QUANTA Lite ACA IgG III Para Diagnóstico In Vitro Complejidad CLIA : Alta

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1 QUANTA Lite ACA IgG III Para Diagnóstico In Vitro Complejidad CLIA : Alta Aplicación QUANTA Lite TM ACA IgG III es un ensayo basado en la técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la detección semi cuantitativa de anticuerpos IgG anticardiolipina. Los anticuerpos anticardiolipina se utilizan como ayuda para ayudar en la evaluación del riesgo de trombosis en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) o trastornos de tipo lúpico. Sumario y Explicación de la prueba Los anticuerpos anticardiolipina (ACA) están fuertemente asociados con las trombosis venosas y arteriales. 1 Estos indicios se observaron por primera vez durante los estudios realizados sobre el lupus eritematoso sistémico (LES), una enfermedad que, entre otros síntomas, se caracteriza por las trombosis. De los muchos anticuerpos encontrados en el LES, dos de ellos actuaban contra los fosfolípidos, como la cardiolipina. 2 Procedimiento de trabajo Los pocillos de la microplaca contienen antígeno cardiolipina altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo. Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti cardiolipina al antígeno que los recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. Una vez que se haya detenido la producción enzimática de producto coloreado, se determina la presencia o ausencia de anticuerpos contra la cardiolipina por medio de la comparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración de cinco puntos. Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidades estándar de anticardiolipina IgG (GPL). Reactivos 1. Placa microperforada de poliestireno para ELISA recubierto con antígeno de cardiolipina purificada y con GPI β 2 bovina (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante 2. Control negativo ACA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos humanos anti cardiolipina, prediluido, 1.2 ml 3. Control ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos anti cardiolipina, prediluido, 1.2 ml 4. Calibrador A ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano 5. Calibrador B ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano 6. Calibrador C ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano 7. Calibrador D ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano 8. Calibrador E ACA IgG III ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano 9. Diluyente de Muestra ACA III, 1 frasco de color paja conteniendo tampón con PBS, y conservante, 50 ml 10. Solución de Lavado Concentrada ACA III, 1 frasco de concentrado 20x color rojo conteniendo tampón con Tris, 50ml. Referirse a la Sección Metodología para instrucciones de dilución. 11. Conjugado HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco de color azul conteniendo tampón, estabilizante de proteína y conservante, 10ml 12. Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml 13. Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico M, 1 frasco, incolora, 10 ml Advertencias 1. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer. 2. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles Control ACA IgG III ELISA, Calibradores A,B,C,D E para ACA IgG III ELISA y ACA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso. 3 1

2 3. Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 4. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. 5. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. 6. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. 7. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 8. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. 3. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar lugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado. 4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables. 5. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de técnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles. 6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. 7. El sellado incompleto de la bolsa zip-lock que contenga tiras sin usar y desecante provocará la degradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados. 8. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de un conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para este producto para evitar que esto ocurra. 9. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el laboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos. Condiciones de Almacenaje 1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8 C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. 2. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC. 3. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8 C. Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18-A3 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8 C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20 C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. Procedimiento Materiales Suministrados 1 Microplaca cardiolipina ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte ml control prediluido negativo ACA 1 1.2ml control prediluido Control ACA IgG III ELISA 1 1.2ml control prediluido Calibrador A ACA IgG III ELISA 1 1.2ml control prediluido Calibrador B ACA IgG III ELISA 1 1.2ml control prediluido Calibrador C ACA IgG III ELISA 1 1.2ml control prediluido Calibrador D ACA IgG III ELISA 2

3 1 1.2ml control prediluido Calibrador E ACA IgG III ELISA 1 50ml Diluyente de muestra ACA III 1 50ml Solución III de lavado concentrada 20X 1 10ml Conjugado IgG (cabra) anti IgG humana 1 10ml Cromógeno TMB 1 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M) Material necesario no incluido Micropipetas para 5, 100, y 500µl Puntas desechables para micropipeta Tubos para dilución de muestras, 4ml Agua destilada Recipiente de 1L para la solución de lavado reconstituida Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud de onda) Metodología Antes de empezar 1. IMPORTANTE: Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26 C) y agitar. 2. Diluir la solución de lavado ACA 1:20 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 950 ml de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución de lavado añadiendo 4.0 ml del concentrado a 76ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. 3. Preparar una dilución 1:101 de cada muestra a procesar añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente. Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparación. NO DILUYA los calibradores de A a E de ACA IgG III con, el control de ACA IgG III con ni el control negativo de ACA 1: La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti cardiolipina requiere dos pocillos para cada uno de los calibradores y controles y uno o dos pocillos para cada muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado. 5. Preparación de la curva estándar: para los puntos de A a E de la curva estándar de cinco puntos, use los calibradores de A a E de ACA IgG III con PREDILUIDOS directamente del vial. La curva estándar de cinco puntos tiene los siguientes valores: Punto A Calibrador A de ACA IgG III con prediluido B Calibrador B de ACA IgG III con prediluido 75.0 C Calibrador C de ACA IgG III con prediluido 37.5 D Calibrador D de ACA IgG III con prediluido 18.8 o E Calibrador E de ACA IgG III con prediluido 9.4 o Unidades de fosfolípidos (GPL) Procedimiento de Ensayo 1. TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) ANTES DE EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposición a la humedad. 2. Añada 100µL de los calibradores, las muestras diluidas de los pacientes, el control negativo de ELISA y el control de ACA IgG III ELISA a los pocillos. NOTA: El Control ACA IgG III ELISA y el Control ACA Negativo están ya prediluidos y listos para su uso. El valor y el intervalo aceptable del control ACA IgG III ELISA figura impreso en la etiqueta del vial. Si el Control no se encuentra entre los valores aceptables indicados, repita la prueba. Si, después de repetir el test, el Control no se encuentra dentro del intervalo aceptable, póngase en contacto con el Servicio Técnico de INOVA para que le faciliten más instrucciones. Se recomienda realizar todos los tests por duplicado. 3. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana. El tiempo de incubación empieza después de la adición de la última muestra. 4. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar µl de solución de lavado a todos pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Es importante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras. 5. Agregar 100µl de Conjugado IgG HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones más asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso Lavado: Repetir el paso Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. 3

4 8. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización que la efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos. 9. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia. Control de Calidad 1. Los controles Control ACA IgG III ELISA, Calibrador A ACA IgG III ELISA y Control Negativo ACA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionan correctamente. 2. El usuario debe notar que debido a que los controles Control ACA IgG III ELISA, Calibrador A ACA IgG III ELISA y ACA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución de especímenes. 3. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararse controles válidos haciendo alícuotas de un pool de suero humano que debe almacenarse a < -20 C. 4. Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados a continuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y repetirse. a. La absorbancia del control Calibrador A ACA IgG III ELISA debe ser superior a la del Control ACA IgG III ELISA y la de este debe ser superior a la del control negativo. b. El control Calibrador A ACA IgG III ELISA debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la del control negativo no debe exceder de 0.2. c. La absorbancia del Control ACA IgG III ELISA debe ser superior al doble del control negativo, u oscilar entre d. La concentración del Control ACA IgG III ELISA debe estar dentro del rango especificado en la etiqueta. e. El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical Laboratory Standards) C24-A3 para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio. Cálculo de Resultados 1. Determine el valor medio de todas las lecturas duplicadas. 2. Grafique la absorbancia media de la curva del calibrador en el ensayo de ACA IgG III en función del log (registro de rendimiento) de concentraciones. Utilice un gráfico de curva de línea de mejor ajuste o bien un gráfico log-log. Las unidades GPL asignadas a los calibradores están en el vial del calibrador. 3. Determine la concentración en GPL de ACA desconocida en el eje "X" a partir de la absorbancia correspondiente en el eje "Y". Interpretación de los Resultados La técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes. 1. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anticardiolipina IgG y se puede usar junto con otras pruebas serológicas y hallazgos clínicos para ayudar en la evaluación del riesgo de trombosis en individuos con lupus eritematoso sistémico (LES) o trastornos de tipo lúpico. 2. Los resultados se deben expresar en unidades GPL. En función de una evaluación de 488 muestras normales y de 139 muestras positivas a la cardiolipina IgG, IgM e IgA, se realizó un corte indicado de 15 GPL. Se sugiere que cada laboratorio establezca su propio rango normal. Aun cuando se utilice una curva de calibración, existe variación en los resultados con niveles bajos y es frecuente obtener falsos positivos. 4 Por este motivo, es recomendable que los valores que van de 15 a 20 GPL inclusive, se consideren indeterminados, y que los resultados positivos se asignen a las muestras de pacientes con más de 20 GPL. Harris y Pierangeli proponen otro método semicuantitativo para expresar los resultados. 4 En nuestra opinión, los valores de GPL han de considerarse como positivos de débiles a moderados y los superiores a 80 GPL, como resultados positivos fuertes. 3. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-cardiolipina o niveles inferiores al punto de corte del ensayo. 4. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación Los siguientes resultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite ACA IgG III ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final. 4

5 Limitaciones del Procedimiento 1. En la actualidad, se está investigando la relevancia clínica del ACA en otras enfermedades que no sean LES. 2. En los estudios publicados sobre el LES, la incidencia de un ACA positivo es del 23 al 54% para IgG y del 5 al 40% para IgM. 3. Cuando se encuentran títulos ACA negativos en presencia de indicios clínicos, puede estar indicado un anticoagulante lúpico u otras pruebas adicionales como, por ejemplo, el anti-β 2 GPI. 4. No se puede realizar un diagnóstico tomando como base sólo los resultados de ACA. Éstos se deben interpretar junto con los hallazgos físicos. 5. No se debe iniciar el tratamiento solo por un título positivo de ACA. También debe haber indicaciones clínicas que lo respalden. 6. Un alto porcentaje de pacientes con sífilis activa confirmada o seropositiva tiene niveles altos de ACA. Por lo tanto se deben emprender procedimientos de confirmación a fin de descartar la sífilis. 7. Los ACA pueden aparecer en forma transitoria en diversas infecciones. Los pacientes que dan positivo en ACA deben volver a ser sometidos a la prueba luego de esperar un tiempo adecuado. 8. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del paciente puede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en este ensayo. 9. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero. 10. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. 11. Si no se calienta y mezcla bien el concentrado de PBS para ACA antes de utilizarlo, pueden obtenerse resultados incoherentes. Valores Esperados Rango Normal Se analizaron 488 muestras aleatorias de donantes normales para ACA de tipo IgG III. De este total, tres muestras se encontraban dentro del rango indeterminado de 15 a 20 GPL. Se encontraron también cinco muestras positivas durante la realización de las pruebas normales aleatorias. Se estableció que dichas muestras eran realmente positivas en función de pruebas adicionales realizadas con otros kits comerciales que disponen de la autorización 510 (k). En el 97.6% de las muestras normales se encontraron valores inferiores a 15 GPL. Sensibilidad y Especificidad Relativas Correlación con la segunda generación de ACA tipo IgG de INOVA Diagnostics Se analizaron un total de 627 muestras tanto de ACA de tipo IgG III de segunda generación como de ACA de tipo IgG de tercera generación. Estas muestras incluyen las 488 muestras normales mencionadas en el estudio de rango normal, así como las 139 muestras procedentes de pacientes con resultados indeterminados o positivos en cardiolipina IgG, IgM e IgA. A continuación se muestra un resumen de los resultados. ACA de tipo IgG III de QUANTA Lite (tercera generación) - I Sensibilidad relativa 96.6% ELISA para ACA de tipo IgG I* Especificidad relativa 98.7% segunda generación Eficiencia relativa 97.3% *Indeterminado 5

6 Curva representativa estándar mediante el HCAL de tipo IgG según el criterio de Sapporo A continuación se muestra una curva representativa que utiliza como estándar el anticuerpo monoclonal HCAL según el criterio de Sapporo. Este material procede del laboratorio del Dr. Takao Koike. Se utiliza en el CC de las placas ACA y está disponible en INOVA Diagnostics como artículo independiente, nº de catálogo La curva se preparó mediante la dilución del HCAL al 1:100 en el diluyente de muestra ACA y, a continuación, diluyendo en serie el material en el mismo diluyente. Punto OD Sapporo Unidades µg/ml A HCAL 1: B HCAL 1: C HCAL 1: D HCAL 1: or E HCAL 1: or F HCAL 1: or En la curva de muestra anterior, el punto de corte de 15 GPL correspondería a µg/ml del HCAL. Cada laboratorio necesita determinar su propio rango normal. Precisión y Reproducibilidad La precisión y reproducibilidad entre ensayos fue evaluada analizando dos réplicas de un positivo y negativas en cuatro ensayos separados. La precisión y reproducibilidad durante los ensayos fue evaluada analizando dieciséis réplicas de un fuerte y negativas en un único ensayo. La media unidades, la desviación estándar y el coeficiente de variación de las muestras se resumen a continuación. Positivo Negativo Media GPL DE %CV Media GPL DE %CV Global % % Intra ensayo % % Inter ensayo % % QUANTA Lite y INOVA Diagnostics son marcas comerciales registradas de Derecho de Autor 2011 Todos los derechos reservados 6

7 Referencias 1 Lancet i, , Clinics in Rheumatic Diseases 8, , Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, The VII th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies, October 9-13, 1996, Louisiana State University Medical Center. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ESP April 2014 Revision 20 7