QUANTA Lite TM ANA ELISA Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto

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1 QUANTA Lite TM ANA ELISA Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto Aplicación QUANTA Lite TM ANA es un ensayo basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la detección semi cuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) en suero humano. La presencia de ANA puede utilizarse en conjunción con los resultados clínicos y otras pruebas de laboratorio para ayudar a la determinación del diagnóstico de enfermedades reumáticas como el lupus eritematoso sistémico, el síndrome de Sjögren, el escleroderma y enfermedades combinadas del tejido conectivo. El ensayo detecta de forma colectiva, en un solo pocillo, la cantidad total de ANA respecto de la cromatina (ADN de doble cadena e histonas), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centrómeros y PCNA, así como los anticuerpos respecto de antígenos citoplasmáticos importantes desde el punto de vista del diagnóstico, como el Jo-1, las mitocondrias (M-2) y la proteína P ribosomal. Las muestras de suero que dan positivo para antígenos indefinidos mediante el test tradicional de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta en células HEp-2 también son detectables. Sumario y Explicación de la prueba La presencia de ANA es una de las marcas distintivas de las enfermedades sistémicas autoinmunes. 1-4 Tradicionalmente, los ANA se han detectado mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA), utilizando secciones de riñón de ratón o células HEp-2 como substrato. 3 También se pueden aplicar otros ensayos a las muestras de suero ANA positivas, como la técnica ELISA, Western blot o la inmunoprecipitación, con el fin de identificar anticuerpos específicos en el suero. 1-4 Recientemente, se ha utilizado una mezcla de antígenos relevantes desde el punto de vista diagnóstico, junto con un extracto de células HEp-2, para detectar los ANA en los tests ELISA. 5-9 Entre las ventajas de los tests ELISA para ANA respecto de la IFA se incluye una mayor comodidad de uso, la ausencia de errores debidos a los observadores o a los equipos utilizados, unos resultados semicuantitativos y menor número de falsos positivos biológicos. Las desventajas de los métodos ELISA comparados con la IFA incluyen una falta de sensibilidad frente a ciertos antígenos nucleares y citoplasmáticos desconocidos, y la falta de un patrón de ANA que siempre se obtiene con la IFA. Sin embargo, la utilidad diagnóstica de un ANA de especificidad desconocida no está clara en estos momentos, puesto que muchos sujetos sanos son ANA positivos pero dan negativo para los autoanticuerpos relevantes desde el punto de vista diagnóstico Además, una vez se ha identificado una especificidad en el suero, el patrón de ANA deja de tener relevancia en la diagnosis. Así pues, los métodos ELISA para ANA tienen una importancia clara para los laboratorios clínicos. Procedimiento de trabajo Los antígenos individuales altamente purificados, más los extractos de núcleos y nucleolos de HEp-2, se unen a la superficie de una placa de micropocillos. Entre los antígenos se incluyen la cromatina (ADN de doble cadena e histonas), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centrómeros, PCNA, Jo-1, mitocondrias (M-2) y proteínas P ribosomales, así como extractos nucleares y nucleolares de HEp-2 purificados. Recientemente se ha demostrado que la reactividad de la anticromatina es sensible y actúa como marcador anticipado del LES. 13 Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti ANA al antígeno que los recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. El ensayo puede ser evaluado fotométricamente comparando la intensidad de color en las muestras con la de los controles. Reactivos 1. Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con antígeno nuclear y citoplasmático purificado (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante 2. Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos humanos anti-nuclear y citoplasmático, prediluido, 1.2 ml 3. Control ELISA ANA Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos anti-nuclear y citoplasmático, prediluido, 1.2 ml 4. Control ELISA ANA Positivo Fuerte, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos anti-nuclear y citoplasmático, prediluido, 1.2 ml 5. Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampón con Tris, Tween 20 y conservante, 50 ml 6. Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampón con Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección Metodología para instrucciones de dilución. 7. Conjugado HS HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco - color morado conteniendo tampón, estabilizante de proteína y conservante, 10ml 8. Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml 9. Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico M, 1 frasco, incolora, 10 ml 1

2 Advertencias 1. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer. 2. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles ANA ELISA positivo fuerte, ANA ELISA positivo débil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 4. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. 5. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. 6. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. 7. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 8. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. 3. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar lugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado. 4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables. 5. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de técnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles. 6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. 7. El sellado incompleto de la bolsa zip-lock que contenga tiras sin usar y desecante provocará la degradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados. 8. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de un conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para este producto para evitar que esto ocurra. 9. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el laboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos. Condiciones de Almacenaje 1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8 C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. 2. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC. 3. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8 C. Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8 C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20 C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. 2

3 Procedimiento Materiales Suministrados 1 Microplaca ANA ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte ml control negativo ELISA prediluido 1 1.2ml control prediluido ANA ELISA Positivo Débil 1 1.2ml control prediluido ANA ELISA Positivo Fuerte 1 50ml Diluyente de muestra HRP 1 25ml Solución de lavado concentrada 40X 1 10ml Conjugado HS HRP IgG (cabra) anti IgG humana 1 10ml Cromógeno TMB 1 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M) Material necesario no incluido Micropipetas para 5, 100, y 500µl Puntas desechables para micropipeta Tubos para dilución de muestras, 4ml Agua destilada Recipiente de 1L para la solución de lavado reconstituida Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud de onda) Metodología Antes de empezar 1. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26 C) y agitar. 2. Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución de lavado añadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. El tampón diluido es estable 1 semana a 2-8 C. 3. Prepare una dilución 1:41 de cada muestra añadiendo 10μL de muestra a 400μL de Diluyente de Muestras ANA. NO DILUYA las muestras ELISA ANA Positivas Débiles, ELISA ANA Positivas Fuertes y el Control Negativo. Las muestras diluidas deben utilizarse en un plazo de 8 horas después de su preparación. Nota: Si se desea, las muestras diluidas a 1:41 en Diluyente de Muestras ANA pueden pipetearse directamente en el substrato de células HEp-2 para confirmar los ANA positivos y determinar el patrón de ANA. Las muestras positivas pueden valorarse según el método de punto final utilizando como diluyente una solución salina estándar tamponada con fosfato. No se han verificado las soluciones iniciales de las muestras de pacientes que no están en una proporción de 1:41 en este tampón. 4. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti ANA usando unidades arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado. Procedimiento de Ensayo 1. TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) ANTES DE EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposición a la humedad. 2. Agregar 100µl de los controles prediluidos ANA ELISA Positivo Débil, ANA ELISA Positivo Fuerte, ELISA Negativo y las muestras prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana. El tiempo de incubación empieza después de la adición de la última muestra. 3. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar µl de solución de lavado a todos pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Es importante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras. 4. Agregar 100µl de Conjugado HS HRP IgG a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones más asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso Lavado: Repetir el paso Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. 7. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización que la efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos. 8. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia. 3

4 Control de Calidad 1. Los controles ANA ELISA Positivo Débil, ANA ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo ELISA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionan correctamente. 2. El usuario debe notar que debido a que los controles ANA ELISA Positivo Débil, ANA ELISA Positivo Fuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución de especímenes. 3. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararse controles válidos haciendo alícuotas de un pool de suero humano que debe almacenarse a < -20 C. 4. Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados a continuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y repetirse. a. La absorbancia del control ANA Positivo debe ser superior a la del control ANA positivo débil y la de este debe ser superior a la del control negativo. b. El control ANA positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la del control negativo no debe exceder de c. La absorbancia del control ANA positivo débil debe ser superior al doble del control negativo, u oscilar entre d. Los controles ELISA negativo y ANA positivo fuerte están pensados para monitorizar problemas de reactivo de magnitud substancial. El control ANA positivo fuerte no puede asegurar precisión alguna en el punto de corte del ensayo. e. El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical Laboratory Standards) C24-A para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio. Cálculo de Resultados Debe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. La reactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por la densidad óptica promedio del control ANA positivo débil. DO Muestra Valor de la Muestra = x Valor ELISA Positivo Débil (unidades) DO ELISA Positivo Débil (unidades) La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente. Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán en el aumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por ejemplo, al doblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una cuantificación más precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de la muestra la última dilución positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra. Interpretación de los Resultados La técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes. La muestra puede clasificarse con un valor negativo, positivo moderado o positivo fuerte según la tabla siguiente. Unidades Negativo <20 Positivo Moderado Positivo Fuerte >60 1. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-ana y sugiere la posibilidad de enfermedades reumáticas como el lupus eritematoso sistémico, el síndrome de Sjögren, el escleroderma y enfermedades combinadas del tejido conectivo. 2. Un resultado negativo indica que no se ha detectado ninguno de los anticuerpos testados o que las cantidades de dichos anticuerpos se encuentran por debajo del umbral negativo del ensayo. 3. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación Los siguientes resultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final. Limitaciones del Procedimiento 1. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del paciente puede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en este ensayo. 2. No todos los pacientes con enfermedades del tejido conectivo dan positivo en las pruebas de anticuerpos antinucleares. 3. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. 4

5 4. Este ensayo no puede determinar la especificidad de un suero reactivo. Se recomienda realizar otros ensayos para determinar la presencia de anticuerpos específicos. 5. Los Controles ELISA ANA Positivo Débil y ELISA ANA Positivo Fuerte están compuestos por un suero RNP positivo. Este antígeno es uno de los más sensibles a la degradación. Por tanto, estos controles también son una forma sensible de medir la integridad de este antígeno. Se pueden incluir otros controles para comprobar los niveles de los distintos antígenos según el criterio de cada laboratorio. 6. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero. Valores Esperados Rango Normal El umbral entre un resultado negativo y uno positivo es de 20 unidades. Se ensayaron 246 muestras obtenidas de voluntarios sanos. Esta población estaba compuesta aproximadamente por un 65% de mujeres entre 18 y 75 años de edad, con una media de 38 años. Veintitrés (9.4%) dieron positivo, lo cual significa una especificidad del 90.6%. Sin embargo, 6 de las muestras que dieron positivo con el método ELISA, también dieron positivo por inmunofluorescencia indirecta con células HEp-2. Entre estas muestras se incluyen los dos positivos más altos de las muestras procedentes de voluntarios sanos, con 40 y 50 unidades. Teniendo en cuenta las 6 muestras ANA positivas de voluntarios sanos, sólo un 6.9% fueron falsos positivos biológicos. Las restantes muestras positivas de voluntarios sanos dieron unos resultados de 35 unidades o menos. Aproximadamente el 60% del panel de voluntarios sanos obtuvo unos resultados inferiores a las 10 unidades. Sensibilidad y Especificidad Relativas Comparación con otro ensayo ELISA de referencia para ANA disponible en el mercado Se ensayaron muestras definidas clínicamente utilizando el método INOVA QUANTA Lite ANA ELISA y otro método ELISA de referencia para ANA. Los resultados para la población sana y los de las muestras de pacientes con LES, síndrome de Sjögren y escleroderma se muestran en las siguientes tablas. Además, se ensayaron muestras de suero con anticuerpos reactivos al SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, la cromatina, proteína P ribosomal y M2, mediante el método ELISA. También se ensayaron muestras que habían dado positivo por inmunofluorescencia o Western blot para centrómeros, P-80 coilina, nucleolos y PCNA. Los kits ofrecieron unos resultados prácticamente idénticos. Como se puede deducir de las siguientes tablas, la sensibilidad relativa es del 89% y la especificidad relativa del 89%. Comparación entre sujetos sanos con ensayos ELISA de INOVA y de referencia para ANA. Normales n=134 Negativos 106 6** ELISA de referencia para ANA Positivos 13* 9*** * Estas muestras obtuvieron valores de entre 1 y 1.6 unidades de referencia, equivalentes a unidades INOVA. Cuatro de las muestras fueron ANA positivas por inmunofluorescencia indirecta con células HEp-2. ** Estas muestras obtuvieron unos valores entre 20 y 25 unidades INOVA. Dos de las muestras fueron ANA positivas por inmunofluorescencia indirecta. *** Tres de las muestras fueron ANA positivas por inmunofluorescencia indirecta. Comparación entre los pacientes con enfermedades reumáticas sistémicas (ERS) con los ensayos ELISA de INOVA y de referencia para ANA ERS n=100 Negativos 4* 1 ELISA de referencia para ANA Positivos 6 89 *Una de estas muestras dio negativo por inmunofluorescencia indirecta con células HEp-2. Comparación de las muestras con reactividades definidas con los ensayos ELISA de INOVA y de referencia para ANA Definidos n=74 Negativos 2* 7*** ELISA de referencia para ANA Positivos 1** 64 * Hubo una muestra de PCNA y otra de Scl-70, ambas ANA positivas por inmunofluorescencia indirecta con células HEp-2. ** Esta muestra dio positivo con patrón nucleolar por inmunofluorescencia indirecta. *** Entre estas muestras se incluyen 1 Scl-70, 1 RNP, 1 M2 y 4 Jo-1, todas con resultados bajos o moderados con el método ELISA para ANA de INOVA. Las muestras de Scl-70 y RNP fueron ANA positivas con células HEp-2. Las otras fueron ANA negativas, pero positivas citoplasmáticas débiles por inmunofluorescencia indirecta, tal y como era de esperar. 5

6 Comparación entre el ensayo QUANTA Lite ANA ELISA y la inmunofluorescencia indirecta con el ensayo NOVA Lite HEp-2 cells. Todas las muestras normales y clínicamente definidas que fueron ensayadas con el kit INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA también fueron ensayadas por inmunofluorescencia indirecta utilizando el kit NOVA Lite TM HEp-2 de INOVA. Para evitar desviaciones en los resultados, el técnico encargado de leer los resultados de la inmunofluorescencia indirecta no fue informado de la identidad de las muestras. Como puede verse en la siguiente tabla, el método ELISA para ANA detecta muchos menos ANA positivos entre la población sana que la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Además, como puede observarse en la segunda tabla, el método ELISA es casi tan sensible como la técnica HEp-2 a la hora de detectar los ANA en pacientes con LES, síndrome de Sjögren y escleroderma. Comparación de voluntarios sanos con los ensayos QUANTA Lite TM ANA ELISA y NOVA Lite TM HEp-2 cells Normales n=134 Negativos 91 10* IFA con células HEp-2 Positivos 28 5 * Estas muestras dieron 35 unidades o menos. Comparación de pacientes con ERS con los ensayos QUANTA Lite TM ANA ELISA y NOVA Lite TM HEp- 2 cells ERS n=100 Negativos 1 3** IFA con células HEp-2 Positivos 9* 87 * Hubo 3 muestras de pacientes con LES, síndrome de Sjögren y escleroderma con diversos patrones ANA por inmunofluorescencia indirecta, la mayoría con baja intensidad de ANA. ** Estas muestras pertenecían a pacientes con LES, uno de los cuales dio positivo fuerte para fluorescencia citoplasmático y positivo para proteínas P ribosomales con el procedimiento ELISA. Comparación de los tampones para la detección de ANA por inmunofluorescencia indirecta con células HEp-2. Se prevé que algunos laboratorios utilicen el kit QUANTA Lite TM ANA ELISA para detectar las muestras negativas y confirmar luego las positivas con ensayos convencionales de ANA por inmunofluorescencia indirecta. Para facilitar la tarea, el Diluyente de Muestras ANA se ha hecho compatible con los métodos IFA tradicionales. Un subgrupo de las muestras que fueron ensayadas para determinar la presencia de ANA por inmunofluorescencia indirecta con el kit NOVA Lite TM HEp-2 kit fue también ensayado con el mismo fin con células HEp-2 utilizando el Diluyente de Muestras ANA para diluir las muestras en lugar del diluyente PBS que se suministra con el kit NOVA Lite TM. Los resultados obtenidos utilizando dos diluyentes distintos fueron virtualmente idénticos para los pacientes con LES, síndrome de Sjögren y escleroderma. Sólo 5 de las 97 muestras fueron discrepantes. El Diluyente de Muestras ANA disminuyó la unión no específica, y en 3 ocasiones provocó una interpretación positiva de muestras que se habían considerado negativas anteriormente debido a un menor fondo de tinción citoplasmática, cosa que permitió observar un patrón de ANA. En dos ocasiones se realizó una interpretación negativa de muestras que antes se habían considerado positivos débiles debido a una menor tinción nuclear. Tal y como se esperaba, hubo un mayor número de discrepancias en los resultados con el panel normal, puesto que los resultados positivos débiles o negativos por inmunofluorescencia indirecta son más difíciles de determinar que los positivos fuertes. Utilizando el diluyente PBS, el 33% de los voluntarios sanos dieron positivo, mientras que sólo el 26% con el diluyente ELISA para ANA. Informes recientes indican un índice del 30% de ANA positivos en la población normal sana cuando se ensayan con una dilución de 1: La presencia en cuatro muestras positivas fue determinada diluyendo repetidamente las diluciones originales diluidas con Diluyente de Muestras ANA al 1:41 con PBS. Estas valoraciones de punto final estaban entre 1 dilución doble de las muestras que inicialmente se habían diluido con NOVA Lite PBS. No se han verificado las soluciones iniciales de las muestras de pacientes que no están en una proporción de 1:41 en Diluyente de Muestras ANA. Sensibilidad y Especificidad Clínicas Positivos con el método ELISA para ANA de INOVA Grupo de pacientes Número total # % Voluntarios sanos % Pacientes clínicamente definidos LES % Síndrome de Sjögren % Escleroderma % Definidos antigénicamente* % * Se ensayaron entre 4 y 9 muestras positivas para SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, cromatina, proteína P ribosomal y M2. También se ensayaron muestras que habían dado positivo por inmunofluorescencia o Western blot para centrómeros, P-80 coilina, nucleolos y PCNA. Según el estudio anterior, la sensibilidad clínica del ANA ELISA para LES es del 93%, y la especificidad clínica del 91%. El porcentaje de muestras ANA positivas en pacientes con LES se corresponde con los porcentajes indicados en otros estudios

7 Cabe resaltar que algunos de estos pacientes estaban bajo tratamiento con corticosteroides en el momento de obtener sus muestras de suero. Los pacientes con síndrome de Sjögren y escleroderma habían dado positivo para ANA por inmunofluorescencia indirecta. Resulta interesante que el número de falsos positivos biológicos con el método ELISA en la población sana fue notablemente menor que el que se ha observado con la técnica de células HEp-2 por inmunofluorescencia indirecta, que suele ser del 20-30%. 11,12 Precisión y Reproducibilidad Intra ensayo Para evaluar la precisión durante los ensayos del kit QUANTA Lite ANA ELISA, se ensayaron 5 muestras 12 veces cada una en una placa ELISA. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Mean 31 U 51 U 54 U 144 U 172 U SD CV 4 % 7 % 11 % 7 % 4 % Inter ensayo Para evaluar la precisión de un ensayo a otro, se ensayaron 4 muestras positivas y 1 positivo fuerte una vez al día en seis días separados. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Mean 16 U 27 U 31 U 47 U 160 U SD CV 10 % 9 % 7 % 11 % 14 % Referencias 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24: (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44: (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105: (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40: (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17: (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122: (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4: (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25: (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40: (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2: (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42: (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service ESP October 2009 Revision 6 Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: