alpha-amylase Saliva Assay

Transcripción

1 Instrucciones de Uso alpha-amylase Saliva Assay Ensayo enzimático para la determinación de la actividad de alfa amilasa en saliva humana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Ensayo enzimático para la determinación de la actividad de alfa amilasa en saliva humana. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La medición de la actividad de alfa Amilasa en la saliva es útil en el ámbito de la psicobiología del estrés. Numerosos estudios han demostrado que la actividad del alfa Amilasa en saliva esta correlacionada con la actividad simpatoadrenal del sistema medular. Libre de cortisol salival se estableció un marcador no invasivo en el eje de la actividad del hipotálamo hipófisis suprarrenal (HPA). Ahora la alfa Amilasa salival parece ser un marcador salival bien caracterizado de la actividad del sistema simpato-medular suprarrenal (SAM). Alfa Amilasa salival también está relacionada con el estrés crónico, trastorno de estrés postraumático, el comportamiento, la función cognitiva y la salud. Además el aumento de alfa Amilasa en la saliva pueden ser provocado por la activación del SNS debido a drogas (como Yohimbina) e impedido por el beta-bloqueo (como propanolol). El estado actual de la investigación muestra que la alfa Amilasa en saliva podría ser una extensión útil de los métodos biopsicológicos. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Este ensayo enzimático es de fase líquida. El alfa Amilasa salival metaboliza específicamente el sustrato, donde la intensidad del color producido es proporcional a la actividad de la alfa amilasa en la muestra. Los resultados de las muestras se puede determinar directamente mediante el uso de la curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. Version / 6

3 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de Parafilm. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge por 10 min a x g para remover el material particulado. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien. (Color rojizo que indique contaminación sanguínea) Almacenamiento C 2 8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad 1 día 28 dias 6 meses 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 3 x 200 µl CAL LYO 2 x 3 x 200 µl CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 40 ml DILBUF CONC 1 x 21 ml SUBS Placa de Microtitulación Tiras separables. Estándar patrón, liofilizado Contenido: alfa amilasa en saliva humana. Método de referencia para la calibración: temperatura del fotómetro. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control de Calidad. Control 1+2, liofilizado Contenido: alfa amilasa en saliva humana. Método de referencia para la calibración: temperatura del fotómetro. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control de Calidad. Buffer diluyente de Muestra, Concentrado (10x) Contenido: PBS, BSA, estabilizadores. Solución Substrato Listo para usar. Contenido: CNPG3, estabilizadores. 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 10; 100; 200; 1000 µl 2. Tubos de desechables para la dilución de las muestras 3. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 4. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 405 nm (longitud de onda de referencia nm) 5. Agua bidestilada o desionizada 6. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 7. Vortex 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. Version / 6

4 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. La alfa amilasa se encuentra en el sudor y la saliva. Por favor, use quantes durante el ensayo y no pipetear con la boca. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de componentes concentrados Componente Relación Diluyente Notas Almacenami ento Estabilidad Buffer diluyente de Muestra DILBUF CONC 1:10 agua bidest. p.e. 10 ml Buffer diluyente de Muestra + 90 ml agua bidest. Mezcle sin formar espuma. 2-8 C 4 semanas Preparación de componentes liofilizados Componente con Diluyente Notas Almacenami ento Estabilidad CAL LYO 200 µl Deje reposar durante 15 min. 2-8 C 7 dias CONTROL 1+2 LYO 200 µl Mezcle sin formar espuma. 2-8 C 7 dias Preparación de los estándares El estándar patrón debe ser reconstituido y diluído 1:301. Éste es el estándard 1. Luego diluya el estándar 1 en serie para obtener los demás estándares. El siguiente ejemplo muestra cómo obtener una curva estándar con 5 puntos de calibración. Componente Relación Diluyente Notas Estándar 1 1:301 Estándar 2 1:2 Estándar 3 1:2 Estándar 4 1:2 Estándar 5-10 µl de estándar patrón reconstituido + 3 ml Mezclar bien antes de dilución siguiente. 100 µl Estándar µl Mezclar bien antes de dilución siguiente. 100 µl Estándar µl Mezclar bien antes de dilución siguiente. 100 µl Estándar µl Mezclar bien. Calculos U/mL Véase etiqueta p.ej. 400 U/mL p.ej.: 200 U/mL p.ej.: 100 U/mL p.ej.: 50 U/mL Solamente solución 0 U/mL Predilución de Controles y Muestras Las muestras deben ser previamente diluídas 1:301 de la siguiente manera: Relación Diluyente Notas Muestra 1:301 Controles 1:301 p.e.: 10 µl Muestra (Saliva) + 3 ml. Mezclar bien después de la dilución! p.e.: 10 µl Control (reconstituido) + 3 ml. Mezclar bien después de la dilución! Las muestras que contengan concentraciones superiores al estándar más alto tienen que ser aún más diluidas. Version / 6

5 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 10 µl de cada Estándar prediluído, Controles prediluídos y muestra prediluída en cada pocillo respectivo de la Placa de Microtitulación. 2 Pipetee 200 µl de Substrato en cada pocillo. Agitar la placa con cuidado. 3. Para la adición de la Sustrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen. 4. Incube 3 min a temperatura ambiente (18-25 C). 5. Medición 1: Mida la densidad óptica con un fotómetro a 405 nm (Longitud de onda de referencia: nm). 6. Durante la incubación, la alfa Amilasa presente en la muestra metaboliza especificamente el sustrato. Por esto, es importante obtener una buena diferenciación entre los estándares. No obstante, la densidad óptica de los estándares más altos no deberá exceder en la segunda medición a Seguir el desarrollo de la DO en diferentes tiempos a fin de evitar desbordes, especialmente en caso de alta temperatura ambiente. Los resultados de la actividad de la alfa Amilasa no se verán afectados! 7. Incube otros 5 min (tiempo total de incubación 8 min.) a temperatura ambiente (18-25 C). En caso de temperaturas altas en el primer paso del ensayo, se recomienda para medir el plato a los 3 min (tiempo total de incubación 6 min). 8. Medición 2: Mida la densidad óptica con un fotómetro a 405 nm (Longitud de onda de referencia: nm). 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas de los viales. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS Calcular la delta DO para cada uno: estándar, el control y la muestra, deduciendo la DO de la "Medida 1" de la DO de la "Medida 2". La delta OD de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Para la asistencia en el cálculo de resultados puede ponerse en contacto con de IBL. Los resultados se expresan en U/mL. Para convertir en el Sistema Internacional (SI) de Unidades debe multiplicar por el factor de Los resultados serán expresados en nkat/l. Version / 6

6 14. PRUEBAS FUNCIONALES Precisión Recuperación Medio Actividad (U/mL) DS (U/mL) Intra-Ensayo Inter-Ensayo Muestra Saliva Dilución Medido Actividad (U/mL) Recuperación (%) 1: : : : : : Linearidad 1: : : : : : : : : Actividad Agregado Medido Actividad Recuperación endógena (U/mL) Actividad (U/mL) (U/mL) (%) Saliva (25.5) Comparación de Métodos Saliva 2 (38.9) Saliva 3 (107.1) CV (%) IBL = x Ensayo enzimático disponible comercialmente N r = n = 24 Version / 6

7 15. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. DIN EN ISO 18153:2003, In vitro diagnostic medical devices Measurement of quantities in biological samples Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzyme assigned to calibrators and control materials. 2. Emily S. Winn-Deen, Harold David, Gerald Sigler, Rodrigo Chavez; Development of a Direct Assay for alpha-amylase ; Clin. Chem. 34/10, (1988) 3. Jean-Pierre Bretaudiere, Robert Rej, Patricia Drake, Anne Vassault, Michel Bailly Suitability of Control Materials for Determination of alpha-amylase activity ; Clin. Chem. 27/6, (1981) 4. G. Gubern, F. Canalias, FJ Gella; Determination of alpha-amylase activity: method comparison and commutability study of several control material ; Clin. Chem. 41, (1995) 5. Urs M. Nater, Nicolas Rohleder, Wolff Schlotz, Ulrike Ehlert, Clemens Kirschbaum; Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase ; Psychoneuroendocrinology 32, (2007) 6. Daniela Schoofs, Diana Preuß, Oliver T. Wolf; Psychosocial stress induces working memory impairments in an n-back paradigm ; Psychoneuroendocrinology 33, , (2008) 7. Tom Smeet, Henry Otgaar, Ingrid Candel, Oliver T. Wolf; True or false? Memory is differentially affected by stress-induced cortisol elevations and sympathetic activity at consolidation and retrieval ; Psychoneuroendocrinology 33, (2008) 8. Katrin Starcke, Oliver Wolf; Anticipatory Stress Influences Decision Making Under explicit Risk Conditions ; Behavioral Neuroscience, 122/ 6, (2008) 9. Noriyasu Takai, Masaki Yamaguchi, Toshiaki Aragaki, Kenji Eto, Kenji Uchihashi and Yasuo Nishikawa; Gender-Specific Differences in Salivary Biomarker Responses to Acute Psychological Stress ; New York Academy of Sciences 1098: (2007) 10. Anda van Stegeren, Nicolas Rohleder, Walter Everaerda and Oliver T. Wolf; Salivary alpha amylase as marker for adrenergic activity during stress: Effect of betablockade ; Psychoneuroendocrinology 31, (2006) 11. Ulrike Ehlert, Katja Erni, Gundula Hebisch, and Urs Nater; Salivary α-amylase Levels after Yohimbine Challenge in Healthy Men ;The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(12): (2006) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /