DHEA Saliva ELISA. Inmunoensayo Enzimático para la determinación cuantitativa de DHEA en saliva humana.
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- Gregorio Soriano Henríquez
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1 Instrucciones de Uso DHEA Saliva ELISA Inmunoensayo Enzimático para la determinación cuantitativa de DHEA en saliva humana. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo Enzimático para la determinación cuantitativa de Dehydroepiandrosterone (DHEA) en saliva humana. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS DHEA (dehidroepiandrosterona) y su éster sulfato DHEA-S, como las hormonas de esteroide C-19, pertenecen al grupo de los andrógenos. Como se producen casi exclusivamente (96%) en la corteza suprarrenal, son los andrógenos suprarrenales más importantes. También se producen en las gónadas y en el cerebro. Debido a la cantidad producida, se pueden considerar como los productos principales de la biosíntesis de esteroides humanos. DHEA-S circula en sangre en concentraciones 20 veces más elevadas que cualquier otra hormona. La concentración de DHEA-S tiene niveles 300 a 500 veces más elevados que los de DHEA. Sirve como una especie de depósito de DHEA. La conversión de DHEA-S en DHEA se produce muy rápidamente y en casi todos los tejidos del cuerpo, ya que las correspondientes enzimas se encuentran disponibles de manera ubicua. Aunque la DHEA-S hidrofílica representa una prehormona inactiva, la DHEA lipofílica puede ser reabsorbida por las células de los tejidos periféricos, convertida en andrógenos y estrógenos y luego liberada a la circulación. Sólo la DHEA libre, no unida a proteína, puede ingresar a las células y convertirse. Es el mismo caso que para la saliva, en donde sólo la DHEA libre puede transferirse. Por lo tanto, la concentración de DHEA biológicamente activa se puede medir fácil y directamente en saliva. En sangre, la DHEA-S y la DHEA se unen levemente a la albúmina. En saliva, sólo se encuentra la hormona activa libre. La concentración de DHEA en saliva es de aproximadamente 1/30 de la detectada en suero. La concentración de DHEA normal cambia significativamente con la edad: Al nacer los valores de DHEA son muy altos, cayendo abruptamente a valores apenas medibles, y se mantienen en niveles bajos hasta los primeros 7 a 10 años de vida, cuando madura la corteza suprarrenal y los valores de DHEA comienzan a subir nuevamente. En adultos, se espera que las concentraciones pico de DHEA en un individuo se alcancen entre los 25 y los 35 años, seguido por un lento pero continuo declive hasta un valor bajo alrededor de los 50 años y llegar, finalmente, a la edad avanzada, cuando se observa entre un 10% y un 20% de los valores registrados en el pico. El descenso en la secreción de DHEA, asociado a la edad, se conoce como adrenopausia y se produce por una reducción de la producción de DHEA en la corteza suprarrenal. Se observa que los valores de DHEA en suero y en saliva son pulsátiles, como con otras hormonas esteroideas, con un claro rango de oscilación alrededor del valor medio. Debido a la dinámica pulsátil de la secreción esteroidea, se recomienda repetir las muestras de saliva. Debido a la manifestación ubicua de DHEA, su determinación es útil en muchos campos del diagnóstico médico y en la investigación, principalmente en endocrinología y en medicina antienvejecimiento, pero también en neuroendocrinología y en medicina veterinaria. DHEA es un marcador de estrés en psicología y en medicina del deporte. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El DHEA Saliva ELISA es un ensayo en fase sólida de inmunoadsorbción unido a enzimas (ELISA), basado en el principio de unión competitiva. Los pocillos de las placas están recubiertos con un anticuerpo policlonal dirigido contra un foci antigénico en la molécula DHEA. En las muestras de los pacientes DHEA endógena compite con un conjugado DHEAperoxidasa de rábano en la unión al anticuerpo recubierto. Después de la incubación el conjugado no unido se lava. La cantidad de conjugado de peroxidasa unido es inversamente proporcional a la concentración de DHEA en la muestra. Después de la adición de la solución de substrato, la intensidad de color desarrollado es inversamente proporcional a la concentración de DHEA en la muestra del paciente. Version / 6
3 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Saliva El paciente no debe comer, beber, mascar goma o lavarse los dientes 30 min antes de la toma de muestra. De lo contrario se debe enjuagar la boca con agua fría 5 min antes de la toma de muestra. No colecte muestra en cuando se presenten enfermedades orales, inflamaciones o lesiones (contaminación con sangre). La saliva puede ser colectada en un dispositivo adecuado. Se debe recoger un mínimo de 0.5 ml de líquido. La producción de saliva puede ser estimulada mascando un pedazo de film de Parafilm. Se recomienda congelar las muestras a 20 C antes del ensayo de laboratorio. Después de descongelar, mezcle y centrifuge por 10 min a x g para remover el material particulado. Observe que las muestras de saliva estén visualmente bien. (Color rojizo que indique contaminación sanguínea) Precaución: Salivette conduce a resultados incorrectos! Almacenamiento: C 2-8 C -20 C (Alícuotas) Estabilidad: 5 dias 5 dias 6 meses Version / 6
4 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 3.5 ml CAL A 1 x 5 x 1 ml CAL B-F 1 x 2 x 1 ml CONTROL x 13 ml ENZCONJ 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 3 x FOIL Folio Adhesivo Placa de Microtitulación Tiras separables. Recubierto con anti-dhea anticuerpos (policlonal). Estándar A 0 pg/ml Listo para usar. Contenido: Solución buffer, ASB, 0.1% ProClin. Estándar B-F 20; 60; 180; 540; 2160 pg/ml Listo para usar. Contenido: DHEA, Solución buffer, ASB, 0.1% ProClin. Control 1+2 Listo para usar. Contenido: DHEA (alto y bajo), ASB, 0.1% ProClin. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control de Calidad. Conjugado Enzimático Listo para usar. Contenido: DHEA conjugado con HRP, estabilizadores. Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores. Solución de Parada TMB Listo para usar. 1 M H 2SO MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 50; 100; 250 µl 2. Vortex 3. Tubos de vidrio desechables (para la dilución de las muestras) 4. Dilyuente de Muestras (puede ser pedido en IBL con el número de referencia REF KLZZ731). 5. Un método de muestreo apropiado debe ser utilizado. 6. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 7. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 8. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 9. Agua bidestilada o desionizada 10. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. Version / 6
5 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de componentes concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 100 ml WASHBUF CONC agregue 1000 ml agua bidest. 1:10 Mezcle vigorosamente. 2-8 C 4 semanas Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con Estándar A o con Dilyuente de Muestras. (Dilyuente de Muestras puede ser pedido en IBL con el número de referencia REF KLZZ731). La dilución debe llevarse a cabo en tubos de vidrio. Para obtener los resultados correctos multiplique las mediciones obtenidas por el factor de dilución. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 50 μl de Estándar, Control y muestra en cada pozo respectivo de la Placa de Microtitulación. 2. Pipetee 100 μl de Conjugado Enzimático en cada pozo. Mezcle bien por 10 segundos. 3. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incubar 120 min a TA (18-25 C). 4. Remueva el folio adhesive. Descarte la solución de incubación. Lave la placa 3x con 250 μl de Buffer de Lavado diluido. Remueva totalmente el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 5. Pipetee 100 μl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. Agitar brevemente. 6. Incubar 30 min a TA (18-25 C). 7. Detenga la reacción del sustrato, añadiendo 100 μl de Solución de Parada TMB en cada pozo. Agitar brevemente. El color cambia de azul a amarillo. 8. Mida la densidad óptica con fotometro a 450 nm (longitud de onda referencial: nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Parada. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. Version / 6
6 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, Aplique cada señal de los estándares (los duplicados con un valor obviamente fuera de límites debe omitirse y emplearse el valor único más plausible). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Conversión: 1000 pg/ml = 1 ng/ml DHEA (pg/ml) x 3.47 = pmol/l Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar DHEA DO/DOmax DOMedio (pg/ml) (%) A B C D E F VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: Mujeres Hombres mañana tarde Edad n 5%-95% percentil Mediana 5%-95% percentil Mediana [pg/ml] [pg/ml] [pg/ml] [pg/ml] (total) (total) Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Los siguientes componentes substancias no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas (+/- 20%). NaN % Ácido cítrico 0.01 % ProClin % Version / 6
7 16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) Substancia Reactividad Cruzada (%) Estrona 0.30 Androstenediona 0.16 Testosterona Deoxycorticosterone Pregnenolona Androsterona Nortestosterona Reactividad cruzada de otras substancias testeadas 0.01 % DHEA-S, Estriol, 17α-Hydroxypregnenolone, 11-Deoxycortisol, 21-Deoxycortisol, Progesterona, Cortisol, Corticosterona, Estradiol, Dihidrotestosterona, 17α-Hydroxyprogesteron, 5a-Androsterona 3a, 17beta-diol, Etinilestradiol (17α-Ethylestradiol), dexametasona. 1.5 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2DS Sensibilidad Funcional 8.7 pg/ml Medio Conc. < 20 % CV Precisión Intervalo (pg/ml) CV (%) Muestras n Intra-Ensayo Inter-Ensayo Linearidad Intervalo (pg/ml) Dilución en Serie hasta Intervalo (%) Recuperación Comparación del Método versus LCMS : Intervalo Concentración añadida Recuperación después del (pg/ml) (pg/ml) enriquecimiento (%) IBL-Assay = 0.91 x LCMS r = 0.96; n = REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. John G Lewis, 2006, Steroid Analysis in Saliva: An overview, Clin Biochem Rev Vol 27 August 2006, Page: Peter Wood, 2009, Salivary steroid assays research or routine?, Annual of Clinical Biochemistry 2009; 46: Mendes WB, Gray HM, Mendoza-Denton R, Major B, Epel ES Why egalitarianism might be good for your health: physiological thriving during stressful intergroup encounters. Psychol Sci. 18(11): Markopoulou K, Papadopoulos A, Juruena MF, Poon L, Pariante CM, Cleare AJ The ratio of cortisol/dhea in treatment resistant depression. Psychoneuroendocrinology. 34(1): Heaney, J.L.J., Carroll, D., Phillips, A.C., Ageing, physical function, and the diurnal rhythms of cortisol and dehydroepiandrosterone. Psychoneuroendocrinology, 37, Mohammad Ali Kohanpour, Soghra Sujodi, Mohammad Hassan Boostani, Mona Mirsepasi, Amir Hamzeh Zare, Mojtaba Abnar, Effect of eight weeks continuous resistance trainings on levels of cortisol, dehydroepiandrosterone and dehydroepiandrosterone to cortisol serum ratio of active young women, Int. J. Biosci. Vol. 3, No. 9, p , Tohid Aziz Zadeh, Ladan ZoodFekr, Mohammad Hassan Boostani, The effects of the enduring exercises on salivary dehydroepiandrosterone to cortisol ratio among non-athletes women, Int. J. Biosci. Vol. 5, No. 1, p , 2014 Version / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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