Proteinase 3-Ab ELISA
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- Francisco Alvarado Morales
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1 Instrucciones de Uso Proteinase 3-Ab ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra la proteinasa 3 (PR3) en suero humano. RE x8 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra la proteinasa 3 (PR3) en suero humano. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS Los anticuerpos anti citoplasma de neutrófilos (ANCA), identificados originalmente mediante un análisis de inmunofluorescencia (IFA), están dirigidos contra los componentes citoplasmáticos de los neutrófilos, los granulocitos y los monocitos. Se ha demostrado que son marcadores serológicos útiles de varias vasculitis sistémicas de origen autoinmunitario. Un patrón de tinción citoplasmática granular (c-anca) del sustrato de neutrófilos es un indicador de autoanticuerpos contra la proteinasa 3 (PR3), una serina proteinasa de 29 kda presente en los gránulos azurófilos de los granulocitos y los monocitos humanos. Los anticuerpos anti PR3 aparecen en pacientes con granulomatosis de Wegener (GW), una vasculitis sistémica que afecta a las vías respiratorias. Su especificidad es de aproximadamente el 95%, su sensibilidad depende de la fase, y de la actividad de la enfermedad. La cuantificación de estos anticuerpos refleja la evolución de la GW y proporciona una herramienta de control de la eficacia del tratamiento. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio del sandwich. Los pocillos están recubiertos con un antígeno. Los anticuerpos específicos de la muestra que se unen a los pocillos recubiertos con el antígeno son detectados por un conjugado enzimático del segundo anticuerpo (E-Ab) específico para el antígeno humano IgG. La intensidad del color desarrollado por la reacción del sustrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 9. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C, en bolsa con desecante. V2014_10 1 / 6
3 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Estabilidad: 3 dias > 3 dias Evite congelar y descongelar repetidamente. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP Placa de Microtitulación Tiras separables. Revestido con PR3 altamente purificada de granulocitos humanos. Conjugado Enzimático IgG 1 x 14 ml ENZCONJ IgG Listo para usar, coloreado en rojo. Contenido: IgG anti humano, conjugado con peroxidasa, solución buffer proteica, conservantes. Estándar A F 1 x 6 x 2 ml CAL A F 0; 3.0; 8.0; 18; 45; 100 U/mL. Listo para usar, gradualmente coloreado en azul. Contenido: anticuerpos IgG contra PR3, STT y conservantes. 1 x 2 ml CONTROL + Control Positivo Listo para usar, coloreado en rojo. Contenido: anticuerpos IgG contra PR3, STT y conservantes. 1 x 2 ml CONTROL - Control Negativo Listo para usar, coloreado en verde. Contenido: STT y conservantes. 1 x 100 ml SAMPLEDIL Diluyente de Muestras Listo para usar, coloreado en naranja. Contenido: STT y conservantes. 1 x 14 ml TMB SUBS 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 14 ml STOP Solución de Substrato TMB Listo para usar, sin color. Contenido: TMB, peróxido de hidrógeno. Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x) Coloreado en azul. Contenido: STT y conservantes. Solución de Parada TMB Listo para usar, sin color. 0.2 M H 2SO MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o aparatos similares, < 3 % CV). Volumenes: 5; 100; 500 µl 2. Cilindros calibrados 3. Tubos (1 ml) para la dilución de muestras. 4. Micropipeta de 8 canales con depósito para reactivos 5. Botella para la solución de lavado, sistema de lavado de placas de microtitulación automático o semiautomático 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas de pipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. V2014_10 2 / 6
4 4. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 5. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 6. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 7. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de Componentes Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Almacenamiento Estabilidad 100 ml WASHBUF CONC ad 1000 ml agua bidest 1: C 4 sem Dilución de Muestras Muestra para ser diluído con Relación Notas Suero generalmente SAMPLEDIL 1:101 p.e. 5 µl µl Las muestras cuyas concentraciones son mayores a la del mayor estándar deben ser diluidas. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Lavar la fase sólida una vez, inmediatamente antes de su uso: rellenar los pocillos con 300 μl Solución Buffer de Lavado cada una, humedecer durante unos 10 segundos en los pocillos y retirar. 2. Pipetee 100 µl de cada Estándar, control y muestra diluída en cada pocillo respectivo de la Placa de Microtitulación. La fiabilidad del análisis puede mejorarse realizando determinaciones dobles. 3. Incube 30 min a temperatura ambiente (18-25 C). 4. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 μl de Solución de Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 5. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. 6. Incube 30 min a temperatura ambiente (18-25 C). 7. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 μl de Solución Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 8. Para la adición del substrato y solución de parada utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de substrato y solución de parada debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen. 9. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 10. Incube 30 min a temperatura ambiente (18-25 C) (Evite la exposición directa a la luz del sol). 11. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µl de Solución de Parada TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 12. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 30 min de haber agregado la Solución de Parada. V2014_10 3 / 6
5 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Todos los estándares/controles del juego de reactivos deben encontrarse en los rangos de aceptación indicados en el Certificado de Control de Calidad. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Los datos obtenidos se evalúan cuantitativamente mediante una curva estándar usando un programa de evaluación ELISA convencional tal y como se muestra en el ejemplo que aparece a continuación. Se obtiene un buen ajuste con una función de 4 parámetros o una aproximación spline. Además, de forma alternativa, se puede dibujar manualmente la curva estándar en un papel cuadriculado semilogarítmico. La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. Al momento de leer los resultados en el gráfico, tome en cuenta la dilución inicial. Los resultados de muestras diluídas con un factor mayor al inicial, deben ser multiplicados por el factor correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar U/mL DO Media A B C D E F mod 450 nm U PR3-Ab / ml Además, la prueba puede evaluarse de una forma cualitativa. Esto requiere únicamente la medición del Control Positivo. Sin embargo, se recomienda medir y examinar el Control Negativo (consulte: control de calidad). En la evaluación cualitativa de la prueba, la absorbancia (DO) de las muestras se compara con la DO límite (= punto de corte). La DO límite se determina según la siguiente fórmula: DO límite = DO control positivo x factor El factor depende del lote del kit y viene indicado en el Certificado de control de calidad específico del lote que se incluye con cada kit de prueba. Ejemplo: DO control positivo = factor = 0.35 DO límite = x 0.35 = V2014_10 4 / 6
6 Para hacerse una idea del grado de reactividad de una muestra, se puede calcular el ratio, según la siguiente fórmula: Ejemplo: ratio = DO muestra / DO límite DO control positivo = DO muestra = ratio = / = INTERPRETACION DE RESULTADOS Interpretación Evaluación cuantitativa U/mL Evaluación cualitativa Ratio Negativo < 6.7 < 0.86 Punto de corte Equívoco Positivo > 9.6 > 1.16 Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. 15. VALORES ESPERADOS En una toma de muestras de suero de 160 donantes de sangre, distribuidos por igual por sexo y edad, se determinó la siguiente distribución del analito: Medio: Medio + 2 DS: Mediana: Percentil 95 %: 1.2 U/mL 3.0 U/mL 1.0 U/mL 2.3 U/mL 16. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. La azida y el timerosal en concentraciones >0.1% interfieren en este ensayo y pueden conducir a falsos resultados. 17. PRUEBAS FUNCIONALES Sensibilidad Analítica Límite de detección (3 x DS de Solución Buffer de Muestra) < 1 U/mL (n = 24) Especificidad Analítica Específico para IgG humano contra PR3 Variabilidad Intra-Ensayo (n = 24) Variabilidad Inter-Ensayo (n = 72) Medio (U/mL) % CV Medio (U/mL) % CV Precisión Variabilidad entre usuarios (n = 12) Variabilidad entre 2 lotes (n = 6) Medio (U/mL) % CV Medio (U/mL) % CV Linearidad Intervalo (U/mL) = Dilución en Seria hasta = 1:128 n = 3 V2014_10 5 / 6
7 18. AUTOMATIZACIÓN Manualmente versus Dynex DS2 100 Dynex DS2 (U/mL) y = 1,073 x r = 0, manual operation (U/mL) Variabilidad: Usando la muestra del mismo lote del kit, la variabilidad de los resultados del ensayo se compararon entre el sistema ELISA manual y el automático Dynex DS2. procedimiento manual Dynex DS2 Variabilidad Intra-Ensayo (n = 16) CV Medio = 2.2 % CV Medio = 1.8 % Variabilidad Inter-ensayo (n = 48) CV Medio = 2.4 % CV Medio = 1.9 % 19. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Van der Woude, F. J., et al.: Autoantibodies to neutrophils and monocytes: a new tool for diagnosis and a marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet 2 (1985), Falk, R. J., Jenette, J. C.: Wegener s granulomatosis, systemic vasculitis, and antineutrophil cytoplasmic autoantibodies. Annu Rev Med 42 (1991), Gross, W. L., et al.: Immunodiagnostic and immunopathogenic significance of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Dtsch Med Wochenschr 118 (1993), Lüdemann, J., et al.: Anti-neutrophil cytoplasm antibodies in Wegener s granulomatosis recognize an elastinolytic enzyme. J Exp Med 171 (1990), Gross, W. L., et al.: Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for proteinase 3. In: Peter, J. B., Shoenfeld, Y. (eds.): Autoantibodies (1996), 61-67, Elsevier, Amsterdam 6. Radice, A., et al.: Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for proteinase 3. In: Shoenfeld, Y., et al. (eds.): Autoantibodies (2007), , Elsevier, Amsterdam 7. Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der Gliadin-Antikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 104/4 (1992), V2014_10 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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