El objeto del presente documento es definir cuáles son las normas básicas de funcionamiento del SH.

Transcripción

1 1. INTRODUCCION El centro cuenta con un Servicio de Histología (SH) compuesto por una serie de equipos para el procesamiento, corte y tinción de muestras biológicas. 2. OBJETO El objeto del presente documento es definir cuáles son las normas básicas de funcionamiento del SH. 3. ALCANCE El contenido de esta norma afecta a todo el personal del CABIMER. 4. RESPONSABILIDAD Es responsabilidad de cada usuario conocer y cumplir adecuadamente las normas. Es responsabilidad de cada Investigador Principal el informar y hacer cumplir las normas entre los miembros de su grupo, y denunciar ante el Responsable del Servicio un mal uso reiterado o la avería del equipamiento. Es responsabilidad del Técnico de Histología informar y asesorar sobre los procedimientos que se ofertan, mantener en buen estado el laboratorio de histología y detectar el mal uso de los equipos, poniéndolo en conocimiento de los usuarios implicados, de sus Investigadores Principales y del Responsable del Servicio. El Técnico de histología se responsabilizará de la correcta manipulación de las muestras biológicas y de entregar, en el menor plazo posible, los bloques de inclusión, las series de cortes y tinciones que se soliciten. 5. COMPOSICIÓN DEL LABORATORIO DE HISTOLOGÍA Grandes equipos: - Procesador de tejidos automático Leica TP Estación de inclusión en parafina Leica EG 1150 H - Microtomo motorizado para cortes en parafina Leica RM Criostato motorizado Leica CM 3050 S - Vibratomo Leica VT 1000 S - Estufa Selecta programable hasta 250ºC. - Microscopio de rutina Zeiss Axioscop 40 (2), equipados con una cámara digital Canon powershot A620 de 7.1 megapíxeles - Microscopio de rutina Axiovert 40 C - Cytospin Thermo Shandon 4 - Campana de extracción FLOWTRONIC

2 Pequeños equipos: - Frigorífico 4º - Congelador de cajones de -20º - Arcón congelador de -20º almacenaje de nieve carbónica - Baño de flotación para la recogida de cortes en parafina Leica Balanza de precisión OHAUS Adventurer SL. - Agitador magnético calefactado VMS-C4 6. NORMAS GENERALES Los únicos aparatos del laboratorio de histología a los que tienen acceso directo los usuarios, en el horario establecido por el SH, son: Criostato, Vibratomo, Microtomo, Cytospin. El uso normal del resto de los equipos por parte del SH hace que sea imposible su utilización por otras personas, por lo que su uso queda restringido al personal técnico y expresamente prohibido a los usuarios. En el caso de que se realice una mala utilización de los equipos, tanto los de acceso directo como los de uso restringido, se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias. Toda persona que quiera acceder a los equipos de corte, Cytospin o a la estufa deberá solicitar cita previa con la técnico de histología, que es la única persona encargada de formar a los usuarios y de autorizar el uso de los equipos cuando estén capacitados. Queda totalmente prohibido usar los equipos para un fin que no sea exclusivamente el suyo. Los equipos o material del SH no podrán salir de la Unidad Cada usuario debe apuntar el uso de la batería de desparafinado e hidratación, en el registro situado dentro de la campana extractora. Cada 4 usos por cestilla se procederá a la limpieza de las cubetas y al recambio de los líquidos, dependiendo también de la cantidad de muestras que se hayan desparafinado. Las personas interesadas en el procesado de muestras deben avisar a la técnico con un día de antelación como mínimo y rellenar una hoja de petición de muestras (ver anexo 1) que tendrán a su disposición en la Intranet o en el SH. Una vez finalizado el procesado, el técnico entregará a la persona los portaobjetos con las preparaciones que estarán debidamente etiquetadas. Los restos sin procesar y los bloques ya procesados pueden quedar almacenados en el laboratorio de histología. El laboratorio de Histología posee un libro de registro (ver anexo 2) de muestras donde quedarán almacenados todos los datos relacionados con las muestras y su procesado. Las tarifas que se aplicarán se establecen por fases: Inclusión-corte-tinción (ver anexo 3). Cada usuario decidirá el tipo de proceso que desea, si completo o solo alguna de las fases. 7. PROCEDIMIENTO DE TRABAJO PARA MUESTRAS EN PARAFINA El usuario interesado en procesar muestras en parafina tiene que avisar al técnico con un día de antelación para el caso de necropsias o biopsias urgentes para los demás casos se debe solicitar cita previa, que dependerá de la disponibilidad del equipo.

3 El usuario debe explicar cuál es el objetivo que quiere alcanzar y rellenar una hoja de petición de muestras. A continuación la técnico se encargará de fijar el programa de procesamiento más adecuado para cada muestra. El usuario tiene que entregar al técnico los órganos o tejidos sumergidos en el líquido fijador, los cuales tienen que estar separados en botes según las condiciones experimentales y debidamente rotulados. Estos botes se guardarán a 4ºC durante 24 horas aproximadamente que es el tiempo que necesitan los tejidos para fijarse. Transcurrido este tiempo, la técnico cortará los órganos/tejidos en bloques que variarán en nº y tamaño según se requiera. Los bloques se introducirán en casetes y éstos en el procesador de tejidos automático. El procesador se pondrá en marcha entre las 16 y 17 horas del mismo día, y finalizará entre las 8 y 9 de la mañana del siguiente. Una vez finalizado el ciclo de procesado se sacarán los casetes del procesador y se realizarán los bloques de parafina. Estos bloques se guardarán en el frigorífico a -4% durante varias horas para facilitar el endurecimiento de la parafina. A continuación se procederá al corte en el Microtomo. Los portaobjetos con las muestras se meterán en una estufa a 60ºC durante media hora para que la parafina quede estirada o a 37ºC durante varias horas. Por último, a elección del usuario, se procederá a la deshidratación, a la tinción y al montaje de los cortes. En resumen, el procesado completo de los tejidos dura entre 48 y 72 horas. Dependiendo del volumen de muestras que se entreguen y de la disponibilidad del equipo se podrá modificar el procedimiento para adaptarlo a las necesidades del usuario. 8. NORMAS DE USO DEL PROCESADOR DE TEJIDOS AUTOMÁTICOS El uso del procesador de tejidos queda restringido al personal técnico. En el caso de que se realice un uso no autorizado se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias. Las muestras a procesar tienen que estar fijadas previamente con paraformaldehído al 4% el tiempo que sea adecuado en cada caso (normalmente 24 horas) Según el tamaño de las muestras se realizarán una serie de bloques que se introducirán en casetes los cuales estarán debidamente etiquetados. Antes de poner en funcionamiento el procesador hay que asegurarse de que cada cubeta está rellena del líquido correspondiente (formol tamponado, alcohol, xileno y parafina) y de que éste se encuentre en buen estado. Cuando se encienda el procesador hay que colocar el cestillo donde se van a introducir los casetes con las muestras y moverlo hasta la primera estación. El ciclo estándar de procesado dura 16 horas. Por ello, el aparato se pondrá en marcha entre las 16 y 17 horas del día en cuestión y finalizará entre las 8 y 9 de la mañana del siguiente día. La frecuencia de funcionamiento a la semana del procesador quedará supeditada a la cantidad de muestras existentes. Una vez finalizado el ciclo:

4 -No apagar el aparato hasta que se saquen los casetes del cestillo, ya que se quedan atrapados en la parafina cuando ésta se solidifica. -Limpiar el cestillo de restos de parafina usando xileno y después lavar con agua destilada. -Cada 5 ciclos se procederá a la limpieza de las cubetas y al recambio de los líquidos, dependiendo también de la cantidad de muestras que se hayan fijado. 9. NORMAS DE USO DE LA ESTACIÓN DE INCLUSIÓN EN PARAFINA Su uso queda restringido al personal técnico. En el caso de que se realice un uso no autorizado se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias Antes de encenderla hay que rellenar la cubeta de parafina. Tras el encendido hay que esperar una hora como mínimo hasta que la parafina esté derretida y a que la placa refrigeradora esté fría. Una vez finalizado su uso, se retirarán los restos de parafina con una espátula y se limpiará con una bayeta y después con papel la placa refrigeradora. Los bloques de tejidos con parafina se guardarán en el frigorífico a -4º hasta ser cortados. Está prohibido para los usuarios apagar el equipo, ya que está programada la hora de encendido y apagado automático. 10. NORMAS DE USO DEL MICROTOMO Y DEL BAÑO DE FLOTACIÓN No está permitido el uso del microtomo sin tener los conocimientos suficientes para su manejo. La técnico de la unidad autorizará el uso a las personas que lo demanden En el caso de que se realice un uso no autorizado o un mal uso del equipo, se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias Es obligatorio que todas las personas interesadas en usar el microtomo por primera vez hablen previamente con el técnico para coordinar su formación El microtomo dispone de una hoja de reserva a través de la Intranet donde los usuarios tienen que apuntar las horas de utilización del aparato. Se podrá reservar un máximo de 2 h por usuario. Si no se van a emplear las horas reservadas hay que anularlas inmediatamente. 15 minutos antes de comenzar a cortar hay que llenar de agua el baño y ponerlo a 40ºC Encender el microtomo, llevar el brazo donde se coloca la muestra lo más posterior posible y colocar la muestra. Colocar la cuchilla. Siempre que no se esté cortando, la cuchilla debe estar tapada con el sistema de seguridad. Las cuchillas corren a cargo del usuario. La Unidad dispone de unos guantes anti-cortes a disposición del usuario que lo requiera. Utilizar un lado de la cuchilla para el devastado y otro para el corte. Al finalizar la sesión de trabajo:

5 -Llevar el brazo con la muestra lo más atrás posible. -Quitar la muestra del brazo. -Quitar la cuchilla. -Limpiar los restos de cortes. -Bloquear la manivela que mueve el brazo. -Apagar el panel de mandos y el microtomo. - Limpiar el equipo con alcohol de 70º No dejar portaobjetos, ni trozos de muestras en el microtomo. Meter los portaobjetos en una estufa a 37ºC durante varias horas para facilitar el estirado de la parafina. Ante cualquier eventualidad llamar inmediatamente al Técnico. 11. NORMAS DE USO DEL CRIOSTATO No está permitido el uso del criostato sin tener los conocimientos suficientes para su manejo. Es obligatorio que todas las personas interesadas en usar el criostato por primera vez hablen previamente con el técnico para coordinar su formación. En el caso de que se realice un uso no autorizado o un mal uso del equipo, se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias. El criostato dispone de una hoja de reserva a través de la Intranet donde los usuarios tienen que apuntar las horas de utilización del aparato. Se podrá reservar un máximo de 3 h por usuario. Si no se van a emplear las horas reservadas hay que anularlas inmediatamente. Las cuchillas corren a cargo del usuario. Es obligado el uso de guantes de latex. Antes de empezar a cortar hay que realizar una serie de preparativos, que son: -Asegurarse de que los portamuestras están completamente secos. -Poner la temperatura adecuada para el corte (-20ºC en la cabina y en la muestra), introducir los portamuestras en la cabina y esperar alrededor de media hora. - Pegar el bloque que contiene la muestra en el portamuestras con OCT, que cuando pasa de ser transparente a blanca la muestra está preparada para ser cortada, colocándola en el brazo. Si la muestra estaba congelada a una temperatura inferior a - 20ºC, se debe esperar a que su temperatura se iguale a la de la cabina. Al finalizar la sesión de trabajo: -Llevar el brazo con la muestra lo más posterior posible. -Quitar la muestra del brazo. -Quitar la cuchilla y guardarla preferentemente en frío. -Limpiar con la brocha los restos de cortes que hayan caído en la cabina. -Limpiar la cabina, el cristal antirrolling y la puerta de cristal con alcohol de 70º. -Enjuagar con agua destilada los portamuestras y dejarlos secar al aire libre. -Dejar el cristal antirrolling abierto y aflojar el mecanismo que sujeta a la cuchilla. -Bloquear la manivela que mueve el brazo. -Bloquear el panel de mandos pulsando durante varios segundos el botón que tiene un símbolo de una llave. Muy importante: no introducir agua en el interior de la cabina. No dejar portaobjetos ni trozos de muestras en el criostato.

6 Ante cualquier eventualidad llamar inmediatamente al Técnico. Está prohibido que los usuarios apaguen el equipo. 12. NORMAS DE USO DEL VIBRATOMO No está permitido el uso del vibratomo sin tener los conocimientos suficientes para su manejo. Es obligatorio que todas las personas interesadas en usar el vibratomo por primera vez hablen previamente con el técnico para coordinar su formación. En el caso de que se realice un uso no autorizado o un mal uso del equipo se podrán tomar medidas que supongan la responsabilidad económica de su grupo por las reparaciones necesarias El vibratomo dispone de una hoja de reserva a través de la Intranet donde los usuarios tienen que apuntar las horas de utilización del aparato. Se podrá reservar un máximo de 2 h por usuario. Si no se van a emplear las horas reservadas hay que anularlas inmediatamente. Las cuchillas corren a cargo del usuario. Encender el Vibratomo, colocar la cuchilla y fijarla con el dispositivo de seguridad. La muestra se debe fijar mediante pegamento de contacto al portamuestras, el cual posteriormente se asegura atornillándolo a la plataforma elevadora. Se debe llenar la cubeta negra de tampón de trabajo de manera que la cuchilla y la muestra estén sumergidos durante todo el proceso. Al finalizar la sesión de trabajo: -Quitar la cuchilla. -Quitar todas las piezas, limpiar adecuadamente con agua destilada y después con etanol de 70º, secar y guardar. -Vaciar la cubeta y limpiar con etanol de 70º. -Apagar el equipo. Ante cualquier eventualidad llamar inmediatamente al Técnico. 13. NORMAS DE USO DEL CYTOSPIN - No está permitido el uso del cytospin sin tener los conocimientos suficientes para su manejo. La técnico de la unidad autorizará el uso a las personas que lo demanden En el caso de que se realice un uso no autorizado o un mal uso del equipo, será responsabilidad del Grupo al que pertenezca el usuario pagar las actuaciones y reparaciones necesarias. - Es obligatorio que todas las personas interesadas en usar el cytospin por primera vez hablen previamente con el técnico para coordinar su formación. - El cytospin dispone de una hoja de reserva a través de la Intranet donde los usuarios tienen que apuntar las horas de utilización del aparato. Se podrá reservar un máximo de 2 h por usuario. Si no se van a emplear las horas reservadas hay que anularlas inmediatamente. - El usuario debe explicar cuál es el objetivo que quiere alcanzar y rellenar una hoja de petición de muestras. A continuación la técnico se encargará de asesorar a la persona sobre el programa que mejor se adapte a sus necesidades. - Al finalizar la sesión de trabajo:

7 Se limpiará el equipo con etanol de 70º. Cerrar y apagar el equipo. Ante cualquier eventualidad llamar inmediatamente al Técnico. 14. RESIDUOS Es obligatorio desechar los residuos en sus depósitos correspondientes para evitar percances. Los depósitos de residuos situados en el laboratorio de Histología son: -Material punzante (botes amarillos). -Etanol y colorantes (bidón azul de 25 litros). -Paraformaldehído (bidón azul de 5 litros). -Xileno (bidón azul de 5 litros). -Hematoxilina y eosina (bidón azul de 5 litros). -Ácido Clorhídrico (bote de 1 litro blanco). -Otros: en contenedores separados (botes de 1 litro blanco). Los restos orgánicos de gran volumen y los animales completos tienen que guardarse en el congelador en bolsas de basura, hasta que pueda ser llevados por el propio usuario al contenedor de restos biológicos situado en el Animalario.

8 Anexo 1: HOJA DE PETICIÓN DE MUESTRA Datos Investigador Principal: Solicitado por: Fecha y hora: Técnicas solicitadas: Preparar bloque de parafina Nº Bloques de parafina Preparar bloque congelado (criostato) Nº Bloques por congelación Cortar bloque: En microtomo En criostato En vibratomo Nº de series Nº de cortes por portaobjeto Espesor de corte Montar vibratomo Contrastar parafina Contrastar congelado Contrastar vibratomo Tinciones : Hematoxilina-eosina Masson Azul de Toluidina Nissl Panóptico Rapido OSERVACIONES:

9 Anexo 2: Libro de Registro Biopsia Solicitante Fecha de Entrada Proceso Fecha de Salida observaciones