CIC-C1q ELISA. Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de CIC-C1q en suero o plasma humanos.
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- Eva Soriano Carrasco
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1 Instrucciones de Uso CIC-C1q ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de CIC-C1q en suero o plasma humanos. DM C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de CIC-C1q en suero o plasma humanos. 2. RESUMEN E EXPLICACIÓN Los complejos inmunes circulantes son presentes en muchas personas con Lupus Eritematoso Sistémico (LES) e Artritis Reumatoide (AR), especialmente con cualquier complicación de los vasculitides. Se ha reportado que hay una correlación entre los níveles de CIC y la actividad de enfermedades en cuanto hay níveles más altos durante las fases activas de la enfermedad. Se han desarrollado muchos ensayos para la detección de los CIC, incluyendo la precipitación con PEG y la inmunodifusión radial, así como los ensayos basados en células como el ensayo de células Raji. Ninguna de estas proceduras parece ser capaz de detectar todos los típos de CIC, no obstante las proceduras que detectan los CIC conteniendo fragmentos del complemento (p.ej. C1q y C3d) parezcan detectar los acontecimientos clínicos relevantes. C1q se une con mayor avidez a los complejos inmunes que varían en tamaño desde 19 hasta 27 S. En la enfermedad del suero, que es el prototipo de enfermedad por complejos inmunes, este tamaño del complejo ha sido normalmente encontrado depositado en el tejido conduciendo a daños. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El kit (CIC-C1q) se basa en el principio de que los inmunocomplejos afines a la fracción C1q son bloqueados por el C1q inmovilizado en la microplaca. En la primera fase del procedimiento, se añaden los sueros y las muestras a la microplaca recubierta con C1q y, a continuación, se dejan incubar. Durante esta fase, los inmunocomplejos afines a la fracción C1q se unen al C1q que recubre la microplaca. Con el lavado de la microplaca se retiran las proteínas del suero no unidas. En la segunda fase, se añade el conjugado anti IgG humana-peroxidasa, que se une a los inmunocomplejos ahora fijados a la microplaca. Con el lavado se retira el conjugado no unido. En la tercera fase, se añade el substrato TMB, que reacciona con el conjugado unido a la microplaca. La intensidad del color medida a 450 nm es proporcional a los niveles de CIC IgG. La concentración de inmunocomplejos presentes en la muestra se determina mediante una Curva de calibración. Los resultados se expresan como microgramos de gammaglobulina humana agregada por calor equivalentes por ml (μgeq/ml) 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. Para obtener más información (implicaciones clínicas, pruebas funcionales, protocoles de automatizaciónm aplicaciones alternativas, literatura, etc.) consulte la página de IBL. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 9. Evite la exposición de reactivo TMB/H 2 O 2 a la luz solar directa, metales o oxidantes. V1_2015_01 (es01) 1/6
3 10. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) o ProClin 300 como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 11. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 12. El material de origen animal utilizado en la preparación del kit ha sido obtenido de animales certificados como saludables y la proteína bovina ha sido obtenida de países no infectados por EEB, pero estos materiales deben tratarse como potencialmente infecciosos. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y la estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. Dejar la microplaca a temperatura ambiente durante unos minutos antes de retirar las tiras necesarias para el ensayo. Devolver las tiras no usadas a la bolsa correspondiente de aluminio y sellarla. Después de la apertura, el kit debe utilizarse dentro de la fecha de caducidad imprimida en el paquete. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS La determinación de CIC se realiza en suero o plasma humano. Las muestras que no se analicen inmediatamente deberán conservarse a -20 C. No volver a congelar las muestras una vez descongeladas. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12x8 MTP Placa de Microtitulación Tiras separables. Revestido con C1q. 1 x 0.5 ml ENZCONJ Conjugado Enzimático Contiene IgG anti-humano conjugado con peroxidasa de rabano (HRP). 1 x 20 ml ENZCONJDIL Solución Buffer de Conjugado Listo para usar. Contiene 74 mm Solución buffer fosfatasa, ph x 3 x 1.5 ml CAL A-C Estándar A-C Listo para usar. Concentraciones 0; 16; 64 µgeq/ml. Por concentraciones exactas vea el certificado CC. 1 x 1.5 ml CONTROL + Control Positivo Listo para usar. Contiene 74 mm Solución buffer fosfatasa, ph 7.4, 1 g/l BSA. Por concentraciones exactas vea el certificado CC. 1 x 1.5 ml CONTROL Control Negativo Listo para usar. Contiene 74 mm Solución buffer fosfatasa, ph 7.4, 1 g/l BSA. Por concentraciones exactas vea el certificado CC. 50 ml SAMPLEDIL Diluente de Muestras Listo para usar. Contiene 74 mm Solución buffer fosfatasa, ph x 50 ml Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10 x) WASHBUF CONC Contiene 0.2M Solución buffer fosfatasa, ph x 15 ml TMB SUBS Solución de Substrato Listo para usar. Contiene H 2 O 2, TMB 0.26 g/l. 1 x 15 ml TMB STOP Solución de Parada Listo para usar. Contiene 0.15 mol/l H 2 SO 4. V1_2015_01 (es01) 2/6
4 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 10, 100, 300 and 500 µl 2. Soporte para la dilución de las muestras 3. Tubos de desechables para la dilución de las muestras 4. Incubador, 37 C 5. Cilindro calibrado de 1 L 6. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 7. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 8. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 9. Agua bidestilada o desionizada 10. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) durante al menos 30 minutos y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Emplee un esquema de pipeteo según las dimensiones de la placa. Un esquema de pipeteo que cubre tanto el pretratamiento de las muestras como el ensayo está disponible en la página inicial del sitio web de IBL. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben manipularse en el mismo orden y respetando las secuencias de tiempo. Se recomienda el empleo de una micropipeta de 8 canales para pipetar las soluciones en todos los pozos. 7. El lavado de las placas de microtitulación es importante. Los pocillos lavados inadecuadamente darán resultados erróneos. Se recomienda el empleo de una micropipeta multicanal o de un sistema de lavado automático. No deje secar los pocillos entre incubaciones. No dañe el recubrimiento de los pocillos durante los procesos de aspiración y enjuague. En el enjuague chequee que todos los pocillos estén totalmente llenos de buffer de enjuague y de que no queden residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. V1_2015_01 (es01) 3/6
5 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Dilución de Muestras Pipetear en una probeta: Muestra Diluente de Muestras 10 μl 500 μl Mezclar con cuidado. Evitar el uso del vórtex Dilución de Solución Buffer de Lavado Antes del uso, diluir el contenido del frasco de la Solución Buffer de Lavado (10x) con agua destilada hasta un volumen de 500 ml. Para preparar volúmenes menores, respetar la relación de dilución de 1:10. En la solución de lavado concentrada es posible observar la presencia de cristales. En ese caso, agitar a temperatura ambiente hasta que los cristales se disuelvan por completo. Para una mayor precisión, diluir todo el frasco de la solución de lavado concentrada en 500 ml teniendo cuidado para transferir también los cristales con el lavado del frasco y, a continuación, agitar hasta que se disuelvan por completo Dilución de Conjugado Diluir el Conjugado 1:100 con la Solución Buffer de Conjugado. La cantidad varía proporcionalmente según el número de ensayos que se vayan a realizar. Mezclar bien evitando la formación de espuma. Almacenamiento: 2-8 C Estabilidad: 30 días Almacenamiento: C Estabilidad: 3 horas 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 100 µl de cada Estándar, Control o muestra de paciente diluído en los pocillos respectivos de la placa de microtitulación. 2. Incubar 30 min a 37 C. 3. Lavar la placa 3 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. Nota importante: Agite suavemente la placa durante 5 segundos en cada paso del lavado. Lavados automático: Si está utilizando una lavadora automática, lavar los pocillos al menos 5 x. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado diluído en cada pocillo. 5. Incubar 30 min a 37 C. 6. Lavar la placa 3 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. Nota importante: Agite suavemente la placa durante 5 segundos en cada paso del lavado. Lavados automático: Si está utilizando una lavadora automática, lavar los pocillos al menos 5 x. 7. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 8. Incubar 15 min a TA (18 25 C) protegida de la luz. 9. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Parada TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. 10. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Parada TMB. V1_2015_01 (es01) 4/6
6 12. CONTROL DE CUALIDAD Cada laboratorio debe analizar sueros controles para los rangos bajo, medio y alto de CIC C1q para supervisar el rendimiento del análisis. Estas muestras deben tratarse como desconocidas y los valores deben determinarse en cada ensayo realizado. Se deben mantener los gráficos de control de calidad para seguir el rendimiento de los reactivos suministrados. Se deben emplear métodos estadísticos adecuados para determinar las tendencias. El laboratorio debe establecer los límites de aceptabilidad del rendimiento del análisis. Además, la capacidad de absorción máxima debe ser constante con la experiencia anterior. Una desviación significativa del rendimiento establecido puede indicar un cambio inadvertido en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos del kit. Se deben usar reactivos frescos para determinar la causa de las variaciones. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, lineal) ya sea en papel o empleando un método automático. Para el cálculo de la curva estándar, Aplique cada señal de los estándares (los duplicados con un valor obviamente fuera de límites debe omitirse y emplearse el valor único más plausible). La concentración de las muestras de serum y plasma se expresar en μgeq/ml y se puede leer directamente de la curva estándar. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. 14. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Si se utiliza reducción de datos controlada por computadora para calcular los resultados del ensayo, es imperativo que los valores previstos para los calibradores caen dentro el 10 % de las concentraciones asignadas. µgeq/ml de agregado de IgG Muestra Negativa < 16 Muestra Dudosa entre 16 y 18 Muestra Positiva > 18 Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. V1_2015_01 (es01) 5/6
7 15. PRUEBAS FUNCIONALES Precisión Variación Intra-Ensayo La variabilidad dentro del mismo kit se ha determinado replicando (16x) la determinación de dos sueros de control distintos. La variabilidad intraensayo es 5.3 % Variación Inter-Ensayo La variabilidad entre distintos kits se ha determinado replicando la determinación de dos sueros de control distintos con dos kits pertenecientes a lotes distintos. La variabilidad interensayo es 6.0 % Recuperación La prueba de recuperación realizada en muestras enriquecidas con μgeq/ml de agregado de IgG ha dado valores comprendidos entre el 94.3 % y el % Límite de detección La concentración mínima de CIC C1q medible es 1.0 μgeq/ml con un límite de confianza del 99 % Especificidad y sensibilidad diagnostica Especificidad y sensibilidad cliníca Se han analizado muestras de suero de 92 personas sanas, asintomáticas con el CIC C1q ELISA. La especificidad clínica del ensayo es del 96 %. Se han analizado muestras de suero de 125 pacientes con SLE, artritis reumatoide y otras enfermedades con el CIC C1q ELISA. La sensibilidad clínica del ensayo es del 92 % Sensibilidad y especificidad frente al método de referencia comercial Se han obtenido y analizado 209 muestras de suero de pacientes con SLE, RA u otras patologías, usando el kit CIC-C1q ELISA de IBL y un otro comercial. En la tabla siguiente se indican los resultados obtenidos: Kit IBL Kit Comercial Pacientes RA Pacientes SLE Otros De las 209 muestras analizadas se han obtenido los siguientes datos de estabilidad y sensibilidad diagnóstica: RA SLE Otros RA+SLE RA+SLE+Otros Sensibilidad 75.0 % 67.6 % 97.7 % 69.8 % 87.1 % Especificidad 83.3 % 86.4 % % 84.1 % Concordancia % 86.1 % Otros datos de comparación Se han analizado muestras de suero de 95 personas sanas y 160 personas enfermas. La concordancia entre los resultados de los dos métodos ha sido del 87 %. La concentración media de CIC en donantes sanos es de 2.1 μgeq/ml (S.D. = 1.6). 16. LITERATURA DE REFERENCIA SOBRE EL PRODUCTO 1. Triolo G., et al J.Clin.Lab.Immunol 13, (1984) 2. Rong-jia Xu et al J.Immunol.Met. 135, (1990) 3. Menzel J.E., et al J.Immunol. Met. 138, 16 (1991) 4. Muso E, et al Nippon Jinzo Gakkai Shi.36(4): (1994) 5. Yoshinoya S, et al J Clin Lab Immunol. 38(4): (1992) V1_2015_01 (es01) 6/6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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