Catalyzed Signal Amplification (CSA) System Para su uso con anticuerpos primarios de ratón

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1 Catalyzed Signal Amplification (CSA) System Para su uso con anticuerpos primarios de ratón Código K ml Licencia de uso limitado Este producto se distribuye y vende al usuario final conforme con una licencia de NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. para su uso por parte del usuario final en instrumentos manuales o de procesado automatizado Dako, únicamente sobre portaobjetos de cristal para microscopio u otro soporte (siempre que no sean microarrays o bio-chips) que contengan muestras de células o tejidos para su estudio mediante microscopía (incluida la captura automática de imágenes y los sistemas de análisis) y con el propósito de detectar ácidos nucleicos o proteínas diana. Su adquisición no incluye ni supone ningún derecho de reventa o transferencia de este producto de forma individual o como componente de otro producto. Cualquier uso de este producto diferente al que se refieren los términos de esta licencia sin autorización expresa y por escrito de NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. queda terminantemente prohibida. El sistema CSA es tecnología desarrollada por y bajo licencia de NEN Life Science Products, Inc.. (Patente estadounidense N ). Este producto también está bajo la patente estadounidense N Indicaciones de uso Uso diagnóstico in vitro. Estas instrucciones se aplican al sistema Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, Peroxidase (CSA System, HRP). Este sistema está indicado para su uso con anticuerpos primarios de ratón y para la identificación de antígenos mediante microscopía óptica a partir de tejidos normales y patológicos fijados en formol e incluidos en parafina. Este sistema también puede utilizarse con anticuerpos primarios de conejo siempre que se utilice con CSA Rabbit Link (código K1498). Resumen y explicación Principios básicos del procedimiento Reactivo suministrado El sistema CSA System, HRP es un procedimiento de tinción inmunohistológica extremadamente sensible (IHC, por sus siglas en inglés) que incorpora un método de amplificación de señal que se basa en la deposición de un compuesto fenólico biotinilado mediada por peroxidasa, 1 seguido de una reacción secundaria con estreptavidina peroxidasa. En este procedimiento, primero se detecta un anticuerpo primario de ratón mediante un anticuerpo secundario biotinilado. A continuación, se permite que un complejo estreptavidina-biotina-peroxidasa se una al anticuerpo secundario biotinilado a través de la estreptavidina. El siguiente paso supone la utilización del enlace con la peroxidasa para catalizar la formación de un precipitado de un fenol biotinizado sobre la muestra, lo que desencadena una amplificación del número de moléculas de biotina disponibles para su unión al siguiente reactivo, la estreptavidina peroxidasa. La tinción se completa utilizando el peróxido de diaminobenzidina/hidrógeno como cromógeno/sustrato. En las comparaciones realizadas con los métodos convencionales con biotina estreptavidina marcada (LSAB, por sus siglas en inglés) la sensibilidad del sistema CSA System, HRP ha demostrado ser del orden de 50 veces superior. Este procedimiento supone una gran amplificación de la señal, lo que permite la detección de cantidades extraordinariamente pequeñas del antígeno que se busca. Las técnicas utilizadas en este sistema se basan en las metodologías de la avidina-biotina y de la peroxidasa. Las muestras se incuban primero con el bloqueante de peroxidasa (Peroxidase Block) durante cinco minutos para anular la actividad de la peroxidasa endógena. A continuación, las muestras se incuban durante cinco minutos con un bloqueador de proteínas que imposibilita que se unan, en reacciones futuras, los reactivos no específicos. Seguidamente, se incuban con un anticuerpo primario de ratón adecuadamente caracterizado y diluido o con un reactivo de control negativo. Tras esto, se procede a incubaciones secuenciales de 15 minutos con un anticuerpo de unión biotinilado, un complejo estreptavidina-biotina-peroxidasa, un reactivo de amplificación y estreptavidina-peroxidasa. La tinción se completa con una incubación de 5 minutos de duración con 3.3 Diamino-benzidina-Tetrahidrocloridrato (DAB) que produce un precipitado de color marrón en la zona del antígeno. En este sistema se suministran los materiales que se citan a continuación y que son suficientes para el procesado de hasta 150 secciones: Cantidad 1x15 ml Descripción Bloqueante de peroxidasa Óxido de hidrógeno al 3%, en agua. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 1/10

2 1x15 ml Bloqueante de proteína Suero libre de proteínas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,015 mol/l de azida sódica. 1x15 ml Anticuerpo de enlace Inmunoglobulinas biotiniladas de conejo anti ratón en tampón Tris-HCl que contiene proteína estabilizadora y 0,015 mol/l azida sódica. 1x1 ml Complejo de estreptavidina-biotina, reactivo A (Streptavidin-Biotin Complex, Reagent A) Estreptavidina en tampón PBS con un agente antimicrobiano. 1x1 ml Complejo de estreptavidina-biotina, reactivo B (Streptavidin-Biotin Complex, Reagent B) Biotina conjugada con peroxidasa en tampón PBS con agente antimicrobiano. 1x25 ml Complejo Streptavidina-Biotina, diluyente (Streptavidin-Biotin Complex, Diluent) Tampón PBS con una proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. 1x15 ml Reactivo de amplificación (Amplification Reagent) Tiramida biotinil y peróxido de hidrógeno en PBS con proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano. 1x15 ml Estreptavidina- peroxidasa (Streptavidin-Peroxidase) Estreptavidina conjugada con peroxidasa en tampón PBS con proteína estabilizadora y un agente antimicrobiano 10 Substrate Tablets, DAB Chromogen Cada comprimido contiene 10 mg 3,3'-peróxido de diaminobenzidina/hidrógeno (DAB) empaquetado con secante. 1x6 ml Substrate, Tris Buffer Concentrate Concentrado de tampón Tris-HCL. 1x2 ml Substrate, Hydrogen Peroxide Óxido de hidrógeno al 0,8%, en agua. Accesorios 1 Tubo de ensayo calibrado de 5 ml con tapón para su utilización en la preparación del complejo estreptavidina-biotina 1 Contenedor para sustrato 1 Tubo de ensayo calibrado de 10 ml con tapón para su utilización en la preparación del reactivo ustrato-cromógeno 1 Pinzas ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 2/10

3 Materiales necesarios que no se suministran Para obtener un resultado óptimo en la tinción con el sistema CSA System, HRP (código K1500), recomendamos utilizar el sistema auxiliar CSA Ancillary System (código K1499). El sistema incluye una solución de recuperación de blancos (Target Retrieval Solution), tampón salino Tris (Tris Buffered Saline) con Tween 20, sistema bloqueante de biotina (Biotin Blocking System) y diluyente de anticuerpo (Antibody Diluent) con componentes reductores de tinción de fondo (Background Reducing Components). Para realizar una tinción mediante anticuerpos primarios de conejo, recomendamos se utilice el CSA Rabbit Link (código K1498) como sustituto del Link Antibody que se proporciona. Sistema bloqueante de biotina (Biotin Blocking System) (código X0590 o en K1499) Tejido de control, positivo y negativo Agente de contratinción, como la hematoxilina Mayer o la hematoxilina de Mayer modificada por Lillie (código S3309) Medio de montaje, como medio de montaje Glycergel (código C0563) o Faramount, Medio de montaje en solución acuosa, listo para su uso (código S3025) Anticuerpos primarios y reactivos de control negativo Diluyente del anticuerpo primario, como el diluyente de anticuerpo (Antibody Diluent) con componentes reductores de la tinción de fondo (Background Reducing Components) (código S3022 o en K1499) Portaobjetos, recubiertos con poli-l-lisina o silanizados (código S3003) Solución de lavado, como TBST (solución salina con tampón Tris y Tween 20), concentrado 10x (código S3306 o en K1499) Materiales opcionales necesario que no se suministran Hidróxido amónico, 0,037 mol/l Solución de recuperación de blancos, como la solución de recuperación de blancos (Target Retrieval Solution) (código S1699, S1700 o en K1499) Baño de agua (capaz de mantener una temperatura de C) un vaporizador o autoclave para realizar l a recuperación de blancos. Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Este producto contiene azida sódica (NaN 3), un compuesto altamente tóxico en su forma pura. En las concentraciones en que se presenta el producto, aunque no se clasifican como peligrosas, la azida sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre, formando acumulaciones de azidas metálicas altamente explosivas. Después de desechar el producto, aclare con agua abundante para evitar la acumulación de azida en las cañerías. 2,3 3. No utilice los reactivos después de la fecha de caducidad según el método de almacenamiento especificada. Si los reactivos se almacenan en condiciones diferentes de las especificadas en este prospecto, deben recibir la validación del usuario. 4. No sustituya los reactivos por los de otro número de lote o por los de kits procedentes de otros fabricantes. 5. Los enzimas y el cromógeno sustrato pueden verse perjudicados si quedan expuestos a niveles de luz demasiado intensos. No almacene componentes ni realice la tinción bajo una luz demasiado intensa, como la luz solar directa. 6. La utilización de tiempos y temperaturas de incubación diferentes a los aquí especificados pueden producir resultados erróneos. Los cambios en estos parámetros deben ser validados por el usuario. 7. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. 8. La parte de las soluciones que no se utilicen, deben ser desechadas tal como establezcan las leyes locales, estatales y federales. 9. Los usuarios profesionales pueden solicitar a Dako una hoja de datos sobre seguridad. 10. Como con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben seguirse los procedimientos de manipulación apropiados. Atención Streptavidin Biotin Complex Diluent: 10-30% Glicerol H320 Provoca irritación ocular. P280 Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P305 + P351 + EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente P338 durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. P337 + P313 Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Atención Amplification Reagent: 10-30% Glicerol H320 Provoca irritación ocular. P280 Llevar guantes de protección. Llevar gafas o máscara de protección. Llevar prendas de protección. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P305 + P351 + EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente P338 durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. P337 + P313 Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 3/10

4 Peligro DAB Chromogen Tablets: 10-30% ácido bórico, 5-10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Puede provocar cáncer. H360 Puede perjudicar la fertilidad o dañar al feto. H341 Se sospecha que provoca defectos genéticos. H335 Puede irritar las vías respiratorias. P201 Procurarse las instrucciones antes del uso. P202 No manipular antes de haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. P281 Utilizar el equipo de protección individual obligatorio. P271 Utilizar sólo al aire libre o en un lugar bien ventilado. P261 Evitar respirar vapores. P308 + P313 P304 + P340 + P312 P405 P501 EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico. EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la víctima al exterior y mantenerla en reposo en una posición confortable para respirar. Llamar un CENTRO DE INFORMACIÓN TOXICOLÓGICA o a un médico si la persona se encuentra mal. Guardar bajo llave. Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. Atención Substrate Buffer Concentrate: 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Provoca irritación ocular grave. H315 Provoca irritación cutánea. P280 Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. P264 Lavarse las manos cuidadosamente después de la manipulación. P302 + P352 + P P363 EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. Quitar la ropa contaminada. Lavar la ropa contaminada antes de volverla a usar. P332 + P313 En caso de irritación cutánea: consultar a un médico. P305 + P351 + P338 EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua cuidadosamente durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. P337 + P313 Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. Storage Los reactivos de CSA System, HRP deben almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 C. No se deben congelar. No se deben utilizar después de la fecha de caducidad impresa en los viales de reactivos y en la etiqueta del kit. Cualquier alteración en el aspecto de cualquiera de los reactivos, como puede ser la presencia de precipitados, puede indicar un grado de inestabilidad o deterioro. En estos casos, el/los reactivo(s) no debe(n) utilizarse. Preparación de especímenes No existen signos claros que indiquen que este producto sea inestable. Por lo tanto, los controles positivos y negativos deben realizarse simultáneamente con las muestras del paciente. Si observa tinciones inesperadas que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio o se sospecha de que existe un problema con el producto, contacte con nuestro servicio de asistencia técnica. Antes de proceder a la tinción IHC, los tejidos deben estar fijados y procesados. La fijación evita la autólisis y la putrefacción de los tejidos extraídos, mantiene su antigenicidad, potencia el índice de refracción de los constituyentes del tejido y aumenta la resistencia de los elementos celulares al procesado de la muestra. El procesado del tejido supone la deshidratación de ésta, la retirada de los agentes deshidratantes, la infiltración del medio de inclusión, y su inclusión y seccionado del tejido. Los fijadores más frecuentes utilizados en la preparación de tejidos para IHC se detallan en las instrucciones generales para la tinción inmunohistoquímica. Los datos que se aportan son a título informativo. El procedimiento óptimo debe determinarlo y verificarlo el usuario. Preparación del reactivo Es preferible que los siguientes reactivos esté preparados antes de proceder a la tinción. Solución Wash Buffer Los estudios demuestran que una solución tampón 0,05 mol/l Tris-HC, a ph 7,6, con 0,3 mol/l NaCl y 0.1% de Tween 20 (código S3306 o en K1499) ayuda a minimizar la tinción de fondo. Se recomienda encarecidamente su uso. Las secciones de tejido deben aclararse con TBST preparado recientemente e incubarse a temperatura ambiente por un mínimo de tres minutos en al menos un baño de TBST preparado recientemente entre cada reactivo según el protocolo del CSA System, HRP. Si se desea una supresión mayor de la tinción de fondo, las secciones de tejido deben incubarse durante cinco minutos en tres baños de TBST preparado recientemente entre cada reactivo. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 4/10

5 El tampón de lavado no debe contener azida sódica dado que ésta inactiva la peroxidasa y supondrá una tinción negativa. Almacene la solución tampón no utilizada a una temperatura entre 2 y 8 C. Deseche dicha solución si aparecen turbiedades. Puede utilizarse agua destilada para aclarar el bloqueante de peroxidasa, el sustrato-cromógeno y el agente de contratinción. Anticuerpo primario/reactivo de control negativo Si se desea, el anticuerpo primario y el reactivo de control negativo puede diluirse adicionalmente con el diluyente del anticuerpo (Antibody Diluent) con los componentes de reducción de tinción de fondo (Background Reducing Components) (código S3022 o en K1499). Complejo estreptavidina-biotina Prepare el complejo estreptavidina-biotina al menos 30 minutos antes de su utilización. Una vez preparado, el complejo estreptavidina-biotina es estable por un periodo no superior a dos semanas a temperaturas entre 2 y 8 C. Cada 1 ml de complejo preparado de estreptavidina-biotina es suficiente para un máximo de 10 secciones. PASO 1 Dependiendo del número de portaobjetos que se desea teñir, transfiera un número suficiente de alícuotas de 1 ml de tampón de la Botella 7 (diluyente del complejo estreptavidina-biotina, Streptavidin-Biotin Complex Diluent) al tubo de ensayo calibrado de 5 ml que se suministra. PASO 2 Por cada 1 ml de tampón, añada una gota (40 µl) de la botella 5 (complejo estreptavidina-biotina, reactivo A, Streptavidin-Biotin Complex, Reagent A),y una gota (40 µl) de la botella (complejo estreptavidina-biotina, reactivo B, Streptavidin-Biotin Complex, Reagent B) y proceda a mezclar. Prepare esta solución al menos 30 minutos antes de su utilización El tubo de ensayo calibrado de 5 ml que se proporciona con el sistema puede reutilizarse. Aclare abundantemente el tubo de ensayo con agua destilada después de cada uso. Solución sustrato-cromógeno La solución sustrato-cromógeno que contiene peróxido de hidrógeno puede almacenarse por un periodo de ocho horas (aproximadamente) tras su preparación. Toda solución que no se utilice en esta ocasión debe desecharse. Cualquier remanente de la solución DAB que no contenga peróxido de hidrógeno puede almacenarse en la oscuridad por un periodo de cinco días a una temperatura de entre 2 y 8 C, o por un periodo superior a 20 C. Para preparar más solución sustrato-cromógeno, lleve hasta la temperatura ambiente y añada peróxido de hidrógeno tal como se precise. PASO 1 Permita que la botella 10 (comprimidos de sustrato) alcance la temperatura ambiente antes de abrirla. PASO 2 Coloque 10 gotas de la botella 11 (concentrado de solución tampón Tris) en el tubo de ensayo calibrado de 10 ml, añada agua destilada hasta enrasar con la marca de 10mL y mézclelo. PASO 3 Utilice las pinzas para transferir un comprimido de sustrato a los 10 ml de tampón Tris diluida. Cierre el envase de los comprimidos con fuerza. Ponga el tapón sobre el tubo de ensayo y agítelo o colóquelo en el mezclador vórtex para disolver el comprimido. PASO 4 2 ml de la solución sustrato-cromógeno es suficiente para procesar un máximo de 20 secciones. Mediante una pipeta de un solo uso, transfiera la cantidad apropiada de solución DAB (en incrementos de 2 ml) al envase del sustrato, añada una gota (40 ml) de la botella 12 (peróxido de hidrógeno sustrato) por cada 2 ml de solución DAB, coloque la punta del cuentagotas y proceda a mezclar. Nota: Para evitar la punta del cuentagotas se contamine, no la manipule con los dedos. Siempre que inserte o retire la punta del cuentagotas se recomienda utilizar guantes. El tubo de ensayo calibrado de 10 ml que se proporciona con el sistema puede reutilizarse. Aclare abundantemente el tubo de ensayo con agua destilada después de cada uso. Agente de contratinción El producto final coloreado procedente de la reacción de tinción es insoluble en alcohol y puede utilizarse con agents de contratinción en solución alcohólica o en solución acuosa como la hematoxilina de Mayer. Después de la contratinción con hematoxilina, aclare abundantemente con agua destilada y a continuación sumerja los portaobjetos en un baño de amoniaco a 0,037 mol/l o agente azulante similar. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 5/10

6 Medio de montaje Se recomiendan el medio de montaje Glycergel (Glycergel Mounting Medium) (código C0563) o Faramount, medio de montaje en solución acuosa (Aqueous Mounting Médium), listo para su utilización (código S3025) Los portaobjetos también pueden montarse permanentemente mediante un medio de montaje no acuoso permanente. Preparación de especímenes incluidos en parafina Comentarios generales Antes de proceder a la tinción IHC, los tejidos deben estar fijados y procesados. El procesado del tejido supone su deshidratación, la retirada de los agentes deshidratantes, la infiltración del medio de inclusión, y la inclusión y seccionado del tejido. El procedimiento óptimo debe determinarlo y verificarlo el usuario. (Si se desea información específica respecto a la fijación y procesado del tejido, consulte las referencias 5 y 6). La persistencia de los antígenos y su tinción inmunológica puede depender del tipo y de la concentración de fijador, del tiempo de fijación y del tamaño de la muestra de tejido a fijar.7 Siempre que sea posible es importante mantener unas condiciones de fijación óptimas y estandarizadas para poder obtener unas tinciones reproducibles. Cuando sea posible, recomendamos la utilización de muestras finas asociadas a tiempos de fijación más cortos. Una exposición prolongada a fijadores puede suponer el enmascaramiento de los antígenos y contribuir a la reducción de la tinción. Después de la fijación, los tejidos deben deshidratarse con alcoholes gradados, aclarados con xilol o un sustituto de éste e infiltrado con cera de parafina. A continuación, el tejido se incluye con cera de parafina en moldes o en cajitas para facilitar el corte en secciones del tejido. Para minimizar la desnaturalización de antígenos, no exponga los tejidos a temperaturas superiores a 60 C durante su procesado. Los bloques de tejido pueden almacenarse o seccionarse al terminar su inclusión. Los tejidos correctamente fijados e incluidos en parafina se conservan indefinidamente siempre que se guarden en un lugar fresco. Montaje de las secciones de tejido Recoja los cortes de tejido seccionados a partir de los bloques incluidos en parafina mediante portaobjetos de vidrio limpios. Deshidrátelos en un horno durante una o dos horas a 60 C o inferior o permita su secado al aire durante un periodo de entre 15 y 24 horas. Si se desea incrementar la adhesión de los cortes de tejido durante los procedimientos de tinción IHC, utilice portaobjetos recubiertas con poli-l-lisina, portaobjetos cargados o silanizados (código S3003). Se recomienda encarecidamente el uso de portaobjetos silanizados o cargados en aquellos procedimientos de tinción que requieran la recuperación de blancos. Los portaobjetos con tejidos incluidos en parafina pueden almacenarse indefinidamente si se almacenan en un lugar fresco. Procedimiento de tinción Notas referentes al procedimiento Se recomienda la utilización del siguiente protocolo de tinción para el sistema CSA System, HRP. Este protocolo precisa incubaciones de 15 minutos en los pasos comprendidos entre los pasos 3 y 7, y los resultados tienen una sensibilidad extremadamente alta. En los casos en que no se desea una sensibilidad tan alta, puede realizarse un procedimiento alternativo sustituyendo las incubaciones de los pasos 3 a 7 por incubaciones de 10 minutos. Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C) antes de la inmunotinción. De forma similar, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido que se hayan secado durante su procesado pueden mostrar una mayor tinción no específica. Cubra los portaobjetos que estén expuestos a corrientes de aire. Si se utilizan incubaciones prolongadas, coloque los tejidos en un ambiente húmedo. Si se desea la reducción de la tinción de fondo no específica, se recomienda aclarar las secciones de tejido con TBST e incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de tres minutos en al menos un baño de TBST preparado recientemente entre cada paso con reactivo en el protocolo CSA System, HRP. Este procedimiento incluye los pasos del protocolo del sistema bloqueante de biotina (Biotin Blocking System). Si se desea una supresión mayor de la tinción de fondo, las secciones de tejido deben incubarse durante cinco minutos en tres baños de TBST preparado recientemente entre cada reactivo. Desparafinización de las secciones de tejido Antes de la tinción, los portaobjetos con los tejidos deben desparafinarse para eliminar el medio de inclusión y, posteriormente, rehidratarse. No elimine completamente la parafina. La presencia de medio de inclusión residual ocasionará un aumento de la tinción no específica. Digestión proteolítica y recuperación de blancos Se sabe que el formaldehído induce la aparición de cambios de conformación de las moléculas de antígeno al formarse enlaces cruzados intermoleculares. Un exceso de fijación de formol puede enmascarar los puntos antigénicos y disminuir la tinción específica. En los procedimientos IHC estándar, estos puntos pueden evidenciarse mediante un proceso de digestión proteolítica del tejido previo a la inmunotinción. Nota: El uso de una digestión proteolítica previa puede suponer una gran tinción de fondo en este sistema. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 6/10

7 La recuperación de blancos es una alternativa aceptable a la digestión previa. Ésta llevará a un leve aumento de la tinción de fondo a la vez que un aumento significativo de la tinción específica con muchos anticuerpos primarios. Consulte la hoja de especificaciones que se suministra con cada anticuerpo primario para determinar si se precisa el tratamiento previo para la recuperación de blancos. Este es un procedimiento obligatorio en el caso de algunos anticuerpos primarios. El procedimiento de recuperación de blancos supone la inmersión de los cortes de tejido montados en portaobjetos en la solución a tal efecto (Target Retrieval Solution, código S1699, S1700 o en K1499) y su calentamiento antes de proceder a la tinción IHC. Aclare abundantemente con 0,05 mol/l de tampón Tris-HCl y proceda a iniciar el proceso de tinción. Nota: los tejidos grasos pueden desprenderse de los portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina durante la recuperación del blanco. Es preferible utilizar portaobjetos silanizados o cargados cuando se desea recuperar blancos. Bloqueo de la actividad endógena para el enlace de la avidina (biotina endógena) En las técnicas avidina-biotina convencionales, la evaluación de una tinción específica puede verse alterada por la presencia de biotina endógena. Dada la alta sensibilidad del sistema CSA System, HRP, este es un factor a tener muy en cuenta. Se recomienda bloquear sistemática la biotina endógena mediante la aplicación secuencial de avidina y biotina. Se ha formulado el sistema bloqueante de biotina (Biotin Blocking System) (código X0590 o en K1499) de modo que sea compatible con el sistema CSA System, HRP. Protocolo de tinción PASO 1 BLOQUEANTE DE PEROXIDASA Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente. Con un tejido que no deje pelusa (como un Kimwipe o una gasa) limpie con cuidado la zona que rodea el espécimen para retirar cualquier resto de líquido y para mantener los reactivos dentro de la zona prescrita. Aplique suficiente peróxido de hidrógeno de la botella 1 para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 5 (±1) minutos. Aclárelo suavemente con agua destilada o solución tampón procedente de un frasco de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el el tejido) y colóquelo en un baño de tampón preparado recientemente por un mínimo de tres minutos. Nota: Se recomienda el uso de 0,05 mol/l de tampón Tris-HCl, a ph 7,6 con 0,3 moll NaCl y 0,1% Tween 20 como solución tampón para el lavado y baño. PASO 2 PASO 3 BLOQUEANTE DE PROTEÍNAS Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficientes gotas de la botella 2 (bloqueante de proteínas) como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 5 (±1) minutos. NO ACLARE EL BLOQUEANTE DE PROTEÍNAS ANTICUERPO PRIMARIO O REACTIVO DE CONTROL NEGATIVO Elimine el exceso de bloqueante de proteínas golpeando suavemente los portaobjetos y límpielos de la forma indicada anteriormente. Aplique suficiente anticuerpo primario o reactivo de control negativo como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 15 (±1) minutos a no ser que se especifique de otro modo en la hoja de especificaciones del anticuerpo primario. Aclárelo suavemente con solución tampón TBST procedente de un frasco de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el tejido) y colóquelo en un número no superior a tres baños con tampón TBST preparado recientemente por un periodo de entre 3 y 5 minutos cada vez. Si debe interrumpir el procedimiento de tinción, puede guardar los portaobjetos en un baño de tampón después de la incubación del anticuerpo primario (paso 3) o el anticuerpo de enlace (paso 4) por un periodo máximo de una hora a temperatura ambiente (20 25 C) sin que esto afecte al rendimiento de la tinción. PASO 4 ANTICUERPO DE ENLACE Limpie los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Aplique un número suficiente de gotas de la botella 4 (anticuerpo de enlace) como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 15 (±1) minutos. Aclare el portaobjeto como se ha realizado en el Paso 3. Colóquelo en un número no superior a tres baños con tampón TBST preparado recientemente por un periodo de entre 3 y 5 minutos cada vez. Si se desea utilizar con anticuerpos primarios de conejo, sustituya el CSA Rabbit Link (código K1498) por el anticuerpo de enlace que se suministra. PASO 5 COMPLEJO ESTREPTAVIDINA-BIOTINA Limpie los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Aplique suficientes gotas del complejo estreptavidina-biotina como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 15 (±1) minutos. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 7/10

8 Limpie los portaobjetos como se indica anteriormente. Colóquelo en un número no superior a tres baños con tampón TBST preparado recientemente por un periodo de entre 3 y 5 minutos cada vez. PASO 6 REACTIVO DE AMPLIFICACIÓN Limpie los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Aplique suficientes gotas de la botella 8 (reactivo de amplificación) como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 15 (±1) minutos. Aclare los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Colóquelo en un número no superior a tres baños con tampón TBST preparado recientemente por un periodo de entre 3 y 5 minutos cada vez. PASO 7 ESTREPTAVIDINA-PEROXIDASA Limpie los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Aplique suficientes gotas de la botella 9 (estreptavidina-peroxidasa) como para cubrir el espécimen. Incúbelo durante 15 (±1) minutos. Aclare los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Colóquelo en un número no superior a tres baños con tampón TBST preparado recientemente por un periodo de entre 3 y 5 minutos cada vez. PASO 8 SOLUCIÓN SUSTRATO-CROMÓGENO Limpie los portaobjetos como se ha indicado anteriormente. Aplique una cantidad suficiente de la solución sustrato cromógeno como para cubrir el espécimen (consulte la sección sobre la preparación del reactivo). Incúbelo durante 5 (±1) minutos. Aclárela suavemente con agua destilada procedente de un frasco de lavado (no aplique el flujo directamente sobre el tejido). Recoja el sustrato-cromógeno descartado en un envase para materiales peligrosos para su eliminación adecuada. PASO 9 CONTRATINCIÓN CON HEMATOXILINA (opcional) Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina, por ejemplo el código S3309. La duración de la incubación dependerá de la concentración de la hematoxilina que se use. Aclárelos suavemente en un baño de agua destilada. Sumerja los portaobjetos en un baño de 0,037 mol/l de amoniaco o agente azulante similar. Aclare los portaobjetos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada entre 2 y 5 minutos. PASO 10 MONTAJE Los especimenes pueden montarse y cubrirse con un cubreobjetos y en un medio de montaje en solución acuosa como Faramount (código S3025) o Glycergel (código C0563). Control de calidad Las diferencias que pueden darse en el procesado de las muestras o técnicas en el laboratorio del usuario puede suponer una variabilidad significativa de los resultados obtenidos. Esto supone la necesidad de realizar controles propios. Consulte las referencias 8 a 10 si desea información adicional sobre el control de calidad. Consulte la hoja de especificaciones de cada anticuerpo primario que se utilice para conocer los detalles de sensibilidad e inmunorreactividad. Tejido de control positivo Deben utilizarse tejidos que se sepa que son positivos para poder velar por el correcto procesado de las muestras y la adecuada actuación de los reactivos utilizados en las pruebas. Si el tejido de control positivo no consigue demostrar una tinción positiva apropiada, los resultados de los especímenes no deben considerarse válidos. Reactivo de control negativo Para evaluar la tinción no específica y permitir una mejor interpretación de la tinción específica en la zona del antígeno, utilice el reactivo de control negativo suministrado en lugar del anticuerpo primario con un corte de cada espécimen. Si se utilizan paneles de anticuerpos en series de secciones de tejidos, aquellas zonas de tinción que proporcionen una respuesta negativa pueden servir como control del enlace negativo/no específico para otros anticuerpos. En el caso de que obtenga algún resultado aberrante, consulte la sección de resolución de problemas para encontrar la solución. Interpretación de la tinción En primer lugar debe examinar el tejido de control positivo para determinar que todos los reactivos funcionan correctamente. La presencia de un producto final de color marrón en la zona del antígeno diana indica una reactividad positiva. Si el tejido de control positivo no consigue demostrar una tinción positiva apropiada, los resultados de los especímenes deberán considerarse no válidos. La tinción no específica, caso de que se produzca, tendrá un aspecto de punteado o difuso. La alta sensibilidad de este sistema se debe a su gran amplificación de señal. Cualquier tinción de fondo no específica que se halle presente también se verá amplificada. Por esta razón, se recomienda el uso de reactivos de control negativo en una sección de cada espécimen de control y de prueba para ayudar en la interpretación de la tinción (consulte la sección Limitaciones si desea información sobre tinción no específica). ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 8/10

9 Es posible observar una leve tinción esporádica de tejido conjuntivo en cortes de tejido excesivamente fijados en formol. Utilice células intactas para interpretar los resultados de la tinción. Es habitual que las células necróticas o degeneradas proporcionen una tinción no específica. Pueden observarse resultados falso positivos debidos a una unión no inmunológica de los reactivos a los cortes de tejido. Limitaciones específicas del producto La inmunoglobulina endógena, presente en los especimenes de tejido humana, puede mostrar diversos niveles de reactividad cruzada con anticuerpos antiinmunoglobulina secundarios. El anticuerpo secundario utilizado en este sistema es un fragmento F (ab ) 2 biotinilado de inmunoglobulinas de conejo anti-ratón altamente purificado (específico para la cadena pesada y ligera). Este anticuerpo ha absorbido grandes cantidades de suero humano normal para reducir la reactividad cruzada. Sin embargo, dada la alta sensibilidad de este sistema, es posible que algunas muestras puedan revelar una reactividad cruzada con inmunoglobulinas endógenas. La tinción de fondo debida a inmunoglobulinas endógenas se reconoce por su aspecto de tinción en control negativo presente en las zonas circundantes a los vasos sanguíneos y linfáticos, en el tejido conectivo y en los espacios extravasculares. Ciertos tipos de epitelio, especialmente aquellos asociados al tracto digestivo también pueden mostrar inmunoglobulinas endógenas. La tinción debida a inmunoglobulinas endógenas también se ve aumentada si se utilizan métodos de recuperación de blancos. Por esta razón, es necesario utilizar reactivos y tejidos de control negativo adecuados para interpretar cualquier tinción positiva en que se sospeche de la presencia de inmunoglobulinas endógenas. Se ha detectado actividad de enlace con avidina endógena en secciones congeladas de hígado (nódulo hepático completo) y riñón (epitelio tubular), así como en tejidos linfoides congelados y fijados en formol. 11 Se recomienda el uso rutinario del sistema bloqueante de biotina (Biotin Blocking System) (código X0590 o en K1499) para reducir la tinción no específica debida a actividad endógena de enlace con la avidina. Puede detectarse actividad de la peroxidasa endógena o pseudoperoxidasa en hemoproteínas como son la hemoglobina, mioglobina, citocromo y catalasa, así como en eosinófilos. 12,13 Esta actividad puede inhibirse incubando las muestras con el bloqueante de peroxidasa (Peroxidase Block) (botella 1 del sistema CSA System, HRP) durante cinco minutos antes de la aplicación del anticuerpo primario. Los tejidos que contiene antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) pueden mostrar tinción no específica con peroxidasa. 14 La utilización de suero normal/noinmune de la misma fuente animal que el antisuero secundario utilizado en los pasos de bloqueo puede llevar a resultados falso negativos o falso positivos debido a auto-anticuerpos o anticuerpos naturales. No utilice este kit para tejidos de ratón. El anticuerpo de enlace para las inmunoglobulinas anti-ratón que contiene este kit reacciona con las inmunoglobulinas endógenas de ratón, lo que supone la presencia de abundante tinción de fondo. Resolución de problemas Problema Posible causa Medida sugerida 1. Ningún portaobjetos se tiñó. 2. Tinción débil de todos los portaobjetos. 3. Excessive background staining in all slides. 1a. Los reactivos no se utilizaron en el orden correcto. 1b. Presencia de azida sódica en el baño tampón. 2a. Los cortes retienen demasiada solución después del baño de lavado. 2b. Los portaobjetos no se han incubado suficiente tiempo con los anticuerpos o con el sustrato. 2c. El antígeno que se está estudiando requiere la recuperación de blancos. 3a. Los especimenes presentan abundantes inmunoglobulinas endógenas. 1a. Compruebe la aplicación de los reactivos. 1b. Utilice tampón preparado recientemente y libre de azida. 2a. Antes de limpiar alrededor del corte, golpee ligeramente el exceso de solución 2b. Consulte los tiempos de incubación recomendados. 2c. Realice la recuperación de blancos 3a.Compare atentamente el tejido en estudio con el tejido de control de reactivos negativo en busca de diferencias. 3b. Los especímenes presentan actividad de enlace con la avidina endógena (biotina endógena). 3c. Los especimenes presentan abundantes inmunoglobulinas endógenas. 3d. No se ha retirado toda la parafina. 3b. Aplique el sistema bloqueante de biotina Biotin Blocking System. 3c. Utilice el bloqueante de peroxidasa durante un periodo de tiempo de incubación más prolongado. 3d. Utilice un baño de xilol o tolueno preparado recientemente. Si varios portaobjetos se tiñen simultáneamente, el segundo baño de xilol debe contener xilol preparado recientemente. ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 9/10

10 3e. No se han aclarado los portaobjetos correctamente 3 f. Se ha producido una reacción de sustrato más rápida que la esperada debido a, por ejemplo, una temperatura ambiente demasiado alta. 3g. Los cortes se secaron durante el procedimiento de tinción. 3h. Se produjeron enlaces no específicos de reactivos a los cortes de tejidos. 3i. Se produjeron enlaces no específicosde reactivos a los cortes de tejidos. 3e. Utilice una solución preparada recientemente en los baños de tampón y en los frascos de lavado. Se recomienda el uso de TBST. Incube los cortes en un número no superior a tres baños con tampón TBST por un periodo de entre 35 y 5 minutos cada vez. 3f. Utilice un tiempo de incubación más corto con la solución sustratocromógeno. 3g. Utilice una cámara húmeda. Limpie sólo de tres a cuatro portaobjetos a la vez antes de aplicar el reactivo 3h. Utilice el bloqueador de proteínas durante un periodo de tiempo de incubación más prolongado. 3i. Diluya el anticuerpo primario en el anticuerpo diluyente. NOTA: Si el problema no puede atribuirse a ninguna de las causas aquí descritas o si la medida de corrección que se sugiere no resuelve el problema, llame a los Servicios técnicos de Dako para obtener más ayuda. Puede encontrar información adicional sobre las técnicas de tinción y preparación de especimenes en el manual Handbook Immunochemical Staining Methods 6 (disponible de Dako) y del Atlas of Immunohistology 15 Referencias 1. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125: Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. "Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides." DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, List of substances which may be candidates for further scientific review and possible identification, classification and regulation as potential carcinogens. Fed Reg 1980; 45(157) 5. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical Staining Methods. Carpinteria: Dako Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase: I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14: Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 10. Herman GE and Alfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Edition 07/15 ( ) P04038ES_01_K1500/ p. 10/10