Método post-mortem (continuación) Objetivos: Conocer los distintos tipos de micrótomos y su utilización.

Transcripción

1 Método post-mortem (continuación) Objetivos: Conocer los distintos tipos de micrótomos y su utilización.

2 COLORACIÓN

3 CORTE Y MONTAJE DE CORTES HISTOLÓGICOS Micrótomo: Aparato mecánico de precisión con el cual se obtienen series de cortes de un grosor determinado y uniforme que se depositan en un portaobjeto. En general constan de un soporte (portabloques) para colocar la muestra, una cuchilla de acero o vidrio que permite confeccionar los cortes y un sistema de avance regulado de la muestra o de la cuchilla a fin de controlar el espesor del corte. 1- Micrótomos de parafina : Cortes muy delgados (5-20 µm). 2- Micrótomos de congelación y criostatos: Cortes delgados (8-50 µm). 3- Ultramicrótomos: Cortes semifinos (1-3 µm) y ultrafinos ( nm). 4- Vibrátomos: Cortes gruesos ( µm). 3

4 1- Micrótomos de parafina A) DE DESLIZAMIENTO: Se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos micrótomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posición del bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte. B) DE ROTACION: El micrótomo de rotación provoca el corte gracias a la transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y descenso del porta-muestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del porta-muestras hacia la cuchilla según el espacio seleccionado. En el porta-muestras existe un sistema que permite orientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos micrótomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse el ángulo de ataque a la muestra. 4

5 Micrótomo de cuchilla fija En él, se moviliza el portabloques sobre la cuchilla, permaneciendo ésta fija y por lo tanto con menos vibraciones que en los que es la cuchilla la que se desliza. Micrótomo de cuchilla móvil En él, se moviliza la cuchilla sobre el portabloques que permanece fijo. Presenta mayor vibración que el anterior. 5

6 Obtención de los cortes con micrótomo VIDEO: OBTENCION DE CORTES 6 Cuchillas descartables Cuchillas permanentes

7 7 Cuchillas descartables

8 Cuchillas permanentes a) Bicóncava en ambas caras : Para cortar bloques de parafina blanda en el micrótomo de rotación. b) Planocóncavas: Dentro de este grupo hay dos variantes de tipo A y B, según sea mayor o menor el grado de concavidad de la cara no plana. La de tipo A se emplea para cortar bloques de parafina en el micrótomo de deslizamiento, mientras que las de tipo B se utilizan para cortar bloques incluidos en celoidina. c) Biplanas en cuña: También denominadas en cuña o de tipo C. Se emplean indistintamente para realizar cortes de criostato o cortes de parafina con el micrótomo de tipo Minot. De los cuatro, es el tipo más utilizado. d) Biplana con faceta o chaflán: Llamada también con faceta o de tipo D. Se emplea sobre todo para cortar tejido congelado con el micrótomo de congelación, o cuando el material a cortar es muy duro. 8

9 9 Algunos problemas.

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11 Adhesión de los cortes al portaobjeto 1) Portaobjetos tratados con Albúmina de Meyer: mezcla de albúmina, glicerina y cristales de timol). 2) Portaobjetos tratados con gelatina (1%): para micrótomo de parafina. 3) Portaobjetos tratados con gelatina (2%): para crióstato 4) Portaobjetos con poli-l-lisina 5) Portaobjetos con cargas electrostáticas 11

12 Estiramiento de los cortes 1) En el portaobjeto sobre una plancha caliente. 2) En un baño térmico. 12

13 2- Micrótomo de resina Materiales necesarios para cortar Caja de Petri Agua destilada Cuchillas de tungsteno Pinza fina Portaobjetos limpios Rollo de papel Taco de resina en soporte 13

14 Tener en cuenta: Clima (los días de humedad es complicado cortar) los cortes se pueden enrollar esto se puede regular con la velocidad del corte (eso se va manejando en el momento y es prueba y error). Es más complicado hacer cortes seriados en resina porque no se obtiene una tira como en parafina. Hay que ser más cuidadoso y estar más atentos al orden de los cortes. No hay que utilizar albúmina para que se fijen los cortes al portaobjeto solo hay que dejarlos secar bien antes de colorear (se les puede dar un golpe de estufa 24 h antes de realizar la coloración). Si la resina no está en proporciones correctas (el taco queda más duro o más blando) al cortar la muestra puede romperse o tornarse complicado la obtención de cortes. 14

15 VIDEO 15

16 3- Micrótomos de congelación y criostatos Los microtomos de congelación son aparatos relativamente sencillos que están conectados a un tanque de dióxido de carbono. Una cuchilla de acero deslizante permite la obtención de cortes delgados que se manejan con un pincel o aguja enmangada. Los criostatos constan de una cámara refrigerada en cuyo interior queda alojado un micrótomo de rotación. Mediante una manivela o un mecanismo automatizado se controla el movimiento y avance de la muestra. Los cortes quedan sobre una cuchilla metálica y se manipulan con pincel o aguja. 16

17 Material fijado en formaldehído 4%, formol- Ca Lavado en PBS, 1 h. CRIOPROTECCIÓN Sacarosa 30% Enclusión con medio de montaje para congelación. Formación de taco Conservación en freezer Montaje del taco sobre el porta-taco 17

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19 4- Vibrátomo El material no está incluido. Si fijado o congelado. El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se sitúa la muestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde muy afilado que se desplaza horizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La característica del vibrátomo es que la cuchilla, además de avanzar sobre la muestra, posee un movimiento de vibración lateral a modo de sierra que facilita el corte y evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra fijada, normalmente mediante pegamento de contacto, directamente a un bloque porta-muestras que se coloca sobre la plataforma elevadora. 19

20 20 4- Ultramicrótomo

21 21 Confección de cuchillas de vidrio

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23 23 Video sobre cómo se hacen las cuchillas de vidrio

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26 26 Obtención de cortes ultrafinos con el ultramicrótomo

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