Fotómetro SDM6. Este equipo cuenta con un protocolo de uso, el cual consiste en: Se diluye una muestra de semen nativo en una cubeta con un volumen determinado de diluyente y cloruro de sodio al 0.9 normal y se analiza con el fotómetro. Este análisis requiere de aprox. 15 segundos. Se ingresan el volumen, la motilidad progresiva, el número de espermios por dosis. El fotómetro calculará el número de pajuelas a congelar y el volumen final del diluyente a utilizar para la congelación. Foto 28. Equipo fotómetro realizando el conteo de espermios Grafico 4. Evaluación de concentración espermática Millones de espermios/cc Concentracion de espermios ,9 400 ps 647,5 h ps h Razas de bovinos Según los datos encontrados en la evaluación de concentración espermática los ejemplares de la raza pardo suizo tiene mayor concentración espermática con 1082,9 x 10⁹ y los de la raza holstein x 10⁹ millones de espermatozoides/cc. 20

21 Cálculo del número de dosis y dilución El número promedio de espermios distribuidos por dosis en las últimas 5 décadas en los centros de manejo de semen a nivel mundial es de 10 millones de espermios motiles posdescongelación. Dado que aproximadamente el 50% de espermios muere en el proceso de congelación, es necesario duplicar el número de espermios por dosis; por Ej., si el objetivo es obtener 10 millones de espermios con movimiento progresivo posdescongelación, el número total de espermios por dosis debería ser de 20 millones. Pero para garantizar la preñez en animales del altiplano se coloco 40 millones de espermatozoides por dosis. DILUCIÓN DEL EYACULADO Para el manejo del semen primero se pre diluye el eyaculado en proporción de al menos 1:1 dentro de 10 minutos después de colectado. La temperatura del diluyente y del semen deben ser iguales al momento de la primera dilución (/+1 ºC), la segunda y diluciones siguientes pueden efectuarse a temperatura ambiente. El diluyente que se está utilizando es el ANDROMED. Agitando o homogenizando cuidadosamente después de cada paso. Determinamos el % de espermios motiles progresivos bajo el microscopio antes de proseguir con el procesamiento (mínimo de 70 % espermios motiles progresivos). a) Preparación del diluyente ANDROMED: El contenido de (200 ml) de un frasco de ANDROMED se diluye con 800 ml de agua bidestilada estéril previamente atemperada a ±35 C. Es posible preparar volúmenes menores, siempre que se mantenga la proporción de 4 partes de agua con 1 parte de concentrado. Es de mucha importante para lograr las propiedades óptimas de conservación de ANDROMED, la cantidad requerida de agua debe agregarse al concentrado y no 21

22 viceversa. El diluyente preparado ANDROMED debe atemperarse antes de su uso en baño maría entre 30 C ± 32 C. b) Pre dilución y análisis de semen: Inmediatamente tras su llegada al laboratorio, el eyaculado se evaluó (Concentración, motilidad) y pre diluido de 1+1. El eyaculado se mantendrá en baño maría entre 37 C ± 39 C. Al momento de la dilución del diluyente debe tener una temperatura similar al eyaculado (±1 C). El semen no permanecerá en el baño maría por más de 10 minutos. Una vez evaluado debe efectuarse la dilución final. El eyaculado ha alcanzado hasta entonces la temperatura del laboratorio de (20 C ± 23 C), y a esa temperatura es envasado en pajuelas. En forma alternativa, ANDROMED puede utilizarse para el envasado de las pajuelas a +5 C. Para ello, el semen diluido debe ser equilibrado por al menos de 2 a 3 horas a + 5 C. c) Adaptación y envasado de pajuelas (empaque) Se cuenta con 2 alternativas de manejo del semen para su envasado: Alternativa I: Empaque a temperatura ambiente seguido de adaptación a + 5 ºC Las pajuelas se envasan y sellan con una envasadora al vacio y selladora mecánica, bajo control visual. La firmeza del sellado es controlado por muestreo al azar. Las pajuelas envasadas y selladas son puestas en los gradillas porta pajuelas que es de 36 unidades cada uno. Las pajuelas cargadas son depositadas en un ambiente (refrigerador) que permita el descenso de temperatura a más 5 ºC en el transcurso de minutos. El tiempo de adaptación es de al menos >1.5 horas habitualmente 2 a 5 horas. Alternativa II: Empaque a más 5 ºC y dilución monofásica Terminada la dilución del eyaculado a temperatura ambiente, el semen es enfriado a + 5 ºC en el transcurso de 30 a 45 minutos. El tiempo de adaptación se extiende por 2 a 5 horas 22

23 Las pajuelas se envasan y sellan con una envasadora al vacio y selladora mecánica en un ambiente a + 5 ºC. Foto 29 y 30. Pajuelas en gradillas, Llenadas y selladas de pajuelas d) Congelación y crio conservación de pajuelas de semen Las pajuelas envasadas son colocadas horizontalmente en canastillos metálicos con una capacidad de 100 unidades dentro el equipo de congelación (congelador de semen). Al utilizar pajuelas de 0.5 ml, la duración del proceso de congelado es de 10 minutos, (según su protocolo y curva de enfriamiento del equipo) y una temperatura de iniciación de 9 ºC a 110 ºC. Terminando el ciclo de congelación, las pajuelas son inmediatamente transferidas al tanque de Nitrógeno líquido (N2L) y almacenadas en un contenedor con N2L. Las pajuelas requeridas para el control de cada partida son almacenadas separadamente. Finalizada la congelación es necesario correr el programa del equipo congelador con su tapa abierta y la llave de alimentación de N2L cerrada, hasta la descongelación del hielo y escarcha. Luego se seca completamente el interior con un paño no toalla de papel. 23

24 Foto 31, 32 y 33. Congelado, crio conservado y tanques de crio conservación e) Control de la partida de semen 2 o 3 pajuelas de cada partida procesada se descongelo y evaluó, estimando el porcentaje de células con movimiento progresivo, ya sea forma subjetiva, el mínimo requerido es de >50% de células espermáticas con movimiento progresivo después de la descongelación. f) Exámenes de control de rutina del semen Los siguientes parámetros de las dosis de semen producidas se examinan regularmente: Motilidad Número de células espermáticas totales Integridad de membranas Morfología 24

25 Contaminación bacteriana Resistencia a más 38 ºC g) Descongelamiento y calentamiento El trabajo de descongelamiento se realizo a los 15 y 30 días luego de realizar la crio conservación, el procedimiento es el siguiente: Con la ayuda de una pinza sacamos una pajilla del TNL en el tiempo más corto posible para evitar shock térmico, esta pajilla se coloca en baño maría de 35 ± 37 C. Es importante no bajar la temperatura por debajo de los 25 ºC porque se puede provocar alteraciones en la membrana, en el metabolismo y en la fertilidad. Una vez que la pajilla este en el baño maría se remueve por 30 seg. para su descongelamiento. Una vez descongelada la pajilla se cuenta con 15 min para el trabajo de valoración e inseminación. Foto 34. Sacado de pajilla para descongelación 25

26 Resultados pos descongelación Numero de pajuelas congeladas de ambas razas Hasta la actualidad se cuenta con pajuelas ya congeladas para realizar inseminación artificial en ganado bovino de las razas holstein y Pardo Suizo, bajo el siguiente detalle: Nº Razas Nombre Numero de pajuelas 1. Holstein Darper Holstein Pachuco Holstein Ermindo Pardo suizo Walker 2230 Total 4885 Evaluación de motilidad pos descongelación. Luego del congelado se fue realizando evaluaciones pos descongelación cada cierto tiempo y de esta manera tener estos datos para poder saber si se está realizando de forma correcta todo el proceso de manejo de semen. Grafico 45 Evaluación de concentración espermática Mot. individual progresiva pos descongelacion 60 % motilidad individual ,5 PS H 55 PS H Razas de bovinos Según el grafico podemos observar que la motilidad individual progresiva pos descongelación con mejores características presentas las pajuelas descongeladas de la raza Holstein con 55 % de esta característica y con 42.4 la raza pardo suizo. 26

27 Evaluación de la integridad acrosómica pos descongelación. Para la evaluación de la integridad acrosomica y morfología del espermatozoide pos descongelación de procedió de la siguiente manera: Se saca una pajuela del TNL y se descongela en baño maría a 37 C Una vez descongelado se corta el sello y se deposita una gota de semen en un extremo del cubre objetos y una gota de tinción Se mezcla estos dos y se realiza un frotis con la ayuda de un palillo u otro portaobjetos La muestra se hace secar al aire libre Una vez fijada la muestra se realiza la evaluación de la integridad acrosomica contando 100 espermatozoides vivos al azar y evaluando como se encuentra la pared del acrosoma de la cabeza y como ha afectado la congelación en este aspecto de evaluación. Material utilizado para la calibración equipos Para el trabajo de calibración de todos los equipos ya mencionados en las páginas anteriores se tuvo que realizar varias pruebas para poder obtener protocolos adecuados en el manejo de estos y tener resultados que estén dentro de las exigencias de las normas de manejo de semen a nivel internacional, estos materiales usados fueron los siguientes: 1500 pajuelas de 0.5 ml Esferas de metal para el sellado 100 Kg de Nitrógeno liquido 1 caja de guantes de cirugía 1 caja de guantes de palpación 70 ml tinción Eosina 2 cajas de porta y cubre objetos 4 frascos de diluyente ANDROMED 1 par de fundas de látex para vagina artificial 27

28 1000 ml de agua bidestilada 50 conos de micro pipetas 1 Kg de gel neutro 4 marcos de madera mas vidrio para identificación de áreas de trabajo Ha sido necesario poder hacer uso de estos materiales ya que de esta manera se pudo hacer la prueba de todos los equipos y materiales que se tiene en instalaciones del laboratorio. 5. ENTREGA DE PAJUELAS A LOS MUNICIPIOS EN CONVENIO Nº MUNICIPIO SINCRONIZADORES Nº PAJUELAS HOLSTEIN Nº PAJUELAS PARDO SUIZO 1. Caracollo Oruro Entrega completa para 150 animales 2. Pucarani Prov. Los Andes La Paz Entrega completa para 200 animales 3. Challapata Oruro Entrega completa para 400 animales 4. Guaqui La Paz Entrega completa para 50 Pachuco 100 Walker 400 animales 50 Darper 5. Guaqui La Paz 200 Ermindo 200 Walker 6. Guaqui La Paz Entrega completa para 100 animales 7. Caracollo Oruro Entrega completa para 300 animales 8. Soracachi Oruro Entrega completa para 100 animales 9. Azurduy Sucre 64 Walker 10. Guaqui La Paz 200 Ermindo 11. Caracollo Oruro 84 Ermindo 156 Walker 12. Pucarani Prov. Los Andes La 102 Ermindo 202 Walker Paz 13. Challapata Oruro Entrega completa para 400 Ermindo 400 Walker 800 animales 14. Guaqui La Paz Entrega completa para 400 Ermindo 275 Walker 900 animales 15. Pucarani Prov. Los Andes La 150 Ermindo 150 Walker Paz 16. Pucarani Prov. Los Andes La 173 Pachuco 88 Walker Paz 17. Soracachi Oruro Entrega completa para 400 Ermindo 200 Walker 18. Proyecto ISA Municipio de Caracollo 200 animales 15 Pachuco 31 Darper 45 Walker El total de material criocongelado entregado a los diferentes municipios de Bolivia asciende a 4135 pajuelas de las dos razas de bovinos Holstein y Pardo Suizo de 4 diferentes toros 28

29 donadores de semen, este material tiene una motilidad de 60 a 70 % pos descongelamiento siendo un material adecuado para poder fertilizar a vientres disponibles mediante Inseminación Artificial utilizando sincronizadores de celo en estos animales. NUMERO DE ANIMALES DONADORES DE SEMEN GANADO BOVINO Razas Nombre Edad Estado Holstein Pachuco 8 años Donador (final) Holstein Ermindo 2,5 años Donador Holstein Darper 4 años Donador con electro Holstein Apolo 1.8 años En proceso Holstein S/N ternero Holstein S/N ternero Holstein Ruso ternero Pardo suizo Walker 5 años Donador Total 8 animales PAJUELAS CRIOCONGELADAS DISPONIBLES EN LABORATORIO Razas Numero de pajuelas Holstein (Ermindo) 400 Pardo suizo (Walker) 350 Total 550 Además de las evaluaciones realizadas por parte del laboratorio de mejoramiento de ganado de altura del CEAC se fueron realizando otras pruebas en diferentes laboratorios, donde de acuerdo a las normas Nacionales que exige el Senasag para el manejo de material genético en territorio Boliviano deben realizarse pruebas de este material en cuanto a análisis de enfermedades reproductivas y análisis bacteriológico del semen, análisis que están en pleno proceso de ejecución. Por otra parte se ha llevado muestras de pajuelas crio congeladas al laboratorio de mejoramiento de la Universidad Gabriel Rene Moreno de la Ciudad de Santa Cruz, en la cual mediante equipos computarizados más modernos se pudo corroborar la calidad del semen procesado en el CEAC. 29

30 ESTUDIO CITOMORFOLÓGICO DEL SEMEN Sperm Class Analyzer Sistema automático de análisis de semen por computadora Laboratorio de Análisis MICROPTIC S.L. SCAProduction DATOS DE IDENTIFICACIÓN Identificador: Raza: Operador: ERMINDO HOLSTEIN Videz, José Análisis: Referencia: Volumen Total eyaculado: 0,00 ml Diluyente inicial: 0 ml Dilución para el análsis 1: 0 Diluyente: AndroMed Peso: gr Casa comercial: 1 RESULTADOS DETALLADOS Total Porcentaje movilidad ( % ) Estáticos 46 12,6% Móviles ,4% Progresivos ,2% ,0% CONCENTRACIÓN millones por ml en eyaculado Total Total Porcentaje Total Porcentaje morfología ( % ) acrosoma ( % ) Normales 0 100,0% Normales Anormales 0 0,0% Anormales Total Porcentaje Total Porcentaje morfología detallada ( % ) ( % ) Análisis de Imagen 30

31 ESTUDIO CITOMORFOLÓGICO DEL SEMEN Sperm Class Analyzer Sistema automático de análisis de semen por computadora Laboratorio de Análisis MICROPTIC S.L. SCAProduction DATOS DE IDENTIFICACIÓN Identificador: Raza: Operador: WALKER PARDO SUIZO Videz, José Análisis: Referencia: Volumen Total eyaculado: 0,00 ml Diluyente inicial: 0 ml Dilución para el análsis 1: 0 Diluyente: AndroMed Peso: gr Casa comercial: 1 RESULTADOS DETALLADOS Total Porcentaje movilidad ( % ) Estáticos 56 15,7% Móviles ,3% Progresivos ,6% ,0% CONCENTRACIÓN millones por ml en eyaculado Total Total Porcentaje Total Porcentaje morfología ( % ) acrosoma ( % ) Normales 0 100,0% Normales Anormales 0 0,0% Anormales Total Porcentaje Total Porcentaje morfología detallada ( % ) ( % ) Análisis de Imagen 31

32 ESTUDIO CITOMORFOLÓGICO DEL SEMEN Sperm Class Analyzer Sistema automático de análisis de semen por computadora Laboratorio de Análisis MICROPTIC S.L. SCAProduction DATOS DE IDENTIFICACIÓN Identificador: Raza: Operador: PACHUCO HOLSTEIN Videz, José Análisis: Referencia: Volumen Total eyaculado: 0,00 ml Diluyente inicial: 0 ml Dilución para el análsis 1: 0 Diluyente: AndroMed Peso: gr Casa comercial: 1 RESULTADOS DETALLADOS Total Porcentaje movilidad ( % ) Estáticos 31 25,2% Móviles 92 74,8% Progresivos 4 3,3% ,0% CONCENTRACIÓN millones por ml en eyaculado Total Total Porcentaje Total Porcentaje morfología ( % ) acrosoma ( % ) Normales 0 100,0% Normales Anormales 0 0,0% Anormales Total Porcentaje Total Porcentaje morfología detallada ( % ) ( % ) Análisis de Imagen 32

33 6. TRABAJOS DE INVESTIGACION Nombre Proyectos IDH trabajos en convenio con comunidades aledañas al CEAC Erik Fortunato Díaz Chirilla. Waldo David Mamani Quispe Tema Validación de tecnologías reproductivas de bovinos mejorados en comunidades en convenio con el CEAC FCAVUTO Evaluación de las características microscópicas del semen de toros de la raza holstein (bos tauros) en el C.E.A.C. Crio conservación de semen de bovinos de la raza holstein(bous tauros) de altura en el CEAC Perfil y Avance Trabajo de campo 100 % Defendido y Aprobado 100 % Defendido y Aprobado 100 % Defendido y Aprobado Resultados Elaboración de registros individuales de cada animal entregados a 3 productores de las comunidades de Ventilla y Sau Sau en un total de 10 registros individuales. Se cuenta con 39 ejemplares caracterizados morfometrica y linealmente en el CEAC, Ventilla, Khankani, Sau Sau hasta fines del mes de agosto. En el mes de agosto se llego a inseminar artificialmente a 13 vacas con el protocolo de línea SINTEX de procedencia Argentina. Se realizo el diagnostico de gestación de cada unidad experimental por el método de palpación rectal llegando a un numero de 20 del total de las vacas inseminadas en 3 comunidades, Ventilla, Sau Sau y Kakani. Evaluación de las características macro y microscópicas del material procesado con las tres técnicas. Se cuenta con pruebas de viabilidad de pajuelas y un proceso de 1200 pajuelas entregadas al MDRyT. Se ha elaborado un modelo de Catalogo regional lechero para ser aprobado por productores e instituciones en el rubro lechero. La presentación del proyecto se hace en diferentes ámbitos con exposiciones y demostraciones. 350 cartillas (trípticos) son difundidos entre los beneficiarios, instituciones y interesados para la sociabilización del proyecto. Mayor interés de productores que no se encuentran dentro de las comunidades del proyecto pero que solicitan el servicio de inseminación artificial con celo detectado y sincronizado La fertilidad mediante la IATF con el primer protocolo alcanzo a 99% hasta el mes de agosto. Referente a las interacciones Toro*Hora, Toro*Número eyaculación, Hora*Número eyaculación y Toro*Hora*Número eyaculación también son significativas a P: 0.01, La concentración de espermatozoides presenta significación a P: 0.01 en todas las fuentes de variación, Expone motilidad rápida entre 31 al 61 % en el estudio, motilidad masiva entre 17 a 42 % y motilidad lenta entre 15 a 17 %, Este trabajo permitió observar como la calidad seminal de un toro puede cambiar bastante y rápidamente, dependiendo de si el toro está pasando o recuperándose de un proceso que afecte la espermatogenesis. Al analizar el semen a través de las pruebas de laboratorio es muy importante ya que permite evaluar alteraciones de su calidad luego de los procesos de congelación y descongelación. La motilidad masal la cual es un factor importante con la fecundidad tuvo una diferencia (P: 0.001) entre reproductores obteniendo una media de Media = 82.33%/ mm 3. 33

34 Mónica Encina Canaviri Nilda Chirilla Diaz Evaluación de dos diluyentes en la crio conservación de semen de bovinos de la raza holstein y pardo suizo (bos taurus) bajo condiciones en el C.E.A.C. Evaluación andrologica y examen físico de semen de toros de la raza holstein en el CEAC 100 % Defendido y Aprobado 100 % Defendido y Aprobado Con respecto a los movimientos progresivos y rápidos se obtuvo de a 92.3% y la motilidad lenta de 7.09 a 18,2% los cuales están en rangos aceptados para su crio conservación. La calidad espermática igualmente presento una significancia estadística con una probabilidad de (P: 0.001) existiendo diferencia entre reproductores. La motilidad progresiva al descongelado, se llegó a los siguientes resultados de los cuales se tomaron en dos tiempos el primero a las cero de motilidad progresiva muestra una motilidad de 27.8 a 48,47 y las 2 horas de 25,8 a 39.0 los cuales muestran un diferencia significativa con una probabilidad de (P: 0.001) 0 Horas =41,6 % de espermatozoides con motilidad progresiva. Vigor 3, 2Horas =33.34 % de espermatozoides con motilidad progresiva. Vigor 2. En cuando la integridad del acrosoma podemos mencionar que si existió diferencia estadística con una probabilidad de (P: 0.001) El semen recolectado tiene una diferencia en el volumen en las dos diferentes razas. Siendo mayor la del pardo suizo con 6.9 ml y la raza holstein con 3.05 ml. La motilidad individual progresiva no tuvo diferencia estadística mostrando un promedio de % de motilidad siendo buena (B). La Motilidad masal del semen de las dos razas no presentaron diferencias significativas. La mayor concentración espermática en el semen de los toros de la raza holstein que la del pardo suizo. En la evaluación pos descongelamiento se obtuvo mejores y mayores porcentajes de motilidad y viabilidad espermática en semen diluido con el dilutor ANDROMED con promedios de más del 40 % en relación al dilutor PBS que tuvieron un comportamiento de motilidad y viabilidad más bajo Hecha la evaluación de la parte física del corral se ha podido establecer, que los reproductores, ósea los toros duermen a la intemperie, Pese a que algunos toros cuentan con una vida reproductiva avanzada hecha la prueba de libido, todavía muestran un buen deseo sexual. La evaluación reproductiva de los toros debería ser la herramienta principal de rutina para monitorear el desempeño de los sementales. El conocimiento de la capacidad fecundante de cada toro debería ser uno de los principales objetivos en la producción de semen bovino. Durante la evaluación del estudio no se ha podido detectar toros con anomalías de carácter genético más aún con mayor probabilidad de una respuesta satisfactoria en sus descendientes. El volumen de eyaculación de los cuatro toros referente a edades, hora de recolección y frecuencia de recolección obtuvieron un promedio de 5.9 ml para el toro Rubén; 6,2 ml para el toro Gastón; 5.7 para el toro Gustavo y por último para el toro Pachuco con 5,6 ml. El efecto edad en cuanto se refiere a condición corporal de los cuatro toros fue variable dentro la escala de (1 a 5), obteniéndose valores de 3.0 a 3,5 de grado corporal. A la 34

35 Víctor Jacinto Danitza Flores G. Elías Carvajal M Reyna Condori M. Análisis bacteriológico en el semen ant y pos congelamiento en semen de bovinos Efecto de productos homeopáticos y la vitamina E en el control de la muerte embrionaria en llamas empadradas con MNC en el CEAC Inseminación artificial en llamas con semen fresco y congelado Diluyentes para la crio conservación de semen de 2 razas de ovinos en el CEAC Iver Condori Conservación de semen a tres diferentes niveles de temperatura en 2 razas de ovinos Freddy Llanque Inseminación con semen fresco y congelado en 2 razas de ovinos Perfil aprobado con 50 % de avance Perfil aprobado con trabajo de campo concluido Perfil aprobado con trabajo de campo concluido Perfil aprobado con 70 % de trabajo de campo Perfil aprobado con trabajo de campo concluido Perfil aprobado con trabajo de campo concluido evaluación macroscópica del semen, la interacción del componente edad no tuvo mucha influencia en la producción del volumen de eyaculación. En proceso En proceso En proceso En proceso En proceso En proceso 7. APOYO ACADÉMICO Capacitación a delegaciones de estudiantes, productores, asociaciones dentro y fuera del Departamento de Oruro Durante el periodo de agosto del 2011 a julio del 2013 el laboratorio de de mejoramiento genético dentro de sus funciones fue capacitando a diferentes delegaciones e instituciones que van visitando el C.E.A.C. haciendo conocer el trabajo encarado con la UTO y el MDRyT las ventajas y beneficios que tiene este proyecto, llegando a tener visitas de Universidades a Nivel Nacional e Internacional, delegaciones de productores a nivel departamental y nacional. 35

36 Además de que el laboratorio de mejoramiento de ganado de altura realizo 2 cursos a nivel Departamental: el primero fue para el municipio de Toledo donde se realizo un curso teórico practico sobre caracterización, recolección dilución, crio conservación en inseminación artificial en ganado ovino, el segundo fue para el Municipio de Caracollo donde se realizo el curso práctico de Inseminación Artificial en ganado bovino. 36