Melatonin direct Saliva ELISA

Transcripción

1 Instrucciones de Uso Melatonin direct Saliva ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación directa, cuantitativa de la melatonina en saliva humana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación directa, cuantitativa de la melatonina en saliva humana. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La glándula pineal ("corpus pineale") se conoce como transductor neuroendocrino debido a su importante rol en los ciclos foto-periódicos. La hormona más importante de la glándula pineal es la N-acetil-5-metoxitriptamina o melatonina, la cual se sintetiza a partir del aminoácido triptófano. La melatonina presenta sus niveles más elevados en plasma durante la noche. Su repentina aparición nocturna parece codificar información temporal como la longitud de la noche. La regulación de la secreción de melatonina se realiza bajo control neuronal. La inervación simpática parece jugar un papel importante a través de la liberación de noradrenalina. Los patrones y/o niveles alterados de secreción de melatonina han sido reportados en relación con desórdenes del sueño, trastornos del sueño del viajero, depresión, stress, esquizofrenia, amenorrea hipotalámica, embarazo, anorexia nerviosa algunas formas de cáncer, desórdenes inmunológicos así como control de la madurez sexual durante la pubertad. La mayor parte de la melatonina circulante se metaboliza en el hígado a 6-hidroximelatonina y subsecuentemente a 6-sulfatoximelatonina, la cual se excreta por la orina. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El procedimiento de ensayo sigue el principio básico de los ELISAs competitivos, donde existe competencia entre el antígeno biotinilado y el no biotinilado por un número fijo de sitios de unión. La cantidad de antígeno biotinilado unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración del analito en la muestra. Cuando el sistema está en equilibrio, el antígeno biotinilado libre se elimina con una etapa de lavado y el antígeno biotinilado unido al anticuerpo se determina empleando una estrepravidina-peroxidasa como marcador y TMB (tetrametilbenzidina) como sustrato. La cuantificación se logra por comparación de la actividad enzimática de la muestra desconocida con una curva de respuesta preparada con estándares conocidos. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. Version / 9

3 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de parafina. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge x g para remover el material particulado. No debe utilizarse muestras que contengan celulosa en el sistema de recolección. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien (sin color rojizo que indique contaminación sanguínea). Almacenamiento: C 2 8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad: 24 h 1 semanas 6 meses 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP Placa de Microtitulación Tiras separables. Recubierto con anti-conejo IgG (cabra, policlonal). 1 x 10 ml CAL A Estándar A-F Listo para usar. Contenido: estabilizadores. Por concentraciones exactas vea 1 x 5 x 1 ml CAL B-F las etiquetas o el certificado de Control de Calidad. Control x 2 x 1 ml CONTROL 1+2 Listo para usar. Contenido: estabilizadores. Por concentraciones exactas vea las etiquetas o el certificado de Control de Calidad. 1 x 7 ml ANTISERUM Melatonina Antisuero Listo para usar. Contenido: Antisuero (conejo, policlonal), estabilizadores. 1 x 12 ml BIOTIN Melatonina Biotina Listo para usar. Contenido: estabilizadores. 1 x 12 ml ENZCONJ Conjugado Enzimático Listo para usar. Contenido: estreptavidina conjugado con HRP, estabilizadores. 1 x 50 ml WASHBUF CONC Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween, estabilizadores. 1 x 15 ml TMB SUBS Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores 1 x 15 ml TMB STOP Solución de Parada TMB Listo para usar. 1 M H 2 SO 4 3 x FOIL Folio Adhesivo Version / 9

4 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 50: 100 µl 2. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado. 3. Agitador orbital ( rpm) 4. Vortex 5. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 6. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 7. Centrífuga (preferiblemente refrigerada) x g 8. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 9. Agua bidestilada o desionizada 10. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 11. Refrigeración (2-8 C) 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 9. La fuerza centrífuga relativa (g) no es equivalente a las revoluciones por minuto (rpm) sino que tiene que ser calculada teniendo en cuenta el radio del rotor de la centrífug. Version / 9

5 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones). Se debe evitar en cualquier caso el Timerosal Preparación de componentes concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 10 ml WASHBUF CONC ad 200 ml Dilución de Muestras agua bidest. 1:20 Mezcle vigorosamente. 2-8 C 4 semanas Valores superiores a 50 pg / ml (estándar F) deben ser diluídos con un estándar en el rango lineal de la curva estándar. Por ejemplo, para la dilución de 1:10 ( 50 μl de saliva μl estándar A). La dilución debe ser hecha en tubos de vidrio. Para obtener resultados correctos, los datos obtenidos han de multiplicarse por el factor dilución. Valores inferiores a <0 pg / ml se debe repetir para una medición adicional. Nota: Un estándar adicional de 100 ml se pueden ordenar por separado, en virtud de cat.no. KESM PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 100 μl de cada Estándar, Control y muestra en los pozos respectivos de la placa de microtitulación. 2. Pipetee 50 μl de Solución Antisuero en cada pozo. Cubra la placa con folio adhesivo. Agite la placa cuidadosamente por 10 segundos. 3. Incube h a 2-8 C. 4. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x con 250 μl de Solución Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 5. Pipetee 100 μl de Solución de Biotina en cada pozo. Cubra la placa con papel folio adhesivo. 6. Incube 2 horas a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 7. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x con 250 μl de Solución Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 8. Pipetee 100 μl de Conjugado Enzimático en cada pozo. Cubra la placa con folio adhesivo. 9. Incube 1 horas a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 10. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x con 250 μl de Solución Buffer de Lavado diluído. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 11. Pipetee 100 μl de la Solución Sustrato TMB en cada pozo. 12. Incube 15 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 13. Detenga la reacción del sustrato añadiendo 100 μl de Solución de Parada TMB en cada pozo. Agitar brevemente. Se observara cambios de color azul al Amarillo. 14. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) Dentro de los 15 min de pipetear la Solución de Parada. Version / 9

6 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Conversión: Melatonina (pg/ml) x 4.30 = pmol/l Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar Concentracion (pg/ml) DO Medio DO/DO max (%) A B C D E F (OD) Melatonin direct Saliva ELISA (pg/ml) Version / 9

7 14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Un estudio con sujetos aparentemente saludables demostró que los niveles de melatonina en humanos tienen un marcado ritmo circadiano caracterizado por niveles muy bajos durante el día (<5 pg/ml) y altos valores durante la noche (>10 pg/ml) y muestran una variación individual muy considerable. Además la concentración de melatonina depende de la edad; las mayores concentraciones se encontraron en muestras de niños de hasta 3 años de edad. El pico nocturno de la melatonina entre los individuos sanos varía significativamente. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES. Se debe evitar en cualquier caso el Timerosal. Los siguientes componentes substancias no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas (+/- 20%). Conc. en saliva Sangre % ASB % NaN % Version / 9

8 16. PRUEBAS FUNCIONALES Substancia Reactividad Cruzada (%) 5-Methoxytryptamine 2.5 Reactividad cruzada de Especificidad Analítica N-Acetylserotonin 1.2 otras substancias (Reactividad Cruzada) 5-Methoxytryptophol 1.2 testeadas 0.01 % Serotonin <0.02 Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) Saliva 0.3 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2SD Sensibilidad Funcional Saliva 1.0 pg/ml Conc.Media < 20% CV Precisión Medio (pg/ml) DS (pg/ml) CV (%) N Intra-Ensayo Inter-Ensayo Dilución Medido (pg/ml) Recuperación (%) : : : : Linearidad 1: : : : : : : : Conc. (pg/ml) Agregado (pg/ml) Medido (pg/ml) Recuperación (%) Saliva 1 (1.2) Recuperación Saliva 2 (1.4) Saliva 3 (0.9) Metodo de Comparación versus ELISA comercial Saliva IBL = 0.72 x ELISA 0.4 n = 71; r = 0.99 Comparación del Método Saliva versus IBL RIA ELISA = 1.02 x RIA 0.8 n = 82; r = 0.95 Version / 9

9 17. PROTOCOLO CORTO AJUSTES DEL PRE ENSAYO DILUCION Volumen Aqua dest. Relación Observac. WASHBUF CONC 10 ml ad 200 ml 1:20 Ejemplo para 32 pozos DILUCION DE LAS MUESTRAS Saliva Observaciones Las muestras que contengan concentraciones superiores al nivel más alto del Estándar A tienen que ser diluídas. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO CAL A-F, CONTROL 1+2, Muestras 100 µl ANTISERUM 50 µl Incube a h a 2-8 C. Aspirar el contenido en cada pozo. Lave la placa 4 x con 0.25 ml de WASHBUF (diluído) y aspire. BIOTIN 100 µl Incube 2 h a C en un agitador orbital (500 rpm). Aspirar el contenido en cada pozo. Lave la placa 4 x con 0.25 ml de WASHBUF (diluído) y aspire. ENZCONJ 100 µl Incube 1 h a C en un agitador orbital (500 rpm). Aspirar el contenido en cada pozo. Lave 4 x con 0.25 ml de WASHBUF (diluído) y aspire. TMB SUBS 100 µl Incube 15 min. a C TMB STOP 100 µl Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm. Version / 9

10 18. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Iriti, M., Rossoni, M, Faoro F. Melatonin content in grape myth or panacea? J Sci Food Agric 86: (2006) 2. Lahiri, D. K., Ge, Y.-W., Sharman, E. H., Bondy, St. C., Age-related changes in serum melatonin in mice: higher levels of combined melatonin and 6-hydroxymelatonin sulfate in the cerebral cortex than serum, heart, liver and kidney tissues. J. Pineal Res. May 2004, Vol. 36, issue 4, Sharman E et al. Age-related changes in murine CNS mrna gene expression are modulated by dietary melatonin. J. Pineal Res. Vol 36, Issue 3: 165ff. (2004) 4. Wagner H.-J. Mattheus U. Pineal organs in deep demersal fish. Cell Tissue Res 307: (2002) 5. Kunz D et al. Melatonin as a therapy in REM sleep behavior disorder patients: an open-labeled pilot study on the possible influence of melatonin on REM-sleep regualation. Movement Disorders, 14: (1999) 6. Pfluger DH, Minder CE. Effects of exposure to 16.7 Hz magnetic fields on urinary 6-hydroxymelatonin sulfate excretion of Swiss railway workers. J. Pineal Res., 21: (1996) 7. Follenius M, Weibel L, Brandenberger G. Distinct modes of melatonin secretion in normal men. J. Pineal Res., 18: (1995) 8. Dubbels R et al. Melatonin in edible plants identified by radioimmunoassay and by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pineal Res., (1995) 9. Czeisler CA et al. Suppression of melatonin secretion in some blind patients by exposure to bright light. N. Engl. J. Med., 332: 6-11 (1995) Version / 9

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12 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /