NOVA Lite TM IgG F-Actin Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos. Para uso diagnóstico in vitro. Complejidad CLIA: Alta.
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- Pablo Campos Acuña
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1 NOVA Lite TM IgG F-Actin Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos. Para uso diagnóstico in vitro. Complejidad CLIA: Alta. Uso previsto El kit NOVA Lite TM IgG F-Actin es un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) sobre sustrato epitelial de intestino de rata para la detección y la determinación semicuantitativa de anticuerpos IgG anti-actina F en suero humano. La presencia de anticuerpos IgG anti-actina F puede utilizarse en combinación con los resultados clínicos y otras pruebas de laboratorio para contribuir al diagnóstico de enfermedades hepáticas autoinmunes, como la hepatitis autoinmune (AIH) y la cirrosis biliar primaria (PBC). Resumen y explicación de la prueba Los autoanticuerpos IgG anti-actina F son el componente principal de los denominados anticuerpos antimúsculo liso (ASMA). 1-6 Estos anticuerpos se encuentran en hasta el 80 % de los pacientes con hepatitis autoinmune (AIH) y en hasta el 30 % de los pacientes con cirrosis biliar primaria, 2,6 pero también pueden hallarse, generalmente en títulos bajos, en personas sin AIH. Los ASMA son heterogéneos y comprenden anticuerpos contra las formas filamentosa (F) y globular (G) de la actina, además de componentes no actínicos como la tubulina y los filamentos intermedios. 3,4,7 Existen varios autoanticuerpos asociados a la AIH. Sin embargo, los anticuerpos IgG anti-actina F son los autoanticuerpos más específicos para la AIH. 2,5 Aunque los análisis ELISA para IgG anti-actina F, como el ELISA QUANTA Lite Actin IgG, permiten detectar anticuerpos IgG anti-actina F de una manera objetiva y cuantificable, algunos laboratorios prefieren la metodología IFA para detectar anticuerpos IgG anti-actina F o para confirmar su presencia cuando son detectados mediante los habituales cortes tisulares de riñón/estómago/hígado (KSL). A menudo resulta difícil diferenciar los anticuerpos anti-actina F de otros anticuerpos anti-músculo liso utilizando sustratos de IFA convencionales como los cortes tisulares de KSL. 2,5 La identificación de los anticuerpos anti-actina F constituye una ayuda importante en el diagnóstico de la AIH. Actualmente no está disponible ningún método estándar de referencia para distinguir los anticuerpos anti-actina F de otras reactividades. 1,2 Los portaobjetos de células epiteliales de intestino de rata preparadas con métodos patentados de crecimiento y fijación proporcionan un nuevo sustrato para la detección de anticuerpos IgG anti-actina F mediante IFA. Este sustrato supera algunas de las limitaciones de otros procedimientos de IFA, puesto que el patrón de IgG anti-actina F es inequívoco y todos los anticuerpos que generan un patrón de interferencia en los portaobjetos de KSL no interfieren con el sustrato de células epiteliales de rata. Principios del procedimiento En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con el sustrato antigénico y los anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavado. El sustrato se incuba entonces con un conjugado específico marcado con fluoresceína y, a continuación, se efectúa un lavado para eliminar el reactivo no unido. Al observarlas en un microscopio de fluorescencia, las muestras presentarán una fluorescencia de color verde manzana correspondiente a las zonas a las que se ha unido el autoanticuerpo. Se considera que una muestra es positiva si se observa tinción específica en las fibras de actina F que rodean a la mayor parte de las células según un patrón hexagonal y, a veces, en las fibras que van de una célula a otra. Reactivos 1. Portaobjetos con actina F; 12 pocillos/portaobjetos, con desecante. 2. Conjugado de anti-igg humana (de cabra), marcado con fluoresceína en un tampón que contiene azul de Evans y un 0,09 % de azida de sodio. 3. Control positivo de IgG anti-actina F; 1 vial de tampón que contiene un 0,09 % de azida de sodio y anticuerpos de suero humano anti-actina F; prediluido. 4. Control negativo del sistema IFA; 1 vial de tampón que contiene un 0,09 % de azida de sodio y no contiene anticuerpos de suero humano anti-actina F; prediluido. 5. Concentrado de PBS (40x). 6. Medio de montaje, 0,09 % de azida de sodio. 7. Cubreobjetos. Advertencias 1. Todo el material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto ha sido analizado y ha producido un resultado negativo con respecto a la presencia de anticuerpos del VIH, el HBsAg y el VHC, según métodos aprobados por la FDA. Sin embargo, ningún método de análisis puede ofrecer plenas garantías de la ausencia del VIH, el VHB, el VHC u otros agentes infecciosos. Por tanto, el control positivo de IgG anti-actina F y el control negativo del sistema IFA deben tratarse de la misma manera que si fueran materiales potencialmente infecciosos. 8 1
2 2. Se utiliza azida de sodio como conservante. La azida de sodio es una sustancia venenosa y puede resultar tóxica si se ingiere o si se absorbe a través de la piel o los ojos. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías y formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si utiliza las pilas de lavado para eliminar reactivos, aclare con abundante cantidad de agua para evitar la formación de azidas metálicas. 3. Utilice un equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con los reactivos suministrados. 4. Los vertidos de reactivos deben limpiarse inmediatamente. Cumpla todas las normas estatales y locales sobre protección del medio ambiente para la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto está destinado a uso diagnóstico in vitro. 2. La sustitución de los componentes suministrados con este kit por otros diferentes puede dar lugar a resultados incoherentes. 3. Un lavado incompleto o ineficaz de los pocillos del IFA puede generar valores de fondo elevados. 4. La adaptación total o parcial de este análisis para utilizarlo con procesadores automáticos de muestras y otros dispositivos de manipulación de líquidos puede producir diferencias en los resultados del análisis con respecto a los resultados obtenidos siguiendo el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio comprobar que el procedimiento automático empleado da unos resultados que se encuentran dentro de los límites aceptables. 5. Existen varios factores que influyen en el rendimiento del análisis: la temperatura inicial de los reactivos, la potencia de la lámpara utilizada por el microscopio, la precisión y la reproducibilidad de la técnica de pipeteado, la exhaustividad del lavado y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario mantener la máxima coherencia durante el análisis para obtener resultados precisos y reproducibles. 6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo indicado. Condiciones de almacenamiento 1. Almacene todos los reactivos del kit a 2-8 C. No los congele. Los reactivos permanecen estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan y manipulan como está indicado. 2. El tampón de PBS diluido permanece estable durante 4 semanas a 2-8 C. Recogida de muestras Este procedimiento debe realizarse con una muestra de suero. La adición de azida u otros conservantes a las muestras del análisis puede afectar de manera negativa a los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas con microorganismos, tratadas con calor, muy hemolizadas o lipémicas que contengan partículas visibles. Tras la recogida, el suero debe separarse del coágulo. El documento H18-A3 del NCCLS recomienda las siguientes condiciones de almacenamiento para las muestras: 1) No guarde las muestras a temperatura ambiente por más de 8 horas. 2) Si el análisis no se efectúa en un plazo de 8 horas, refrigere las muestras a 2-8 C. 3) Si el análisis no va a realizarse en un plazo de 48 horas o si debe preparar las muestras para enviarlas, congélelas a una temperatura de 20 C o inferior. Las muestras congeladas deben mezclarse bien después de descongelarse y antes del análisis. Procedimiento Materiales suministrados 5 Portaobjetos con 12 pocillos de actina F. 1 7 ml de conjugado de anti-igg humana FITC. 1 0,8 ml de control positivo de IgG anti-actina F. 1 0,5 ml de control negativo del sistema IFA ml de concentrado de PBS (40x). 1 7 ml de medio de montaje. 1 Envase con 10 cubreobjetos. Materiales adicionales necesarios no suministrados Micropipetas para dispensar un volumen de μl. Agua destilada o desionizada. Botellas comprimibles o pipetas Pasteur. Cámara de humedad. Recipiente de 1 L (para diluir el PBS). Frasco Coplin. Microscopio de fluorescencia con excitador de 495 nm y filtro de barrera de 515 nm. 2
3 Método Antes de comenzar 1. Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20-26 o C). 2. Diluya el concentrado de PBS. IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 añadiendo el contenido de la botella de concentrado de PBS a 975 ml de agua destilada o desionizada y mezcle completamente. El tampón de PBS se utiliza para diluir las muestras de los pacientes y como tampón de lavado. La muestra diluida puede almacenarse hasta 4 semanas a 2-8 C. 3. Diluya las muestras de los pacientes: a. Detección inicial: Diluya las muestras de los pacientes al 1:40 con tampón de PBS diluido (es decir, añada 50 μl de suero a 1,95 ml de tampón de PBS). b. Titulación: Realice sucesivas diluciones a la mitad partiendo de la dilución inicial de detección para todas las muestras positivas con tampón de PBS (es decir, diluya a 1:80, 1:160, 1:320, etcétera, hasta la concentración final). Procedimiento del ensayo 1. Preparación de los portaobjetos del sustrato: Deje que el portaobjetos del sustrato alcance la temperatura ambiente antes de extraerlo de la bolsa. Etiquételo con lápiz y colóquelo en una cámara de humedad adecuada. Añada una gota (20-25 μl) del positivo sin diluir y del control negativo a los pocillos 1 y 2, respectivamente. Añada una gota (20-25 μl) de muestra de paciente diluida a los demás pocillos. 2. Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante 30 ± 5 minutos en una cámara de humedad (para mantener las condiciones de humedad adecuadas, puede colocar una toalla de papel húmeda horizontalmente en el fondo de un recipiente cerrado de plástico o vidrio). Evite que el sustrato se seque durante el procedimiento del ensayo. 3. Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice una botella comprimible de plástico o una pipeta para eliminar suavemente el suero mediante tampón de PBS diluido. Oriente el portaobjetos y el flujo de tampón de PBS de manera que el desbordamiento de muestras entre pocillos sea mínimo. No apunte el flujo directamente a los pocillos para evitar que el sustrato resulte dañado. Si lo desea, coloque los portaobjetos en un frasco Coplin con tampón de PBS diluido durante 5 minutos como máximo. 4. Adición del conjugado fluorescente: Elimine el exceso de tampón de PBS. Vuelva a colocar el portaobjetos en la cámara de humedad y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros 30 ± 5 minutos. 5. Lavado de los portaobjetos: Repita el paso Cubreobjetos: Aunque los procedimientos relativos a los cubreobjetos varían de un laboratorio a otro, se recomienda utilizar el método siguiente: a. Coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel. b. Aplique el medio de montaje en el borde inferior del cubreobjetos siguiendo una línea continua. c. Elimine el exceso de tampón de PBS y ponga en contacto el borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos. Haga descender suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de manera que el medio de montaje fluya hasta el borde superior del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni estas queden atrapadas entre ambos. Control de calidad El análisis del control positivo de IgG anti-actina F y del control negativo del sistema IFA debe realizarse en todos los portaobjetos para asegurar que los reactivos y procedimientos actúan correctamente. Pueden prepararse sueros de control adecuados adicionales obteniendo muestras alícuotas de suero humano combinado y almacenándolas a una temperatura de 70 o C o inferior. Para considerar válidos los resultados del análisis, deben cumplirse todos los criterios indicados a continuación. Si alguno de ellos no se cumple, los resultados del análisis se considerarán no válidos y deberá repetirse el ensayo. 1. El control positivo sin diluir de anticuerpo IgG anti-actina F debe ser 3+ o superior. 2. El control negativo del sistema IFA debe ser negativo. Interpretación de los resultados Reacción negativa: Se considera que una muestra es negativa si la tinción específica, tal como está descrita en el apartado siguiente («Reacción positiva»), es menor o igual que la del control negativo del sistema IFA. Las muestras pueden presentar varios grados de tinción específica o de fondo en respuesta a otros componentes celulares y, sin embargo, pueden ser negativas con respecto a los anticuerpos IgG anti-actina F. Reacción positiva: Se considera que una muestra es positiva si se observa una tinción específica más intensa que la del control negativo del sistema IFA en las fibras de actina F que rodean a la mayor parte de las células según un patrón hexagonal y, a veces, en las fibras que van de una célula a otra. Determine el grado o la intensidad de la fluorescencia aplicando los criterios siguientes: 4+ Fluorescencia verde manzana muy brillante. 3+ Fluorescencia verde manzana brillante. 2+ Fluorescencia positiva claramente distinguible. 1+ La fluorescencia específica más baja que permite diferenciar claramente la tinción de la actina F de la fluorescencia de fondo. 3
4 Interpretación del patrón: Pueden observarse varios patrones de tinción nuclear y/o citoplasmática, según los tipos y las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Solo el patrón descrito anteriormente en el apartado «Reacción positiva» debe considerarse positivo con respecto a los anticuerpos IgG anti-actina F. Todos los demás patrones deben considerarse negativos. Limitaciones del procedimiento 1. El patrón de IgG anti-actina F con una titulación alta indica AIH, pero no debe atribuírsele valor diagnóstico. El resultado de la IgG anti-actina F debe evaluarse de forma combinada con otros resultados de laboratorio y con toda la historia clínica del paciente. 2. Existen varios factores externos que influyen en la sensibilidad del análisis: el tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y la antigüedad de la lámpara, la ampliación aplicada, el sistema de filtrado y el observador. 3. Si se emplea un filtro de paso de banda en lugar de un filtro de barrera de 515 nm, puede observarse una tinción más intensa, debida a artefactos. 4. Los portaobjetos deben etiquetarse únicamente mediante un lápiz. El uso de cualquier otro material de escritura puede provocar tinción debida a artefactos. 5. Todos los frascos Coplin utilizados para lavar los portaobjetos deben estar libres de residuos de tinción. El uso de frascos Coplin que presenten residuos de tinción puede dar lugar a una tinción debida a artefactos. 6. Las características de rendimiento del análisis han sido verificadas para el suero, pero no para el plasma u otros tipos de muestras. Valores esperados La capacidad del kit NOVA Lite TM IgG F-Actin para detectar anticuerpos IgG anti-actina F se ha evaluado mediante una comparación con el ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgG que se comercializa actualmente (INOVA Diagnostics, Inc). Los resultados del ELISA se han considerado positivos cuando la muestra del paciente ha presentado un valor de 20 unidades o superior y se han definido como negativos si dicho valor ha sido inferior a 20 unidades. Rango normal Se han analizado 493 muestras de donantes de sangre normales mediante el kit NOVA Lite TM IgG F- Actin. Todas las 493 muestras normales excepto cuatro (especificidad: 99,2 %) han dado un resultado negativo en el ensayo NOVA Lite TM IgG F-Actin. Comparación entre el IFA NOVA Lite TM IgG F-Actin y el ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgG Con objeto de determinar los porcentajes de concordancia positiva y negativa de los ensayos, se analizaron 992 muestras que contenían anticuerpos frente a una amplia gama de antígenos mediante el IFA NOVA Lite TM IgG F-Actin y el ELISA QUANTA Lite TM Actin IgG. Las muestras pertenecían a 493 donantes de sangre normales, 60 pacientes con enfermedades clínicamente definidas (artritis reumatoide, LES y esclerodermia), 40 muestras con anticuerpos identificados (anticuerpos de enfermedades infecciosas y autoanticuerpos) y 399 muestras de pacientes que podían padecer enfermedad hepática. N = 992 ELISA QUANTA Lite TM Actin IgG Positivo ELISA QUANTA Lite TM Actin IgG Negativo Total NOVA Lite TM IgG F-Actin Positivo ** 290 NOVA Lite TM IgG F-Actin Negativo 69* Total Concordancia positiva (%): 269/338 (80 %) Concordancia negativa (%): 633/654 (97 %) Concordancia total (%): 902/992 (91 %) * 39 de los 69 fueron positivos débiles en el ELISA ** 14 de los 21 fueron 1+ en el IFA (baja reactividad) 4
5 Referencias 1. Chretien-Leprince P, Ballot E, Andre C, et al. Diagnostic value of anti-f-actin antibodies in a French multicenter study. Ann NY Acad Sci 1050: , Villalta D, Bizzaro N, Da Re M, et al. Diagnostic accuracy of four different immunological methods for the detection of anti-f-actin autoantibodies in type 1 autoimmune hepatitis and other liver related disorders. Autoimmunity 41: , Czaja A, Norman G: Autoantibodies in the diagnosis and management of liver disease. J Clin Gastroenterol 37: , Toh BH. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin exp Immunol 38: , Fusconi M, Cassani F, Zauli D, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem. Journal of Immunological Methods 130: 1-8, Granito A, Muratori L, Muratori P, et al. Antibodies to filamentous actin (F-actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Path 59: , Dighiero G, Lymberi P, Monot C. Sera with high levels of anti-smooth muscle and antimitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin exp Immunolol 82: 52-56, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (Domestic) : Technical Service (International) : info@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ESP February 2010 Revision 0 5
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