NOVA Lite TM ANA Plus Mouse Kidney & Stomach Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto
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- Laura Aguilera Alarcón
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1 NOVA Lite TM ANA Plus Mouse Kidney & Stomach Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto Aplicación NOVA Lite TM ANA Plus es un ensayo por inmunofluorescencia indirecta para el screening y la determinación semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA), antimitocondria (AMA), anti músculo liso (ASMA) y anticuerpos parietales gástricos (GPA) en suero humano. La presencia de anticuerpos antinucleares puede ser utilizada en conjunción con otros tests serológicos y resultados clínicos para ayudar en el diagnóstico de Lupus Eritematoso Sistémico (LES) y otras enfermedades reumáticas o del tejido conectivo. Sumario y Explicación de la prueba El término anticuerpos antinucleares describe una variedad de autoanticuerpos que reacciona con los constituyentes de los núcleos celulares incluyendo el ADN, ARN y varias proteínas y ribonucleoproteínas. 1 Estos autoanticuerpos aparecen con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades reumáticas o del tejido conectivo, y especialmente en el caso del lupus eritematoso sistémico. De hecho, prácticamente todos los pacientes con LES son ANA positivos. Esta sensibilidad diagnóstica ha conducido a la incorporación del ensayo ANA en los Criterios Revisados para la Clasificación de Lupus Eritematoso Sistémico de 1982 realizados por una subcomisión del Colegio Americano de Reumatología. 2 Aunque los ensayos ANA son un excelente test de screening para el LES (un resultado negativo prácticamente permite descartar la presencia de LES 3 activo), no son, de ningún modo, un ensayo específico. Los pacientes con otras enfermedades del tejido conectivo, como la artritis reumatoide, el escleroderma y la dermatomiositis, dan con frecuencia resultados positivos, y también pueden observarse valoraciones de ANA bajas en otros estados patológicos y en la población normal. 4 Pueden obtenerse resultados positivos para ANA en pacientes que han sufrido quemaduras graves o infecciones víricas y también se han dado casos en algunas personas normales sanas, especialmente en las poblaciones de mayor edad. Debido a esta ausencia de especificidad, se recomienda que todas las muestras con resultados positivos para ANA se valoren según el punto final y que se lleven a cabo ensayos más específicos para autoanticuerpos anti-adn de doble cadena (dsdna) y para autoanticuerpos anti-antígeno nuclear extraíble (ENA). 1-3 Se suelen detectar altos niveles de AMA asociados a la cirrosis biliar primaria. Se pueden detectar bajas valoraciones de AMA en otros trastornos hepáticos como la hepatitis crónica activa y la cirrosis criptogénica. 5,6 Se encuentran niveles elevados de ASMA en el suero de un 70% de los pacientes con hepatitis crónica activa. Además, el 50% de estos pacientes son ANA positivos, mientras que un 25% presentan valoraciones de AMA bajas. Pueden observarse valoraciones de ASMA bajas en infecciones víricas, tumores malignos e individuos normales. 5,7 Los anticuerpos antiparietales gástricos se dan en un 90% de las muestras de suero de pacientes con anemia perniciosa. Junto con otros datos clínicos y de laboratorio, un resultado GPA positivo ayuda a distinguir la anemia perniciosa autoinmune de otras anemias megaloblásticas. Aunque se detecta en menos del 2% de la población normal menor de 20 años, la incidencia de los anticuerpos antiparietales gástricos aumenta en las mujeres mayores de 40 años y puede estar presente en hasta un 16% de la población normal de más de 60 años. 8,9 La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para los tests de ANA, AMA, ASMA y GPA. Los substratos más comunes son secciones finas de órganos de roedor o algunos tipos de líneas celulares. El substrato seleccionado para el kit NOVA Lite TM ANA Plus consiste en secciones de riñón y estómago de ratón. El conjugado consiste en anticuerpos anti-igg humana purificada por afinidad. Procedimiento de trabajo En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con un substrato de antígenos y posteriormente se lavan para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado. El substrato se incuba con un conjugado específico marcado con fluoresceína y posteriormente se lava para eliminar el reactivo que no se ha enlazado. Cuando se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos mostrarán una fluorescencia de color verde manzana en las áreas de la célula o del núcleo donde se ha enlazado el autoanticuerpo. Reactivos 1. Portaobjetos ANA Plus (Riñón/estómago de ratón), 8 pocillos/portaobjetos con desecante 2. Conjugado de anticuerpos anti-igg humana (Cabra) marcados con fluoresceína en tampón con Azul de Evans y un 0.09% de azida sódica, 15mL 3. Patrón Homogéneo ANA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y suero humano con anticuerpos antinucleares, prediluido, 0.5mL 4. Control Negativo para Sistemas IFA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y sin anticuerpos de suero humano anti-ana Plus, prediluido, 0.5mL 5. Concentrado de PBS (40x), suficiente para 2000 ml 6. Medio de fijación, 0.09% de azida sódica, 7mL 7. Cubreobjetos 1
2 Advertencias 1. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los Control de Patrón Homogéneo ANA y Control Negativo para Sistemas IFA deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. 3. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. 4. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos. Precauciones 1. Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. 2. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. 3. Un lavado incompleto o ineficiente de los pocillos puede dar lugar a un fondo elevado. 4. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros aparatos de manipulación de líquidos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados de la prueba respecto a los obtenidos con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio el validar que su procedimiento automático produzca resultados dentro de unos límites aceptables. 5. Una gran variedad de factores puede afectar al rendimiento del ensayo. Entre estos factores pueden incluirse la temperatura de los reactivos al inicio del proceso, la potencia de la lámpara del microscopio, la fiabilidad y reproducibilidad de la técnica de pipeteo usada, las condiciones de lavado y la duración de los tiempos de incubación. Se requiere trabajar de una manera consistente para obtener resultados precisos y reproducibles. 6. El Conjugado anti Humano IgG puede experimentar cambios de color con el tiempo debido a la exposición a la luz, estos cambios, sin embargo, no afectan a su rendimiento. 7. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. Condiciones de Almacenaje 1. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8 C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. 2. La solución de lavado diluida es estable 4 semana a 2-8 C. Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18- A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8 C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20 C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. Procedimiento Materiales Suministrados 20 8-pocillos Portaobjetos ANA Plus 1 15mL Conjugado de anticuerpos anti-igg 1 0.5mL Control de Patrón Homogéneo ANA 1 0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA 2 25mL Concentrado de PBS (40x) 1 7mL Medio de Montaje 1 20 Cubreobjetos Material necesario no incluido Micropipetas con capacidad para pipetear de 15 a 1000μL Agua destilada o desionizada Frascos lavadores o pipetas Pasteur Cámara húmeda Recipiente de 1L de capacidad (para diluir PBS) Cubeta de Coplin Microscopio de fluorescencia con una emisión de fluorescencia de 495nm y un filtro de barrera de 515nm 2
3 Metodología Antes de empezar 1. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20 26 C) y agitar. 2. Diluya el concentrado de PBS: IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 añadiendo el contenido de la botella de concentrado de PBS a 975mL de agua destilada o desionizada y mezcle completamente. El tampón de PBS se utiliza para diluir las muestras de pacientes y como tampón de lavado. El tampón diluido puede almacenarse un máximo de 4 semanas a una temperatura de 2-8 C. 3. Diluya las Muestras de los Pacientes: a. Screening Inicial: Diluya las muestras de los pacientes a 1:20 con un tampón de PBS diluido (esto es, añada 50μL de suero a 950μL del tampón de PBS). b. Titulación: Realice series de diluciones dobles a partir de la dilución inicial de screening para todas las muestras positivas con el tampón de PBS diluido (p. ej. 1:40, 1:80,... 1:5120). Procedimiento de Ensayo 1. Preparación de los portaobjetos con substrato: Espere a que el portaobjetos con substrato alcance la temperatura ambiente antes de extraerlo de su funda. Etiquételo y colóquelo en una cámara húmeda adecuada. Añada 1 gota (70 90µL) de control positivo y negativo sin diluir en los pocillos 1 y 2 respectivamente. Añada 1 gota (70 90µL) de la muestra del paciente diluida a los pocillos restantes. 2. Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante minutos en una cámara húmeda (una servilleta de papel humedecida colocada plana en el fondo de un recipiente cerrado de plástico o cristal le permitirá mantener las condiciones de humedad adecuadas). No permita que el substrato se seque durante el procedimiento de ensayo. 3. Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice un frasco de lavado o una pipeta para lavar suavemente el suero con el tampón de PBS diluido. Oriente el portaobjetos y el chorro del tampón PBS de forma que le permita evitar, en la medida de lo posible, que la solución pase por encima de varios pocillos a la vez. Evite dirigir el chorro directamente sobre los pocillos para que no se dañe el substrato. Si está deseado, ponga los portaobjetos en un tarro de Coplin del almacenador intermediario diluido de PBS por hasta 5 minutos. 4. Adición de conjugado fluorescente: Expulse el exceso de tampón PBS. Sitúe el portaobjetos de nuevo en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros minutos. 5. Lavado de los portaobjetos: Repita el paso Cubreobjetos: Los procedimientos para los cubreobjetos varían de un laboratorio a otro; sin embargo, recomendamos el siguiente procedimiento: a. Sitúe un cubreobjetos en una toallita de papel. b. Aplique el medio de montaje siguiendo una línea continua en el borde inferior del cubreobjetos. c. Elimine el exceso de tampón PBS y ponga en contacto del borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de forma que el medio de montaje fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni se queden atrapadas. Control de Calidad El Control de Patrón Homogéneo ANA y el Control Negativo para Sistemas IFA deberían ensayarse para cada portaobjetos con el fin de asegurar que todos los reactivos y los procedimientos se han llevado a cabo de la forma adecuada. Los controles adicionales de suero adecuados deberán prepararse alicuotando las mezclas de suero humano y almacenándolo a < -70 o C. Para que los resultados se consideren válidos, deben cumplirse todos y cada uno de los siguientes criterios. Si alguno de ellos no se cumple, el resultado del test se considerará inválido y el ensayo deberá repetirse. 1. El Control de Patrón Homogéneo ANA sin diluir debe ser > El Control Negativo para Sistemas IFA debe ser negativo. Interpretación de los Resultados Reacción Negativa. Se considerará una muestra como negativa si la tinción específica es igual o inferior al Control Negativo para Sistemas IFA. Las muestras pueden mostrar diversos grados de tinción de fondo debido a los anticuerpos heterófilos o a niveles inferiores de autoanticuerpos contra algunos constituyentes del citoplasma, como las proteínas contráctiles. Reacción Positiva. Tinción específica de los núcleos celulares. Se puede observar toda una serie de patrones de tinción dependiendo de la especificidad de los anticuerpos. Determine el patrón de tinción de cada muestra y pondere su intensidad de acuerdo con los siguientes criterios: 4+ Fluorescencia verde manzana brillante 3+ Fluorescencia verde manzana claro 2+ Fluorescencia positiva claramente visible 1+ La menor fluorescencia específica que permite diferenciar claramente una nuclear y/o citoplasmática estructura celular de la fluorescencia de fondo 3
4 Interpretación de los patrones. Pueden presentarse diversos patrones de tinción nuclear y/o citoplasmática dependiendo de los tipos y de las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Pueden presentarse los siguientes patrones de tinción: Homogéneo: Tinción sólida del núcleo con o sin enmascaramiento aparente de los nucleolos. Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Periférico: Tinción sólida, primordialmente alrededor de la región más exterior del núcleo y tinción más débil hacia la parte central del núcleo. Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, DNP, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Moteado: Tinción fina o de apariencia granulosa del núcleo, generalmente sin tinción fluorescente de los nucleolos. Antígenos Nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B y otros sistemas antígeno/anticuerpo todavía sin caracterizar. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES (anticuerpo anti- Sm), enfermedades combinadas del tejido conectivo (anticuerpo anti-rnp), escleroderma (anticuerpo anti-scl-70), o el complejo síndrome de Sjogren-sicca (anticuerpo anti-ss-b); las valoraciones inferiores sugieren otras enfermedades del tejido conectivo. Nucleolar: Tinción con motas grandes y gruesas en el núcleo, generalmente un número inferior a 6 por célula, con o sin motas finas ocasionales. Antígenos Nucleares presentes: 4-6S ARN y otros antígenos nucleares desconocidos. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas son frecuentes en el escleroderma y el síndrome Sjogren. Mitocondrial (AMA): Una tinción granular discreta de los túbolos renales distales y/o proximales. Las células parietales metabólicamente activas del estómago contienen elevadas concentraciones de mitocondrias y pueden presentar también tinciones positivas. Antígenos presentes: Varios tipos de antígenos mitocondriales. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas indican cirrosis biliar primaria. Músculo liso (ASMA): Se considera específica de los ASMA una tinción discreta de las capas musculares internas de los vasos sanguíneos del riñón y/o las capas musculares del estómago. Antígenos presentes: Actina Enfermedad asociada: Las valoraciones altas son indicadoras de la hepatitis crónica activa de tipo autoinmune. Anticuerpos anticélula parietal gástrica (GPA): Tinción del citoplasma de la célula parietal. Estas células se encuentran en la mucosa gástrica del estómago. Puesto que los AMA también tiñen las células parietales, deben comprobarse también los túbulos renales antes de concluir la presencia de GPA. Si la muestra es GPA positiva, los túbulos renales serán negativos. Antígenos presentes: Bomba de protones (h/k ATPasa) Enfermedad asociada: Estos anticuerpos se encuentran en los casos de anemia perniciosa y gastritis atrófica. Es importante que el usuario sepa hasta qué punto puede confiar en los patrones para determinar la especificidad de los autoanticuerpos, excepto en el caso del patrón nuclear y el patrón centromérico, en los que cada uno de los antígenos está muy bien definido y sus patrones son característicos. Ya que muchos autoanticuerpos, o combinaciones de los mismos, pueden inducir un patrón moteado u homogéneo, se recomienda la realización de ensayos de seguimiento de los autoanticuerpos (tales como para el ADN de doble cadena o ENA) en todas las muestras moteadas u homogéneas. Limitaciones del Procedimiento 1. Las valoraciones elevadas de ANA sugieren enfermedades del tejido conectivo pero no deberían tener una validez diagnóstica. Los resultados de ANA deberían considerarse en combinación con otros resultados serológicos así como con el historial clínico del paciente. 2. Los patrones de ANA cambian frecuentemente cuando la muestra se valora según el punto final. Este fenómeno se debe a que los anticuerpos con menor valoración están por debajo de la sensibilidad del sistema, puesto que se ensaya con una muestra más diluida. 3. Varios factores externos influyen en la sensibilidad del ensayo, como pueden ser el tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y antigüedad de la lámpara, los aumentos utilizados, el sistema de filtros y la subjetividad del técnico. 4. Si se utiliza un filtro paso banda en lugar de un filtro de barrera 515, puede observarse un aumento de la tinción de los artefactos. 5. Para etiquetar los portaobjetos utilice solamente un lápiz. La utilización de cualquier otro instrumento de escritura puede ocasionar una tinción de los artefactos. 6. Todas las cubetas de Coplin que se utilicen en el lavado de los portaobjetos deben estar limpias de residuos de tintura. La utilización de cubetas de Coplin con residuos de tintura puede provocar la tinción de los artefactos. 7. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. 8. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero. 4
5 Valores Esperados Se ensayó una serie de muestras de pacientes con enfermedades del tejido conectivo, pacientes con enfermedades hepáticas autoinmunes, pacientes con anemia perniciosa, así como 200 muestras aleatorias de donantes de sangre, utilizando el kit NOVA Lite TM ANA Plus. Los resultados se muestran a continuación: Número de positivos* con NOVA Lite TM ANA Plus Grupo de pacientes Número ANA AMA ASMA GPA LES Lupus inducido por la medicación Artritis reumatoide Hepatitis crónica activa Cirrosis biliar primaria Anemia perniciosa Normales * La cantidad total de positivos puede superar la cantidad de pruebas realizadas debido a la presencia de patrones múltiples en un solo pocillo. Referencias 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ, Myers LL: Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiol Scand. 84: , Peter JB, Dawkins RL: Evaluating autoimmune diseases. Diagnostic Medicine: 68-76, September-October, Doniach D, Roitt IM, Walker JG, Sherlock S: Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clinical Experimental Immunology 1: , Toh BH: Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clinical Experimental Immunology 38: , Cavallaro JJ, Palmen DF, Bigazzi PE: Immunofluorescent detection of Autoimmune Diseases, Immunology Series No. 7. Center for Disease Control, Atlanta GA, Loveridge N, Bitensky L, Chayen J, Hausamen TU, Fisher JM, Taylor KB, Gardner JD, Bottazzo GF, Doniach D: Inhibition of parietal cell function by human gammaglobulin containing gastric parietal cell antibodies. Clinical and Experimental Immunology 41: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ESP June 2009 Revision 14 5
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