% de anti- C1q en enf. renal activa (n.º pac.)

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1 QUANTA Lite TM Anti-C1q ELISA Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos. Para uso diagnóstico in vitro. Complejidad CLIA: Alta. Uso previsto El QUANTA Lite TM Anti-C1q es un análisis inmunoenzimático por adsorción (ELISA) para la detección semicuantitativa de anticuerpos anti-c1q en suero humano. La presencia de anticuerpos anti-c1q en pacientes con lupus eritematoso sistémico puede combinarse con resultados clínicos y otros análisis de laboratorio para ayudar en la detección de personas con riesgo de desarrollar glomerulonefritis. Resumen y explicación de la prueba Se han detectado anticuerpos contra un fragmento del primer componente del complemento, C1q, en varias enfermedades autoinmunes distintas. 1, 2 Durante los últimos veintiún años, numerosos estudios diferentes han demostrado que en las personas con lupus eritematoso sistémico (LES) los autoanticuerpos anti-c1q están asociados a la presencia de glomerulonefritis activa Estos autoanticuerpos pueden aumentar durante una erupción activa de LES. 3-9 Se ha encontrado C1q en las lesiones renales de los pacientes con LES afectados de glomerulonefritis, 11 y se sabe que los anticuerpos anti-c1q contribuyen a la glomerulonefritis en modelos de nefritis lúpica en ratones. 12 En conjunto, dichos estudios muestran que la presencia de autoanticuerpos anti-c1q aumenta el riesgo de que un paciente con LES desarrolle glomerulonefritis activa, probablemente porque los anticuerpos anti-c1q son patógenos cuando el paciente presenta también inmunocomplejos en circulación. Tabla 1. Correlación de anti-c1q con la nefritis lúpica activa N.º ref. N.º de pac. con LES Correlación con enf. renal activa Mejor que anti- DNA % de anti- C1q en enf. renal activa (n.º pac.) % de anti-c1q en enf. renal inactiva o sin enf. renal (n.º pac.) Correlación con SLEDAI o ECLAM Las medidas en serie presentan cambios p < 0,0003 Sí 44% (139) 18% (101) N.D. Sí p = 0,017 N.D. 50% (22) 23% (107) p = 0,006 Sí p = 0,0001 Sí 74% (77) 32% (74) N.S.** Sí 6 43 p < 0,005 Sí 82% (17) 31% (26) N.D. Sí 7 61 p < 0,0001 Sí 87% (23) 8% (38) p < 0,0001 Sí 8 68 p < 0,01 Sí 71% (21) 30% (47) p < 0,01 Sí p < 0,0001 N.D. 95% (38) 35% (62) N.D. Sí En 58 p = 0,054 Sí 44% (16) 26% (42) p = 0,005 Sí prep.^ Total % (353) 25% (625) * N.D. = No realizado. ** N.S. = No significativo. ^ Estudio que usa el ELISA QUANTA Lite Anti-C1q; el original está en preparación para el segundo estudio. Principios del procedimiento El antígeno C1q purificado se une a los pocillos de una placa microperforada de poliestireno en unas condiciones que conservan el antígeno en su estado reactivo. Los autoanticuerpos contra la región colágena del C1q están correlacionados con la presencia de enfermedad activa en pacientes con LES. Para reducir la unión del inmunocomplejo a otras partes del C1q, se utiliza un alto contenido en sal en el diluyente de la muestra. Los controles prediluidos y los sueros de paciente diluidos se añaden a pocillos diferentes para permitir que cualquier anticuerpo anti-c1q presente se una al antígeno inmovilizado. La muestra no unida se elimina mediante lavado y, a continuación, se añade a cada pocillo un conjugado de anti-igg humana marcado con enzima. Una segunda incubación permite que el conjugado de anti-igg humana marcado con enzima se una a los anticuerpos del paciente fijados a los pocillos. Tras lavar todo el conjugado de anti-igg humana marcado con enzima que no se ha unido, se determina la actividad enzimática final añadiendo un sustrato cromogénico y midiendo la intensidad del color que se desarrolla. El análisis puede evaluarse mediante espectrofotometría midiendo la intensidad del color que se desarrolla en los pocillos del paciente y comparándola con el color de los pocillos de control. Reactivos 1. Placa microperforada de poliestireno para ELISA recubierta con antígeno anti-c1q purificado (12 tiras de 1 x 8 pocillos), con soporte, suministrada en un envase de aluminio que contiene desecantes. 2. Control negativo para ELISA: 1 vial de tampón que contiene conservante y suero humano sin anticuerpos humanos anti-c1q; prediluido; 1,2 ml 3. Positivo bajo para ELISA Anti-C1q: 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano anti-c1q; prediluido; 1,2 ml 4. Positivo alto para ELISA Anti-C1q: 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano anti-c1q; prediluido; 1,2 ml 1

2 5. Diluyente de muestras para anti-c1q: 1 vial de color rosa que contiene solución salina tamponada con Tris, Tween 20, estabilizantes de proteínas y conservante; 50 ml 6. Concentrado de lavado HRP: 1 vial de concentrado 40x, de color rojo, que contiene solución salina tamponada con Tris y Tween 20; 25 ml. Consulte en la sección Métodos las instrucciones de dilución 7. Conjugado IgG HRP con anti-igg humana (de cabra): 1 vial de color azul que contiene tampón, estabilizantes de proteínas y conservante; 10 ml 8. Cromógeno TMB: 1 vial que contiene estabilizantes; 10 ml 9. Solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M): 1 vial incoloro de 10 ml Advertencias 1. ADVERTENCIA: Este producto contiene una sustancia química (cloranfenicol al 0,02%) en el diluyente de muestras, en los controles y en el conjugado que está clasificada como cancerígena por el Estado de California. 2. Todo el material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto ha sido analizado y ha producido un resultado negativo con respecto a la presencia del VIH, el HBsAg y el VHC, según métodos aprobados por la FDA. Sin embargo, ningún método de análisis puede ofrecer plenas garantías de la ausencia del VIH, el VHB, el VHC u otros agentes infecciosos. Por tanto, el positivo bajo para el ELISA Anti-C1q, el positivo alto para el ELISA Anti-C1q y el control negativo para ELISA deben manipularse de la misma manera que si se tratara de material potencialmente infeccioso Se utiliza azida de sodio como conservante. La azida de sodio es una sustancia venenosa y puede resultar tóxica si se ingiere o si se absorbe a través de la piel o los ojos. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías y formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si utiliza las pilas de lavado para eliminar reactivos, aclare con abundante cantidad de agua para evitar la formación de azidas metálicas. 4. El conjugado HRP contiene una sustancia química corrosiva/venenosa diluida que puede resultar tóxica si se ingiere en grandes cantidades. Para prevenir posibles quemaduras químicas, evite el contacto con la piel y los ojos. 5. El cromógeno TMB contiene un irritante que puede ser nocivo si es inhalado, ingerido o absorbido a través de la piel. Para prevenir daños, evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos. 6. La solución de parada HRP consiste en una solución de ácido sulfúrico diluida. Evite exponerla a bases, metales u otros compuestos que puedan reaccionar con los ácidos. El ácido sulfúrico es una sustancia venenosa y corrosiva que puede resultar tóxica si es ingerida. Para prevenir quemaduras químicas, evite el contacto con la piel y los ojos. 7. Utilice un equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con los reactivos suministrados. 8. Los vertidos de reactivos deben limpiarse inmediatamente. Cumpla todas las normas estatales y locales sobre protección del medio ambiente para la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto está destinado a uso diagnóstico in vitro. 2. La sustitución de los componentes suministrados con este kit de análisis por otros diferentes puede dar lugar a resultados incoherentes. 3. Un lavado incompleto o ineficaz y una insuficiente eliminación del líquido de las tiras de pocillos del ELISA tendrán como consecuencia una baja precisión y/o valores de fondo elevados. 4. La adaptación total o parcial de este análisis para utilizarlo con procesadores automáticos de muestras y otros dispositivos de manipulación de líquidos puede producir diferencias en los resultados del análisis con respecto a los resultados obtenidos siguiendo el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio comprobar que el procedimiento automático empleado produce unos resultados que se encuentran dentro de los límites aceptables. 5. Existen varios factores que influyen en el rendimiento del análisis: la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la precisión y reproducibilidad de la técnica de pipeteado, la exhaustividad del lavado y de la eliminación de líquido de los pocillos de las tiras del ELISA, el fotómetro utilizado para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el análisis. Es necesario mantener la máxima coherencia durante el análisis para obtener resultados precisos y reproducibles. 6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo indicado. 7. Si la bolsa de cierre hermético que contiene las tiras de pocillos y los desecantes no se vuelve a cerrar correctamente, el antígeno se deteriorará y la precisión obtenida será baja. 8. Es posible que se midan absorbancias inaceptablemente bajas después de dos o más usos de una misma botella de conjugado HRP durante un periodo de tiempo determinado. Para evitarlo, es importante seguir todos los procedimientos recomendados para la manipulación del conjugado HRP. 9. Puede producirse contaminación química del conjugado HRP como consecuencia de un lavado o aclarado inadecuados de los materiales e instrumentos. Los residuos de sustancias químicas habituales en los laboratorios, como formalina, lejía, etanol o detergente, provocan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Aclare a fondo todos los materiales e instrumentos después del uso de limpiadores o desinfectantes químicos. 2

3 Condiciones de almacenamiento 1. Almacene todos los reactivos del kit a 2-8 C. No los congele. Los reactivos permanecen estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan y manipulan como está indicado. 2. Las tiras de pocillos recubiertas de antígeno que no se utilicen deben volverse a cerrar herméticamente en la bolsa de aluminio que contiene desecantes y deben almacenarse a 2-8 C. 3. El tampón de lavado diluido permanece estable durante una semana a 2-8 C. Recogida de muestras Este procedimiento debe realizarse con una muestra de suero. La adición de azida u otros conservantes a las muestras del análisis puede afectar de manera negativa a los resultados. No deben utilizarse muestras que estén contaminadas con microorganismos, que hayan recibido un tratamiento a base de calor o que contengan partículas visibles. Tampoco deben emplearse sueros o muestras muy hemolizados o lipémicos. Tras la recogida, el suero debe separarse del coágulo. El documento H18-A3 del CLSI recomienda las siguientes condiciones de almacenamiento de muestras: 1) No guarde las muestras a temperatura ambiente por más de 8 horas. 2) Si el análisis no se efectúa en un plazo de 8 horas, refrigere las muestras a 2-8 C. 3) Si el análisis no va a realizarse en un plazo de 48 horas o si debe preparar las muestras para enviarlas, congélelas a una temperatura de 20 C o inferior. Las muestras congeladas deben mezclarse bien después de descongelarse y antes del análisis. Procedimiento Materiales suministrados 1 Placa microperforada para el ELISA Anti-C1q (12 tiras de 1x8 pocillos), con soporte 1 1,2 ml de control negativo prediluido para ELISA 1 1,2 ml de positivo bajo prediluido para el ELISA Anti-C1q 1 1,2 ml de positivo alto prediluido para el ELISA Anti-C1q 1 50 ml de diluyente de muestras para anti-c1q 1 25 ml de concentrado de lavado HRP, con una concentración de 40x 1 10 ml de conjugado IgG HRP con anti-igg humana (de cabra) 1 10 ml de cromógeno TMB 1 10 ml de solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M) Materiales adicionales necesarios no suministrados Micropipetas para dispensar 5, 100, y 500 µl Puntas de micropipeta desechables Tubos de análisis para diluir las muestras de los pacientes, de 4 ml de volumen Agua destilada o desionizada Recipiente de 1 L para diluir el concentrado de lavado HRP Lector de placas microperforadas que mida la DO a 450 nm (o a 620 nm para las lecturas de doble longitud de onda) Método Antes de comenzar 1. Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20-26 o C) y mézclelos bien. 2. Diluya el concentrado de lavado HRP a 1:40 añadiendo el contenido de la botella de concentrado de lavado HRP a 975 ml de agua destilada o desionizada. Si el análisis no va a emplear toda la placa, puede preparar una cantidad menor añadiendo 2,0 ml del concentrado a 78 ml de agua destilada o desionizada por cada 16 pocillos que se utilicen. El tampón diluido permanece estable durante una semana a 2-8 o C. 3. Prepare una dilución al 1:101 para cada muestra de paciente añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente de muestras para anti-c1q. Las muestras diluidas deben utilizarse en un plazo de 8 horas una vez preparadas. NO DILUYA el positivo bajo para el ELISA Anti-C1q, el positivo alto para el ELISA Anti-C1q ni el control negativo para ELISA. 4. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti-c1q mediante el uso de unidades arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada muestra de paciente. Se recomienda analizar las muestras por duplicado. Procedimiento del ensayo 1. TODOS LOS REACTIVOS DEBEN LLEVARSE A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) ANTES DE PROCEDER AL ANÁLISIS. Coloque el número necesario de pocillos o tiras en el soporte. Devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa con desecantes y ciérrela herméticamente para minimizar la exposición al vapor de agua. 2. Añada a los pocillos 100 µl de positivo bajo prediluido para el ELISA Anti-C1q, 100 µl de positivo alto prediluido para el ELISA Anti-C1q y 100 µl de control negativo prediluido para ELISA y añádales también las muestras de los pacientes diluidas. Cubra los pocillos e incúbelos durante 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie horizontal. El tiempo de incubación empieza a contar a partir de la adición de la última muestra. 3

4 3. Fase de lavado: aspire completamente el contenido de todos los pocillos. Añada µl de tampón de lavado HRP diluido a los pocillos y, a continuación, aspírelos. Repita esta secuencia dos veces más hasta completar tres lavados. Invierta la placa y golpéela ligeramente contra un material absorbente para eliminar cualquier resto de líquido del último lavado. Es importante que vacíe completamente todos los pocillos después de cada fase de lavado. Para realizar la aspiración, mantenga la misma secuencia que utilizó en la adición de muestras. 4. Añada 100 µl del conjugado IgG HRP a cada pocillo. El conjugado debe extraerse de la botella aplicando condiciones de asepsia estándar y siguiendo buenas prácticas de laboratorio. Extraiga de la botella únicamente la cantidad de conjugado necesaria para el análisis. PARA EVITAR UNA POSIBLE CONTAMINACIÓN MICROBIANA O QUÍMICA, NO DEVUELVA NUNCA A LA BOTELLA EL CONJUGADO QUE NO UTILICE. Incube los pocillos durante 30 minutos, como en el paso Fase de lavado: Repita el paso Añada 100 µl de cromógeno TMB a cada pocillo e incube en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. 7. Añada 100 µl de solución de parada HRP a cada pocillo. Para añadir la solución de parada HRP, mantenga la misma secuencia y la misma temporización que utilizó para el cromógeno TMB. Golpee suavemente la placa con un dedo para mezclar completamente los pocillos. 8. Lea la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm en el plazo máximo de una hora tras detener la reacción. Si desea realizar mediciones bicromáticas, puede utilizar 620 nm como longitud de onda de referencia. Control de calidad 1. El positivo bajo para el ELISA Anti-C1q, el positivo alto para el ELISA Anti-C1q y el control negativo para ELISA deben analizarse con cada lote de muestras para garantizar que todos los reactivos y procedimientos actúen correctamente. 2. Recuerde que el positivo bajo para el ELISA Anti-C1q, el positivo alto para el ELISA Anti-C1q y el control negativo para ELISA son prediluidos, por lo que no tienen en cuenta los métodos de procedimiento asociados con la dilución de las muestras. 3. Pueden analizarse controles adicionales de acuerdo con las pautas o condiciones establecidas por las regulaciones estatales o locales o por los organismos de homologación. Pueden prepararse sueros de control adecuados adicionales obteniendo muestras alícuotas de suero humano combinado y almacenándolas a una temperatura de 20 o C o inferior. 4. Para considerar válidos los resultados del análisis, deben cumplirse todos los criterios indicados a continuación. Si alguno de ellos no se cumple, el análisis deberá considerarse no válido y deberá repetirse. a. La absorbancia del positivo alto prediluido para el ELISA Anti-C1q debe ser mayor que la del positivo bajo prediluido para el ELISA Anti-C1q, que a su vez debe ser superior a la del control negativo prediluido para ELISA. b. El positivo alto prediluido para el ELISA Anti-C1q debe presentar una absorbancia superior a 1,0, mientras que la absorbancia del control negativo prediluido para ELISA no puede ser superior a 0,2. c. La absorbancia del positivo bajo prediluido para el ELISA Anti-C1q debe ser más de dos veces superior a la del control negativo para ELISA o bien mayor que 0,25 pero no superior a 0,6. d. El control negativo para ELISA y el positivo alto para el ELISA Anti-C1q tienen como objetivo la detección de un posible fallo importante de los reactivos. El positivo alto para el ELISA Anti-C1q no garantiza precisión alguna en el punto de corte del análisis. e. Consulte el documento C24-A3 del CLSI para obtener directrices adicionales sobre las prácticas de control de calidad adecuadas. Cálculo de los resultados En primer lugar se determina la DO media para cada grupo de duplicados. A continuación se calcula la reactividad de cada muestra dividiendo la DO media de la muestra por la DO media del positivo bajo para el ELISA Anti-C1q. El resultado se multiplica por el número de unidades asignadas al positivo bajo para el ELISA Anti-C1q que indica la etiqueta. DO de la muestra Valor de la muestra = x Positivo bajo para el ELISA Anti-C1q (unidades) DO del positivo bajo para el ELISA Anti-C1q (unidades) La reactividad está relacionada con la cantidad de anticuerpo presente de un modo no lineal. Aunque los aumentos y disminuciones de la concentración de anticuerpos en el paciente se reflejarán en un correspondiente aumento o disminución de la reactividad, la variación no es proporcional (es decir, si la concentración de anticuerpo se duplica, la reactividad no se multiplica por dos). Si se necesita cuantificar con más precisión la concentración de anticuerpo en el paciente, deben analizarse diluciones en serie de la muestra del paciente y la última dilución que presente un resultado positivo en el análisis debe considerarse la titulación de anticuerpo del paciente. 4

5 Interpretación de los resultados El análisis ELISA es muy sensible a la técnica empleada y es capaz de detectar incluso pequeñas diferencias en las poblaciones de pacientes. Los valores indicados a continuación son meramente valores recomendados. Cada laboratorio debe determinar su propio rango normal basándose en las técnicas, los controles, los materiales y la población de pacientes que utilice, según los procedimientos específicos que establezca. Así pues, tal como se indica en la tabla siguiente, la muestra puede clasificarse en cuatro categorías: negativo, positivo bajo, positivo moderado y positivo fuerte. Unidades Negativo < 20 Positivo bajo Positivo moderado Positivo fuerte > Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-c1q y sugiere un riesgo elevado de nefritis lúpica en pacientes con LES. 2. Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpo anti-c1q o un nivel de dicho anticuerpo que se encuentra por debajo del punto de corte negativo del análisis. Limitaciones del procedimiento 1. La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulina en la muestra del paciente no producirá falsos positivos en este análisis gracias al uso de un diluyente de muestras especial con un alto contenido en sal No todos los pacientes con LES afectados de nefritis lúpica son positivos para anti-c1q. 3. Los resultados de este análisis deben utilizarse junto con resultados clínicos y otros análisis serológicos. 4. Las características de rendimiento de este análisis no se han establecido para sustratos distintos del suero. Valores esperados La capacidad del QUANTA Lite Anti-C1q ELISA para detectar anticuerpos anti-c1q en pacientes con LES se ha evaluado mediante la realización de dos estudios con pacientes afectados de LES identificado clínicamente. En la tabla siguiente puede consultar la comparación de resultados de la bibliografía y del QUANTA Lite Anti-C1q ELISA. Sensibilidad y especificidad clínicas LES N = 139 Total Sensibilidad y especificidad ELISA GN+ GN- Anti-C1q Positivo Sensibilidad = 50% Negativo Especificidad = 70% Total En este análisis, la presencia de glomerulonefritis (GN+) se considera el estado de enfermedad y la ausencia de glomerulonefritis (GN-) se considera el estado negativo con respecto a la enfermedad. Rango normal Para contribuir a determinar el intervalo de referencia, se analizaron mediante el ELISA Anti-C1q un total de 184 muestras procedentes de donantes de sangre seleccionados aleatoriamente. Se detectaron 15 muestras positivas para anti-c1q, lo que equivale a una especificidad del 91,8%. Controles para enfermedades reumáticas e infecciosas Mediante el ELISA Anti-C1q se analizaron 71 muestras de pacientes diagnosticados de enfermedades reumáticas concretas y 76 muestras que presentaban anticuerpos contra organismos causantes de enfermedades infecciosas. Así, se detectaron 28 muestras con escleroderma, 16 con síndrome de Sjögren y 27 con AR y, por otro lado, 52 con el VHC, 8 con el VHS, 8 con el CMV, 3 con toxoplasmosis y 5 con el virus de la rubéola. Además, resultaron positivas para anti-c1q las siguientes muestras: 1 con el síndrome de Sjögren, 1 con AR, 1 con escleroderma, 2 con el VHC, 2 con el CMV, 1 con el VHS y 1 con toxoplasmosis, lo que equivale a una especificidad del 93,9% en este grupo. Comparación de métodos Se analizaron mediante el QUANTA Lite Anti-C1q ELISA y también con el anti-dsdna muestras de donantes de sangre normales, los controles para enfermedades reumáticas e infecciosas indicados anteriormente y 58 pacientes con LES. En la tabla siguiente se resumen los resultados. 5

6 Porcentaje de concordancia positiva y negativa con respecto al ELISA anti-dsdna Todos los ELISA IgG dsdna Total % de concordancia pacientes Positivo Negativo N = 389 ELISA Anti-C1q Positivo % de conc. pos. = 37% Negativo % de conc. neg. = 96% Total % de conc. total = 90% Reactividad cruzada Para determinar la posible reactividad cruzada del antígeno C1q con otros autoanticuerpos, el QUANTA Lite Anti-C1q ELISA se evaluó mediante 16 muestras que presentaban niveles elevados de otros autoanticuerpos. Este grupo incluyó dos muestras en cada análisis que reaccionaron con los antígenos SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P y DNA. Todas las muestras fueron negativas para anti-c1q. Precisión y reproducibilidad El rendimiento intraensayo del QUANTA Lite TM Anti-C1q ELISA se evaluó analizando 9 muestras nueve o diez veces cada una en 3 lotes de kits. Los resultados representativos se indican a continuación. C1q 1 C1q 2 C1q 3 N 209 C1q 4 C1q 5 Lis 22 Media 93 U 39 U 25 U 9 U 18 U 29 U 77 U DE 2,01 1,37 21,05 1,09 1,59 0,94 1,67 CV 2% 3% 4% 12% 9% 3% 2% El rendimiento interensayo del QUANTA Lite Anti-C1q ELISA se evaluó analizando 12 muestras en seis ocasiones distintas a lo largo de un intervalo de 8 días. Estos análisis se efectuaron con tres lotes de placas del ELISA Anti-C1q y los resultados representativos se indican a continuación. C1q 1 C1q 2 C1q 5 C1q 6 N 207 Lis 14 Lis 22 Media 94 U 43 U 33 U 27 U 7 U 71 U 61 U DE 4,09 3,40 2,32 3,35 0,52 2,47 6,51 CV 4% 8% 7% 13% 8% 3% 11% 6

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