QUANTA Lite Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto. HA dsdna ELISA

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1 QUANTA Lite Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto HA dsdna ELISA Aplicación Este ensayo está pensado para la determinación in vitro de autoanticuerpos de alta avidez específicos contra el ADN de doble cadena (dsdna) presentes en el suero humano, como una ayuda al diagnóstico del Lupus eritematoso sistémico (LES), junto con los resultados de otras pruebas clínicas. Se suministra material suficiente para analizar 40 muestras en duplicado (o bien 88 muestras sin duplicado), con una curva de calibración, control positivo y negativo y de cadena simple de ADN. Sumario y Explicación de la prueba El uso de anticuerpos anti-dsdna como marcadores diagnósticos del LES y la consecuente monitorización de la actividad de la enfermedad ha sido de gran beneficio para los profesionales de laboratorio clínico 1 desde que se reconoció por primera vez en Ceppelini et al en y fue confirmado en 1982 en los criterios revisados del American College of Rheumatology para la clasificación del LES 3. Hoy en día hay tres métodos de análisis de uso común que se diferencian según la avidez de los anticuerpos dsdna detectada 4 : El análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), del que hay muchas variantes, detecta generalmente un amplio espectro de avidez de anticuerpos. El análisis por inmunofluorescencia Crithidia luciliae (IFA) detecta los anticuerpos unidos a aquellos de más baja avidez y los radioinmunoensayos Farr (RIA) 5 determinan generalmente sólo aquellos anticuerpos de alta avidez mediante el paso de precipitación de sulfato de amonio que impide la baja avidez de anticuerpos. 8 El análisis HA dsdna incorpora un conjunto de condiciones analíticas más estrictas, que tienen como objetivo eliminar los anticuerpos débilmente unidos. Algunos estudios 6,7 han demostrado que la avidez de anticuerpos está relacionada con la progresión de la enfermedad. La selección de un análisis u otro facilita la diferenciación entre pacientes con una forma benigna de LES y pacientes con problemas renales y dermatológicos, especialmente en casos de lupus de riñón 8,9. Por lo general hay concordancia entre todos los análisis que usan suero de pacientes con lupus eritematosos sistémicos (LES) definidos, sin embargo hay una discrepancia significativa entre pacientes con la enfermedad inactiva, o que no cumplen los parámetros estándard de clasificación para LES. Procedimiento de trabajo Los pocillos de la placa están tapizados con antígeno (ADN de doble cadena de timo de ternera). Los calibradores, controles y muestras del paciente diluidas se añaden a los pocillos, los autoanticuerpos presentes que reconozcan el antígeno (ADN de doble cadena) se unirán durante la primera incubación. Después de lavar los pocillos para eliminar las proteínas no unidas, se añade un anticuerpo de cabra contra IgGs humanas marcado con peroxidasa purificada. El conjugado se unirá a los anticuerpos capturados en la placa y el conjugado que está en exceso y no se ha unido se eliminará con los siguientes pasos de lavado. El conjugado unido se visualizará con sustrato 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (TMB) que da lugar a un producto de reacción de color azul, la intensidad de éste es proporcional a la concentración de autoanticuerpos en la muestra. Se añade ácido Sulfúrico a cada pocillo para parar la reacción. La adición del ácido da lugar a un color amarillo final que se leerá a 450nm. Reactivos 1. Placa microperforada de poliestireno para ELISA tapizados con el antígeno (ADN de doble cadena de timo de ternera). (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante 2. Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos humanos ADN de doble cadena (dsdna), prediluido, 1.2 ml 3. Control ELISA HA dsdna Calibrador A, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 4. Control ELISA HA dsdna Calibrador B, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 5. Control ELISA HA dsdna Calibrador C, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 6. Control ELISA HA dsdna Calibrador D, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 7. Control ELISA HA dsdna Calibrador E, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 8. Control ELISA HA dsdna Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con 9. Diluyente de Muestra Tipo III, 2 frascos color amarillo conteniendo tampón Tween 20 y conservante, 50 ml 10. Solución de Lavado Concentrada HA dsdna (10x), 2 frascos de concentrado 10x color descolorido conteniendo tampón con Tris y Tween 20, 50ml. Referirse a la Sección Metodología para instrucciones de dilución. 11. Control cadena simple ADN doble cadena, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos ssdna, 1.2 ml 12. Conjugado HA dsdna IgG, con anti-igg humana 1 frasco - color azul conteniendo tampón, estabilizante de proteína y conservante, 10ml 13. Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml 14. Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico M, 1 frasco, incolora, 10 ml 1

2 Advertencias 1. Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el diluyente de, controles y conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer. La lavado y diluyente de muestra conteniendo Proclin 150. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. 2. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles Control HA dsdna Positivo, Calibradores A a E y ELISA negativo Control a cadena simple ADN doble cadena deben manejarse como si fueran material 12 potencialmente contagioso. 3. Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 4. Conjugado HA dsdna IgG contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. 5. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. 6. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. 7. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 8. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. Este producto sólo debe ser utilizado por personal adecuadamente preparado. 3. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. Cualquier variación sobre el protocolo puede afectar a los resultados. Prestad especial atención a las Notas específicas y a todas las advertencias presentes en estas Instrucciones de Uso. 4. No se pueden intercambiar reactivos de distintos lotes y/o kits. Si se deben realizar muchos tests, prestad atención a que todos los reactivos sean del mismo lote. Todas las tiras de pocillos deben provenir de una misma bolsa. La substitución de alguno de los componentes del kit puede dar lugar a resultados incorrectos. 5. Para evitar que se contaminen los reactivos se debe usar siempre material plástico o de cristal nuevo o limpio. No se debe retornar el reactivo no utilizado a la botella original. 6. Nunca se deben dejar las botellas destapadas, cualquier evaporación o contaminación puede dar lugar a resultados incorrectos. 7. El sustrato TMB no puede estar expuesto a la luz ni al agua. 8. Los sueros que muestren contaminación bacteriana, que sean lipémicos o hemolizados o bien que contengan partículas deberán ser descartados. 9. Se recomienda usar pipetas calibradas y controles de calidad internos. 10. El uso de sistemas automáticos de ensayo, dilutores de muestras y otros equipos automáticos puede dar lugar a diferencias cuando se comparan resultados con el método manual. Es responsabilidad del laboratorio validar completamente el sistema utilizado y asegurarse de que los resultados estén dentro de los límites que se han definido en este protocolo y en el certificado de Control de Calidad lo acompaña. 11. Todo el equipamiento se debe calibrar y mantener siguiendo las instrucciones del fabricante. Condiciones de Almacenaje 1. El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de conservación no adecuadas afectarán a los resultados. 2. El tampón de lavado diluido puede conservarse a 2-8ºC para 1 semana. 3. La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior. Recolección de Muestras 1. Las muestras de sangre se han de obtener por venopunción, dejar que coagule de modo natural y separar el suero. 2. El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 7 horas antes del ensayo 10, o para periodos superiores, ha de alicuotarse y conservarse a -20ºC. 3. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. 4. Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede ocasionar resultados falsos positivos. Procedimiento Materiales Suministrados Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo. Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote. Pocillos sensibilizados con ADN de cadena doble: 12 tiras de 8 pocillos separables, sensibilizados con con el antígeno (ADN de doble cadena de timo de ternera). La placa se suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas de desecante. Diluyente de muestra Tipo III: 2 botellas con 50mL de tampón para dilución de la muestra. Listo para uso. Coloreado de amarillo. 2

3 Solución de lavado concentrada HA dsdna (10x): 2 botellas con 50mL de tampón concentrado 10 x para el lavado de los pocillos. Calibradores de HA dsdna (ADN de doble cadena): 5 viales, cada uno con 1.2 ml de suero humano diluido, con las siguientes concentraciones de autoanticuerpo anti-dsdna: 1000, 333, 111, 37, 12.3 IU/mL. Listo para uso. Control positivo HA dsdna (ADN de doble cadena): 1 vial con 1,2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso. Control negativo ELISA: 1 vial con 1.2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso. Control cadena simple ADN doble cadena: 1 vial con 1.2mL de suero humano diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso. Conjugado HA dsdna IgG: 1 vial con 10mL de anticuerpo purificado contra IgG humana marcado con peroxidasa Color azul. Listo para uso. Cromógeno TMB: 1 botella con 10mL de cromógeno TMB. Listo para uso. Solución de Parada HRP: 1 vial con 10mL Acido Sulfúrico. Listo para uso. Material necesario no incluido Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las placas pueden lavarse manualmente. Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en referencia al aire. Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible. Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL. Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de conjugado, solución sustrato y solución de parada. Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra. Metodología Antes de empezar 1. Lleve el kit a temperatura ambiente Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24 C). Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente. NOTA: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una semana. 2. Componentes del kit Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso. 3. Dilución del tampón de lavado Añada del tampón de lavado concentrado a 900mL de agua destilada (dilución 1 a 10) en un recipiente limpio y mezcle. NOTA: El tampón de lavado diluido puede conservarse hasta 1 semana a 2-8ºC, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. Si el tampón muestra signos de contaminación microbiana o se vuelve turbio, elimínelo y prepare solución fresca. 4. Dilución de la muestra Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:101) y mezcle bien. NOTA: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas siguientes a la dilución. 5. Manipulación de tira y marco Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los bordes largos del marco para evitar que los pocillos caigan fuera. NOTA: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para minimizar su exposición a la humedad. Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo. ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a contaminación por polvo u otro material particulado provocará la degradación del antígeno, dando como resultado una precisión pobre del método y potencialmente resultados falsos. Procedimiento de Ensayo 1. Dispensación de la muestra Dispensar 100µL de cada calibrador, controles del ensayo y muestra diluida (1:101) en los pocillos de la placa. Nota: Las muestras se deben dispensar rápidamente a la placa para disminuir el tiempo de procesado de la placa y también la diferencia de tiempo entre la dispensación de la primera y la última muestra.incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 2. Lavados El procedimiento de lavados es un punto crítico y requiere una atención especial. Un mal lavado de la placa puede dar lugar a resultados poco precisos, con una baja precisión y mucho fondo. Después de la incubación, lavar los pocillos 3 veces con µL cada pocillo con tampón de lavados. La placa se puede lavar de forma automática o manual. Después del lavado automático invertir la placa sobre un papel de filtro y dar unos golpecitos sobre los pocillos para permitir que se sequen. En los lavadores automáticos no se debe programar ningún paso en el que se deje la placa en remojo. Las placas se pueden lavar manualmente de la siguiente forma: a. Eliminar el contenido de la placa en un fregadero. b. Dejar secar la placa invertida en un papel absorbente. c. Llenar cada pocillo con µL de tampón de lavados usando una pipeta multicanal. d. Agitar la placa sobre una superficie plana. e. Repetir a-d dos veces. f. Repetir a y b. No dejar el tampón de lavados en los pocillos más tiempo que el necesario para llenar toda la placa. 3

4 3. Dispensación del conjugado Dispense 100µL del conjugado en cada pocillo, secar la parte superior de los pocillos con un pañuelo para eliminar cualquier posible salpicadura. Nota: Para evitar contaminaciones no devolver nunca el conjugado no utilizado a la botella de reactivo.incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavado Repetir el paso Dispensación del sustrato (TMB) Dispensar 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, secar la parte superior de los pocillos con un pañuelo para eliminar cualquier posible salpicadura. Nota: Para evitar contaminaciones no devolver nunca el TMB no utilizado a la botella de reactivo. Incubar a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 minutos. 6. Parada de la reacción Dispensar 100µL de la solución de parada a cada pocillo. Esto provoca un cambio de color pasando del azul al amarillo. 7. Determinación de la densidad óptica Leer la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450nm en un lector de microplacas, durante los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Control de Calidad 1. Control de calidad Para que un ensayo se considere válido, debe cumplir los siguientes criterios: Calibradores, control positivo y negativo y el control de cadena simple de ADN siempre se deben incluir cada vez que se realiza un ensayo. Los valores obtenidos con los controles deben estar dentro del rango descrito en el Certificado de Control de Calidad. La forma de la curva debe ser similar a la curva que se incluye en el Certificado de Control de Calidad. Si no se cumplen estos criterios, el ensayo no se puede considerar válido y el test se debe repetir. 2. Calcular la media de las densidades ópticas (Sólo para ensayos que se realicen por duplicado) Para cada calibrador, control y muestra, calcular la media de las DO de los duplicados de las lecturas. El porcentaje del coeficiente de variación (%CV) para cada duplicado de DO debe ser inferior al 15%. 3. Dibujar la curva de calibración La curva de calibración se debe dibujar de forma automática o manual como sigue: dibujar la concentración de anticuerpos contra ADN de doble cadena en la escala logarítmica y la DO en la escala lineal para cada uno de los calibradores. Automática usar un Software validado y dibujar la curva que mejor represente a los datos. Manual usando un papel de gráfica semi-logarítmico, dibujar una curva entre los puntos (no una recta o punto a punto). 4. Tratamiento de los puntos anómalos Si alguno de los puntos está muy alejado de la curva, éste se puede eliminar. Si la eliminación de este punto, hace variar mucho la curva y ésta no se asemeja en forma a la curva de calibración o bien hay más de un punto anómalo, se deberá repetir el ensayo. 5. Cálculos de los niveles de autoanticuerpos y muestras diluidas. Leer el nivel de los anticuerpos anti ADN de doble cadena a partir de la curva de calibración. Los valores de los controles deben estar dentro del rango definido en el Certificado de Control de Calidad. Nota: Los valores de los calibradores se deben ajustar por un factor 100 para compensar la dilución 1:101 de la dilución de la muestra. No se necesitan más correcciones. 6. Calibración del ensayo El ensayo está calibrado en IU/mL contra un calibrador de referencia OMS (Wo80) 6. Limitaciones del Procedimiento 1. Este análisis, dada su habilidad para detectar únicamente los anticuerpos anti-dsdna de alta avidez, puede no funcionar en algunas formas de LES en las que el paciente sólo presenta anticuerpos de baja avidez. Puede no ser adecuado para aplicaciones en las que se precisa la determinación total de anticuerpos anti-dsdn. 2. Este kit debe ser usado tan solo como una ayuda al diagnóstico. Un resultado positivo sugiere la presencia de determinadas enfermedades, pero debe ser confirmado por los síntomas clínicos y otros tests serológicos. 3. Los resultados obtenidos con este ensayo no son una prueba diagnóstica de la presencia o ausencia de enfermedad. Valores Esperados Los siguientes rangos se han establecido en base a los resultados obtenidos con FARRZYME del análisis de muestras de donantes de sangre sanos (n=150) y de pacientes con LES (n = 224): INTERPRETACION 30 IU/mL Resultado negativo > 30 IU/mL Resultado positivo Todas las 150 muestras de suero de donantes normales dieron resultados por debajo de 17.0 IU/mL, con 146 (97%) de los resultados por debajo de 12.3 IU/mL que es el límite inferior de medición del kit. El 22.8% de los sueros de pacientes de LES dieron resultados positivos con FARRZYME (>30 IU/mL). Los resultados mostrados a continuación proceden de un estudio comparativo entre las mismas 224 muestras de LES del FARRZYME y un análisis convencional EIA anti-dsdna, que determina los anticuerpos dsdna de alta y baja avidez. Las muestras que dieron resultados borderline en el análisis dsdna convencional fueron tratadas como negativas al calcular el porcentaje de concordancia y concordancia global positiva y negativa. 4

5 ELISA Anti-dsDNA Convencional Positivo Borderline Negativo FARRZYME Positivo Negativo Porcentaje de concordancia positiva = 58.8% Porcentaje de concordancia negativa = 97.2% Concordancia global = 83.5% La incidencia de anticuerpos anti-dsdna de alta avidez detectados por FARRZYME y por Farr RIA en 100 pacientes de LES resultó ser de 36% y 38%, respectivamente 8. En cambio, en 100 pacientes con enfermedades varias del tejido conectivo y otras enfermedades autoinmunes, la incidencia fue del 4% y 5% respectivamente para los dos análisis. Los valores unitarios obtenidos con el análisis FARRZYME pueden no ser acordes a los obtenidos con otros análisis que dan resultados en IU/mL, ya que FARRZYME sólo determina el subconjunto de anticuerpos antidsdna de alta avidez. Los rangos proporcionados son sólo una pauta. Los análisis ELISA son muy sensibles y capaces de detectar pequeñas diferencias entre distintas poblaciones de muestras. Se recomienda que cada laboratorio determine su propio rango normal, en base a la población, las técnicas y los equipos empleados. Características de funcionamiento 1. RANGO DE MEDICIÓN El rango de medición del análisis es IU/mL. 2. CONFIRMACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DEL ANÁLISIS La confirmación de que el análisis FARRZYME puede distinguir entre dos muestras con valores cercanos al final del rango de medición (120 y 165% del calibrador inferior) se obtuvo por análisis estadístico (el t- test de Student) de los resultados obtenidos al analizar múltiples réplicas de cada muestra. 3. ESPECIFICIDAD, CONCORDANCIA 189 muestras procedentes de pacientes con LES, junto con 35 muestras positivas en anticuerpos dsdna por Crithidia o ELISA y 28 muestras normales sanas, fueron analizadas con FARRZYME, con el análisis por inmunofluorescencia Crithidia luciliae y también con un ELISA dsdna convencional. Crithidia IFA + - FARRZYME Porcentaje de concordancia positiva 67.3% Porcentaje de concordancia negativa 92.9% Concordancia global 87.3% EIA FARRZYME demostró buena concordancia negativa con el análisis por inmunofluorescencia Crithidia luciliae. El porcentaje de concordancia positiva se redujo porque se sabe que este último análisis es conocido por detectar anticuerpos anti-dna de baja avidez 11, a diferencia del análisis FARRZYME. FARRZYME ELISA dsdna Convencional + Border-line * Porcentaje de concordancia positiva 58.8% Porcentaje de concordancia negativa 97.7% Concordancia global 85.3% *Para el cálculo de la concordancia entre ambos análisis, se clasificaron como negativas las muestras en la región borderline del análisis dsdna convencional. El ELISA convencional detecta anticuerpos tanto de alta como de baja avidez, dando como resultado una concordancia positiva reducida con el análisis FARRZYME. 4. SUSTANCIAS INTERFERENTES Se analizaron varios tipos de suero para determinar el posible efecto de sustancias interferentes mediante el kit plus Interference Check A (Kokusai, Japón). Sustancia Bilirrubina F (libre) Bilirrubina C (conjugada) Hemoglobina hemolizada Quilo Factor reumatoide Concentración 20.3mg/dL 20.2mg/dL 486mg/dL 1460 Units 45 IU/mL No se observaron interferencias con bilirrubina libre ni conjugada, hemoglobina, lípidos ni factor reumatoide. En un estudio aparte se analizaron 6 IgG de suero con mieloma mediante FARRZYME y ninguna dio resultado positivo. 5

6 5. PRECISIÓN La precisión intra- e inter-ensayo se determinó mediante seis muestras que cubrían el rango de la curva de calibración. El valor medio y el % C.V. para cada muestra son los de la tabla inferior: La precisión intra- ensayo se determinó mediante 20 réplicas. PRECISIÓN INTRA-ENSAYO n = 20 Concentración (IU/mL) % C.V. Muestra Muestra Muestra Muestra Muestra Muestra La precisión inter- ensayo se determinó mediante 6 análisis realizados por duplicado durante 3 días. PRECISIÓN INTER-ENSAYO n = 6 Concentración (IU/mL) % C.V. Muestra Muestra Muestra Muestra Muestra 5 272,4 7.0 Muestra Esquema de la placa A B C D E F G H Resumen del procedimiento 1. Añadir 100µL de cada calibrador, control y muestras diluidas 1:101 a los pocillos apropiados. Incubar 30 minutos. Lavar. 2. Añadir 100µL del conjugado a cada pocillo. Incubar 30 minutos. Lavar. 3. Añadir 100µL de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 minutos. 4. Añadir 100µL de solución de parada a cada pocillo. Medir la absorbancia a 450nm. QUANTA Lite y INOVA Diagnostics son marcas registradas. Copyright 2012 Todos los derechos reservados 6

7 Referencias 1. Isenberg D and Smeenk R. Clinical laboratory assays for measuring anti-dsdna antibodies. Where are we now? Lupus, 2002; 11: Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96: Tan et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1982; 25: Riboldi P et al. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005; 38: Werle E et al. The clinical significance of measuring different ant-dsdna antibodies by using the Farr assay, an enzyme immunoassay and a crithidia luciliae immunofluorescence test. Lupus, 1992; 1: Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus, 2004; 13: Nossent H C and Rekvig O P. Is closer linkage between systemic lupus erythematosus and anti-doublestranded DNA antibodies a desirable and attainable goal? Artheritis Res Ther, 2005; 7(2): Jaekel HP et al. Anti-dsDNA antibody subtypes and anti-c1q antibodies: toward a more reliable diagnosis and monitoring of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Lupus, 2006; 15: Renaudineau Y et al. Association of α-actinin-binding anti-dsdna antibody Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in press) 10. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L. Measurement of low avidity anti-dsdna by the Crithidia luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol, 1982; 49: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ESP August 2012 Revision 3 7