Generadores de Patrones Centrales(CPG)

Transcripción

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2 Generadores de Patrones Centrales(CPG) Redes neuronales capaces de generar estímulos rítmicos repetitivos a una frecuencia constante. No requieren información sensorial para su coordinación. Se encuentran en la médula espinal. En vertebrados generan movimientos complejos como caminar y nadar Son un buen modelo para comprender cómo una red de neuronas produce

3 En el modelo de la izquierda, las neuronas sensitivas (NS) que inervan los músculos excitan a las interneuronas (IN) quienes, a su vez, excitan a las moto neuronas (MN) de músculos antagónicos. En el modelo CPG, existe un circuito central que genera patrones rítmicos de actividad en las neuronas motoras (MN) de músculos antagónicos. Bibliografia consultada:

4 Inhiben regulación de los patrones oscilatorios del CPG. Neuronas V1 Son interneuronas inhibitorias proyectadas ipsilateralmente, presentes en la médula espinal. Expresan el factor de transcripción Engrailed 1 (En1). Inervan neuronas motoras.

5 Influencia de V1 en la coordinación El movimiento de caminar está caracterizado por estímulos oscilatorios alternados en flexión-extensión e izquierda-derecha. Estas oscilaciones pueden ser inducidas en la médula espinal por la adición de agonistas de neurotransmisores excitatorios (NMDA y 5-HT). Fueron medidas a partir de electroneurogramas en las raíces ventrales, parte de los nervios espinales eferentes que llevan estímulos a los músculos.

6 Pregunta de los investigadores Las neuronas V1 influyen en la coordinación de la flexión/extensión durante la locomoción? En ratones adultos, están diferenciadas en células de Renshaw e interneuronas inhibitorias Ia, las cuales fueron propuestas como coordinadoras de movimiento en articulaciones ipsilaterales (mismo lado).

7 Ratones Pax 6 -/- y En1-DTA Produjeron embriones deficientes en neuronas V1 con el objetivo de evaluar su función en la regulación del movimiento. Lograron esto mediante un knock out de Pax 6 y la remoción selectiva de neuronas En 1 cre ;R26-lacZ flox /DTA (En1 DTA).

8 Ratones Pax -/- En los ratones Pax 6-/- se observa una menor actividad del gen reportero B-gal por la existencia de un número menor de neuronas V1 EN-1 (cuantificación en d). No se encuentran diferencias en la tinción de H89 en ambas condiciones, por lo cual las neuronas motoras no estarían afectadas por el K.O.

9 En1- DTA En los ratones En1-DTA se observa una menor fluorescencia de GFP por la existencia de un número menor de neuronas V1 EN-1 (cuantificación en h). La tinción de Hb9 (g) muestra que las neuronas motoras no se vieron afectadas por la ablación selectiva de las neuronas V1.

10 En las médulas de los ratones adultos... Tanto Pax 6 -/- como En1-DTA: la organización y su número de las NM fue normal Sólo Pax 6 -/- presentó diferencias en la cantidad de las interneuronas V0, V3 y V2.

11 Rata lesionada Rata WT

12 Anatomía de la médula y nervios espinales Miden la respuesta en las raíces ventrales L2 y L5 (correspondientes a las vértebras lumbares L2 y L5). Excitación de L2 produce flexión de las extremidades posteriores y L5 extensión. En L2 miden tanto la raíz izquierda como la derecha (para observar coordinación contralateral) y en L5 únicamente en la izquierda (para comparar con L2 y ver coordinación flexión-extensión)

13 Inducción neuronas de la médula 5 um N-metil- D- aspartato (NMDA) (agonista del receptor del NMDA, imita el efecto del glutamato). 5uM serotonina (5-HT) Oscilaciones neuronales asociadas a la locomoción

14 Electroneurogramas obtenidos luego de la inducción de la respuesta motora: I N D U C C I O N La duración y el periodo de las oscilaciones aumentan considerablemente en embriones (dia embrionario 18,5) deficientes en neuronas V1 respecto de los embriones WT. En d. se grafica el periodo de las oscilaciones de embriones Wild Type, Pax6 -/- y En1-DTA. Se ve un aumento en dicho periodo para los últimos casos.

15 e. Para un amplio rango de concentraciones de 5-HT, se observa un aumento del periodo de las oscilaciones para los animales deficientes en V1. La concentración 5-HT necesaria para la inducción de un patrón estable fue mayor para los embriones Pax 6 -/- y En1-DTA.

16 Entonces, las IN V1: Son prescindibles para la coordinación flexor- extensor Esenciales para mantener la velocidad del ritmo de locomoción

17 Clampeo de corriente en NM de la médula espinal en WT y en Pax6 Fig 3.a. Esquema de médula con raíces ventrales y puntos donde se midió actividad por medio de clampeo de corriente y electroneurograma en neuronas motoras (identificadas en base a la forma del pico de PA).

18 Respuestas de las MN de rl2 en Wild Type (b) y en Pax 6 -/- (c) luego de aplicarle NMDA y 5-HT. WT Pax 6-/- En MN de Pax 6 -/- durante la locomoción, se produce una despolarización prolongada durante la cual se siguen produciendo PA. d) Media del número de PA por fase de despolarización de las MN y de la duración de la fase de despolarización durante la locomoción en Wt y en Pax 6

19 Resultado de la medición en la médula espinal (clampeo de corriente) y raíces ventrales (electroneurograma) rl2 de Pax 6 -/-. 5uM NMDA + 15 um 5-HT MN Raíz Ventral En e se midió a potencial de membrana -50 mv (igual al de reposo) y se observa que la actividad en los dos puntos de medición está en fase. En f se midió a -88 mv, por debajo del potencial de reversión del Cl -.

20 De acuerdo a estos resultados.. Las NM en Pax 6-/- reciben normalmente estímulos inhibitorios en fase, que son esenciales para la coordinación flexión-extensión.

21 Ratones transgénicos En1 tlz/tlz Usan ratones transgénicos, En1 tlz/tlz null knock-in para localizar la función de V1 en el Wt. Esto es el equivalente a ratones transgénicos donde se inserta una secuencia inmediatamente después del promotor para En1. Mediante el uso del trasgen Wnt1 En1 se rescató el fenotipo En1 mutante en el cerebro medio y posterior y se obtuvieron ratones adultos En1 tlz/tlz en los que no se rescata la conectividad de neuronas V1.

22 Fig 4. Se usó preparados de médula espinal de un embrión 18.5 En1 tlz/tlz, y se observó un alargamiento en el ciclo y en la duración del paso en un orden de 3 a 4 veces mayor (a y b) similar a lo observado en Pax 6 -/- y En1-DTA. c. Prueba del comportamiento motor de ratas adultas según tiempo (seg) y velocidad (rpm) en una rueda acelerada, en función del tiempo (días). Barras negras: Pax 6; barras blancas: WT.

23 De acuerdo a estos resultados.. Los ratones adultos En1 tlz/tlz ; Wnt1 En1 tienen problemas para mantener el balance y coordinación al correr y no alcanzan las mismas velocidades que los WT.

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25 Uso de ratones transgénicos (AlstR192) Uso de ratones transgénicos (AlstR192) adultos que expresan el receptor acoplado a la proteína G de la alostatina (AlstR), para probar si la supresión de V1 causa un efecto similar de alargamiento del ciclo del paso. La activación inducible del receptor AlstR por medio de un neuropéptido, la Alostatina, hace que dicho receptor se acople a los canales GIRK de disminuyendo la excitabilidad de las neuronas donde se expresa.

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27 Fig 5. Transgen para el receptor de alostatina (a) co-expresión de GFP y En1, mostrando las neuronas V1 que expresan AlstR (b) sección de médula de ratón con alelo reportero ZnG, mostrando la expresión de GFP en neuronas V1.

28 Luego de agregado el neurotransmisor se detectó una caída reversible en la excitabilidad neuronal, teniendo que incrementar la corriente aplicada para revertir el efecto. Se inyectó corriente constante (d) y ascendente (e) sobre neuronas V1 GFP positivas en ratones. Sin el agregado de Alostatina (10nM), las células disparan PA a corrientes inferiores a los 105pA

29 Electroneurograma en ratones transgénicos AlstR192 post natales Efecto del aumento en concentración de Alatostatina y el posterior lavado sobre la actividad locomotora en ratones Al incrementar la concentración de Alostatina aumenta el período oscilatorio Efecto reversible al remover el neurotransmisor

30 Discusión Los resultados demostraron que, los cambios en las salidas/respuestas motoras de los CPG son similares cuando se suprime las interneuronas V1 en adultos que, cuando se las remueven en fases tempranas del desarrollo. El hallazgo de este trabajo, destaca un papel esencial de las neuronas V1 en los mamíferos en la regulación de la duración del paso y de la velocidad, en la locomoción. Esta función es específica de V1 porque, como se comprobó, no hubo cambios significativos en la frecuencia o en la duración del tiempo del paso cuando se suprimieron las neuronas V0 y V3 de la médula espinal.

31 Discusión Si bien, las células Renshaw y las IN Ia inhibitorias cumplen roles de en la coordinación flexor-extensor de las MN, este estudio demuestra que, la población de neuronas V1 como un todo, no cumple una función primaria en la regulación de la coordinación de la actividad CPG flexor-extensor.