17beta-Estradiol Luminescence Immunoassay

Transcripción

1 Instrucciones de Uso 17beta-Estradiol Luminescence Immunoassay Ensayo de luminiscencia de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de 17beta-estradiol en saliva humana. RE62041 / RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Ensayo de luminiscencia de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de 17beta-estradiol en saliva humana. Las mediciones obtenidas con este método pueden ser utilizadas para el diagnóstico y tratamiento de varios desordenes hormonales sexuales y para la evaluación del funcionamiento de los ovarios. Este ensayo no esta determinado para la evaluación de la función de la placenta en casos de embarazos complicados. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS 17β-Estradiol [1, 3, 5 (10) -estratrieno-3, 17β-diol; E2] es una hormona esteroide C18 y el más importante de los estrógenos naturales. Se presenta en mujeres y hombres. En las mujeres, el estrógeno estimula el crecimiento de los órganos sexuales y el desarrollo de las características sexuales secundarias, también afecta la secreción de gonadotropina. En los hombres, el rol del 17β-Estradiol se encuentra menos definido pero parece estar envuelto en la regulación de la secreción de gonadotropina. En mujeres no embarazadas, 17β-Estradiol se produce casi exclusivamente en el ovario. Especialmente después de producirse la menopausia, los estrógenos se producen también en el hígado, el cerebro, los músculos y tejido adiposo. La medición seriada de 17β-Estradiol durante el ciclo ovulatorio es de gran ayuda para la evaluación de la función de los ovarios, en particular para la caracterización del crecimiento folicular y para el monitoreo del incremento exponencial de 17β-Estradiol durante ciclos espontáneos o estimulados para la inducción de la ovulación o superovulación antes de una fertilización in vitro. Más aun, la medición de 17β-Estradiol es importante para la determinación de escasez de estrógenos, la cual puede expresarse a través de un retraso en la pubertad, amenorrhoea primaria y secundara o durante la menopausia. Ensayos hormonales adicionales son requeridos para un diagnóstico diferencial. La concentración de gonadotropina debe ser medida para encontrar la causa de la escasez de estrógenos (síntesis o regulación). La determinación de 17β-Estradiol es de gran ayuda para la determinación de pubertas praecox en niñas. En lo que concierne a los hombres, el nivel de 17β-Estradiol puede ser usado para el diagnóstico diferencial de ginecomastia. Estando principalmente unido a la globulina de unión de hormonas sexuales (SHBG) y a la albúmina del suero, solamente 1-3% del estradiol circulante en el plasma esta presente en forma libre. Solamente esta pequeña porción forma parte de la regulación endocrinal. La hormona libre es secretada en cantidades iguales en saliva. Debido a que los niveles de fluctuación de 17β-Estradiol dependen de situaciones individuales, es recomendable la obtención de un perfil homonal mediante el muestreo de muestras salivares. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo de luminiscencia está basado en el principio de competencia. Una cantidad desconocida de antígeno y una cantidad fija de antígeno marcado enzimáticamente compiten por los sitios de unión de los anticuerpos que recubren los pocillos. Luego de la incubación y para detener la reacción de competencia los pocillos son lavados. Después de adicionar la solución del sustrato de luminiscencia, la intensidad de luminiscencia medida es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Los resultados se pueden determinar directamente usando una curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. Version / 7

3 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. Una vez abierto el estuche, la placa de microtitración es estable hasta 6 semanas en su envase roto, pero herméticamente sellado, si se almacena a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de Parafilm. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge por 10 min a x g para remover el material particulado. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien. (Color rojizo que indique contaminación sanguínea) Almacenamiento: 37 C C 2-8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad: 1 semana > 2 semanas > 4 semanas 6 meses 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad RE62041 Cantidad RE62049 Símbolo 1 x 12x8 10 x 12x8 MTP 1 x 0.15 ml 1 x 1.5 ml ENZCONJ CONC 1 x 9 ml 1 x 90 ml ANTISERUM 1 x 10 ml 1 x 100 ml ASSAYBUF 7 x 1.0 ml 7 x 3.5 ml CAL A-G 2 x 1.0 ml 2 x 3.5 ml CONTROL x 9 ml 1 x 90 ml LUMINREAG AP Componente Placa de Microtitulación Revestido con anticuerpos de burro anti-oveja. Conjugado Enzimático Concentrado (101x) Contenido: fosfatasa conjugada alcalina, NaN 3. Estradiol Antisuero Coloreado en rojo. Listo para usar. Contenido: anti-17β-estradiol anticuerpos (oveja), NaN 3 Buffer de Ensayo Coloreado en rojo. Listo para usar. Contenido: Solución Buffer Tris, BSA, NaN 3. Estándar A-G 0.0; 0.9; 2.0; 4.0; 8.0; 16; 64 pg/ml Listo para usar. Contenido: 17β-Estradiol, Solución buffer, ProClin 300 Control 1+2 Listo para usar. Contenido: 17β-Estradiol, Solución buffer, ProClin 300. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado CQ. Reactivo de Quimioluminiscencia AP Listo para usar. Contenido: sustrato basado en acridan. 1 x 100 ml 5 x 100 ml Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) WASHBUF CONC Contenido: Solución Buffer Tris, Tween, NaN 3. 3 x 12 x FOIL Folio Adhesivo Version / 7

4 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 50; 100; 1000 µl 2. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado. 3. Agitador orbital ( rpm) 4. Vortex 5. Micropipeta de 8 canales con depósito para reactivos 6. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 7. Fotómetro para inmunoensayo de luminisciencia (ej. Berthold luminómetro de placas de microtitración) 8. Agua bidestilada o desionizada 9. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Algunos componentes contienen 250 µl de solución. Asegúrese de que toda la solución esté en el fondo del vial antes de abrirlo. 5. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 6. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 7. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 8. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 9. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. Version / 7

5 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del juego de reactivos para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos independientes. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones) Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 10 ml WASHBUF CONC agregue 100 ml agua bidest. 1:10 20 µl ENZCONJ CONC con 2 ml ASSAYBUF 1:101 Mezcle vigorosamente. Mezcle sin formar espuma. 2-8 C 4 semanas Prepare fresco y use sólo una vez Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con Diluente de Muestra (se puede solicitar separadamente a IBL por la REF KLZZ731). La dilución debe llevarse a cabo en tubos de vidrio. Para obtener los resultados correctos multiplique las mediciones obtenidas por el factor de dilución. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 50 µl de cada Estándar, Control y muestra dentro de los respectivos pocillos en la placa de microtitulación. 2. Pipetee 50 µl de Conjugado Enzimático preparada al momento en cada pocillo. 3. Pipetee 50 µl de Estradiol Antisuero en cada pocillo. 4. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 4 h a TA (18-25 C) sobre un agitador orbital ( rpm). 5. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x con 250 µl de Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 6. Pipetee 50 µl de Reactivo de Quimioluminiscencia AP en cada pocillo en los mismos intervalos de tiempo que necesitará el luminometro para medir posteriormente. (Luminometro Berthold tarda, por ejemplo, 2 segundos por pocillo) 7. Mida las unidades de luminiscencia relativa (RLU) con un luminometro después de los 10 minutos. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS El RLU de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logisitcs or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, utilice todos los valores obtenidos de los estándares (los valores que se encuentran fuera de rango en forma obvia pueden ser omitidos). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Version / 7

6 Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. En las muestras de saliva con valores marcadamente elevados deben revisarse la posibilidad de contaminación sanguínea. Conversión: 17β-Estradiol x 3.67 = pmol/l Rango de Medición: Saliva: pg/ml 17β-Estradiol Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar 17β-Estradiol RLU Medio RLU/RLU max (%) A B C D E F G RLU Estradiol 14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Valores normales publicados para hombres y mujeres tienden a variar levemente dependiendo del método utilizado para su medición. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: Estradiol Premenopausico n = 18, Edad: perfiles mensuales (~1500 muestras simples) Fase folicular Ciclo Medio Fase luteal postmenopausico n = 13, Edad < 4.3 n = 40, Edad: Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. Para establecer un rango de valores normales en saliva, se realizó un estudio en mujeres premenospausicas, quienes no utilizaban anticonceptivos. Se recollectaron 3 muestras diarias de saliva (mañana, mediodia y tarde). Para obtener un valor promedio diario de Estradiol durante el ciclo menstrual, las 3 muestras diarias fueron mezcladas y la concentración de Estradiol fue determinada. El siguiente gráfico indica los resultados del estudio: Monthly profiles of 18 women without contraceptiva Salivary Estradiol 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 10% 25% Median 75% 90% Day of menstrual cycle Version / 7

7 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES. Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo (+/-20%) en los resultados hasta las concentraciones declaradas: Saliva Conc. Estradiol Sangre 0.125% 1.4; 7.3 Timerosal 0.1% 11; 80 NaN 3 1% 11; PRUEBAS FUNCIONALES Sustancia Reactividad cruzada (%) 17β-Estradiol 100 Estrona 14.0 Deoxycortisol 0.58 Reactividad cruzada de otras Especificidad Analítica Estriol 0.50 substancias testeadas (Reactividad Cruzada) Estrona-3-Sulfato % Etinilestradiol 0.05 Estradiol-Glucurónido 0.03 Epiestradiol 0.02 Dihidrotestosterona 0.02 Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) Saliva 0.3 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2DS Sensibilidad Funcional Saliva 0.9 pg/ml Medio Conc. < 20% CV Precisión Medio DS CV (%) N Intra-Ensayo Inter-Ensayo Conc. Medido Recuperación Dilución (%) Saliva 1 1: (46.2) 1: : Linearidad Saliva 2 (52.6) Saliva 3 (62.6) : : : : : : : : Version / 7

8 Recuperación Comparación del Método versus RIA Conc. Agregado Medido Recuperación (%) Saliva (1.2) Saliva (4.8) Saliva (21.4) IBL-Luminiscencia IA = 0.96 x RIA r 2 Intervalo: = RIA: 0-51 pg/ml n = 50 IBL-Lumi IA: 0-55 pg/ml 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Kumari, V et al.: A Comparison of Prepulse Inhibition in Pre- and Postmenopausal Women and Age- Matched Men. Neuropsychopharmacology (2008) 33, Laine, M. A. et A. O. Ojanotko : Estradiol metabolism in human saliva in vitro, J Steroid Biochemistry and Molecular Biology 70: (1999) 3. Sumiala, S. et al.: Salivary Estradiol concentrations after tubal sterilization, Obstet Gynecol 88: (1996) 4. Lipson, S. F. et P. T. Ellison : Reference values for luteal Estradiol measured by salivary radioimmunoassay 61: (1994) 5. Wingfield, M. et al. Follicular and luteal phase salivary Estradiol profiles in women with endometriosis and infertility. Gynecol. Endocrinol. 8: (1994) 6. Finn M. M. et al. The frequency of salivary Estradiol sampling and the diagnosis of luteal phase insufficiency. Gynecol. Endocrinol 6: (1992) 7. Vuorento,T. et I. Huhtaniemi: Daily levels of salivary Estradiol during menstrual cycle in adolescent girls. Fertil Steril 58: (1992) 8. Li, T. C. et al.: The relation between daily salivary Estradiol profile and endometrial development in the luteal phase of fertile and infertile women. British Journal of Obstetrics and Gynaecology 96: (1989) 9. Lenton E. A. et al. Measurement of Estradiol in saliva : assessment of the normal fertile range using spontaneous conception cycles. Clinical Endocrinology 28: (1988) 10. Lequin, R. M. et al. Estradiol in Saliva : pitfalls and consequent implications for accuracy of the determination. Clin. Chem. 32: (1986) 11. Sufi, S. B. et al. Multicenter evaluation of assays for estradiol and Estradiol in saliva. Clin. Chem. 31: (1985) Version / 7

9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /