ANÁLISIS DE LOS PRINCIPALES POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN LA CABAÑA OVINA ESPAÑOLA

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1 ANÁLISIS DE LOS PRINCIPALES POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN LA CABAÑA OVINA ESPAÑOLA Hurtado, M.D., López, C., Bouzada, J.A., Mayoral, T., Anadón, E. y Gómez-Tejedor, C. Laboratorio Central de Veterinaria, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Ctra. de Algete, Km Algete (MADRID) RESUMEN: La tembladera o scrapie es una enfermedad ovina cuya aparición es consecuencia de un cambio post-traduccional en la proteína PrP (codificada por el gen PRNP). Diversos estudios científicos han confirmado que la variabilidad alélica de este gen determina el grado de resistencia del animal a contraer scrapie. El estudio de la resistencia a la enfermedad se basa en el análisis de los polimorfismos presentes en los codones 136, 154 y 171 del gen PRNP, cuya relación con la susceptibilidad/resistencia de los ovinos a padecer la enfermedad ha sido ampliamente descrita. Recientemente, se han descrito nuevos polimorfismos, con resistencia a tembladera aún desconocida. Por ello, la UE ha venido desarrollando una normativa encaminada a incrementar la frecuencia de los alelos y genotipos más resistentes del gen PRNP, con el fin de controlar y erradicar la enfermedad. La aplicación de esta normativa en España ha dado lugar al Programa Nacional de Genotipado Ovino, siendo designado el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete, según Real Decreto 1312/2005 del 21 de Noviembre, Laboratorio Nacional de Referencia para el análisis del gen PRNP. En el siguiente trabajo se describe la totalidad del proceso (desde la recogida de las muestras, hasta su procesamiento en el laboratorio y emisión final de resultados). Además, se muestra la evolución hasta la actualidad, de las frecuencias genotípicas y alélicas del gen PRNP del ganado ovino en España, así como algunos datos de interés relativos a los tres grandes grupos de razas (fomento, de protección especial y españolas). INTRODUCCIÓN: El scrapie o tembladera es una enfermedad neurodegenerativa perteneciente al grupo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) que afecta a ovejas y cabras 1

2 (Bolton et al., 1982; Prusiner, 1982; Prusiner et al., 1982). Fue descrita por primera vez en el siglo XVIII, y cursa, entre otros síntomas, con prurito, temblores, incoordinación motora, hiperexcitabilidad, finalizando en parálisis y muerte del animal. Diversos autores proponen que el mayor riesgo de transmisión se produce después del parto, debido a la ingesta por los descendientes de la placenta del animal enfermo o de forma indirecta a otros animales, por la contaminación del medio con dicho tejido. En 1985 se detectaron los primeros casos de transmisión de esta enfermedad al ganado bovino bajo el nombre de encefalopatía espongiforme bovina (EEB). Posteriormente, se originó una gran alarma social tras la aparición de una variante de la enfermedad en humanos, asociada a la ingesta de tejidos bovinos infectados con EEB. Esto ha llevado a la puesta en marcha, en todos los paises de la Unión Europea, de un sistema de control y seguimiento de la tembladera en ovinos y caprinos, con la finalidad de prevenir la aparición de la enfermedad e investigar la presencia o no de la variante EEB en estas especies. Así, tras la confirmación en Francia del primer caso de EEB en un animal de la especie caprina (año 2005), se modificó la normativa europea con el objeto de discriminar entre tembladera y EEB en todos los casos confirmados positivos a EETs en pequeños rumiantes. El scrapie se caracteriza, al igual que otras EETs, por la presencia de la proteína del prión que adquiere una conformación anómala (PrP sc ) y que se acumula en los tejidos en forma de agregados, detectándose principalmente en tejido nervioso. La proteína patógena (PrP sc ) induce la transformación de la proteína endógena PrP c a PrP sc, siendo esta última la causante de la enfermedad. Diversos estudios científicos han confirmado que la variabilidad alélica del gen PRNP (el cual codifica para la proteína PrP) determina el grado de resistencia del animal a contraer scrapie (Bossers et al., 1996; Smits et al., 1997). Existen numerosas posiciones polimórficas descritas para este gen (Laplanche et al., 1993; Clouscard et al., 1995; Bossers et al., 1996; Hunter et al., 1996; Thorisson et al., 1998; Thorgeirsdottir et al., 1999; Bouzada et al., 2004). De todos ellos, los polimorfismos detectados en los codones 136, 154 y 171 son los que parecen estar más relacionados con el grado de susceptibilidad de los ovinos a padecer la enfermedad (Hunter et al., 1997; Thorgeirsdottir et al., 1999). Se ha comprobado así, que los alelos ARR y AHQ confieren un grado mayor de resistencia, mientras que otros (ARQ, ARH y VRQ), se 2

3 asocian con una mayor susceptibilidad. Por otro lado, los animales ARR/ARR son los más resistentes y los VRQ/VRQ, los más sensibles (Dawson et al., 1998). La combinación de esos cinco alelos da como resultado la aparición de 15 genotipos posibles, cuyo grado de resistencia se muestra en la tabla.ii. Actualmente se conoce otra variante alélica, ARK (originada por un cambio en el primer nucleótido del codon 171) que aparece con una frecuencia mayor en algunas razas ovinas existentes en España (por ejemplo en Rasa Aragonesa), cuya detección ha sido incluida en el protocolo habitual de análisis pero cuyo nivel de susceptibilidad/resistencia a padecer la enfermedad todavía no ha sido establecido. Con el fin de controlar y erradicar la enfermedad, la UE ha venido desarrollando una normativa encaminada al establecimiento de rebaños formados por animales con genotipos resistentes a la enfermedad. Así, en el año 2002, el Comité Científico de la UE fijó los requisitos mínimos para el estudio de los genotipos de la proteína prión en las especies ovinas (2002/1003/CE). Para dar cumplimiento a esa decisión, el Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación (MAPA) y la Federación Española de Asociaciones de Ganado Selecto (FEAGAS) acordaron realizar un estudio de los genotipos de determinadas razas (Ruiz y Barba, 2003). Un año más tarde, se fijaron los requisitos para el desarrollo de programas de cría de ovinos resistentes a las EETs (2003/100/CE) y se establecieron las directrices que permitieron en España la aplicación del Programa Nacional de Genotipado Ovino. Este programa, está coordinado por el Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación en colaboración con las comunidades autónomas y las organizaciones de criadores de ovino de Raza Pura. La participación en el mismo es obligatoria para los rebaños de alto valor genético y los de producción pueden integrase voluntariamente. El objetivo principal de dicho programa es la consecución de una cabaña ovina resistente a las EETs, mediante el incremento de la frecuencia de los genotipos/alelos del gen PRNP más resistentes a este grupo de enfermedades y la disminución de la frecuencia de aquellos que contribuyen a la susceptibilidad de contraerlas. Para llevarlo a cabo, por lo tanto, es indispensable el análisis del genotipo del gen PRNP. En el Real Decreto 1312/2005, de 4 de noviembre, se establecen las bases de regulación de dicho programa, siendo designado el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete, Laboratorio Nacional de Referencia para el análisis del gen PRNP. 3

4 En este trabajo se describe el proceso de análisis del gen PRNP llevado a cabo en el LCV, desde la recogida de las muestras hasta la emisión final de los resultados, mostrándose además información relativa a la evolución de las frecuencias genotípicas y alélicas del gen PRNP del ganado ovino en España, desde el comienzo del genotipado (año 2002) hasta el momento actual. También se refleja la situación en el año 2006, de los tres principales grupos de razas que se establecen en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado en España (razas de fomento, de protección especial y españolas). MATERIAL Y MÉTODOS: El protocolo de trabajo llevado a cabo en el LCV ha ido evolucionando desde el año 2002 para poder satisfacer las necesidades de genotipado a gran escala que requiere el Programa de Selección Nacional. En estos momentos se cuenta con un sistema cuyos procesos han sido automatizados y capaces de analizar un número superior a 6000 muestras diarias. Material Biológico: Las muestras recibidas en esta unidad proceden de animales incluidos en el Programa Nacional de Genotipado Ovino, de focos de scrapie y casos de confirmación positivos a tembladera. Las muestras provienen de animales identificados mediante bolo ruminal con dispositivo electrónico (aplicable a todos los reproductores mayores de seis meses), de acuerdo con las normativa de la Organización Internacional para la Normalización (ISO y 11785). Previamente al envío de la muestra al laboratorio, los datos relativos a la identificación electrónica del animal, identificación de la muestra, raza, número de muestras enviadas, titulares de las explotaciones, etc., son registrados en una base de datos con acceso tipo página web, dependiente del MAPA, denominada ARIES. Las muestras registradas se agrupan y se les asigna de forma automática un número de envío para su remisión al laboratorio. Por otro lado, los resultados obtenidos al final del proceso, son enviados también a la base de datos de esta aplicación. Las muestra están constituidas por sangre entera, tomadas por los técnicos de las distintas asociaciones de ganado ovino, recogida en tubos con EDTA (anticoagulante) e identificados mediante código de barras, de forma que se establece una relación inequívoca entre la muestra y el animal al que pertenecen. Las muestras se conservan, 4

5 hasta su envío, refrigeradas o congeladas y manteniendo la cadena del frío durante el transporte al LCV. Aplicaciones informáticas: El laboratorio cuenta con una base de datos interna denominada Genolab, responsable de la gestión de toda la información relacionada con las muestras recibidas. Por un lado descarga la información de ARIES y por otro la relaciona con los resultados de las muestras obtenidos en el laboratorio. Genolab va a gestionar además todos los ficheros informáticos generados durante las distintas fases del proceso de análisis asegurando así la trazabilidad de los mismos. Identificación y alicuotado de las muestras: Este proceso se realiza de forma automática en un robot Genesis freedom 150 (Tecan).Todas las muestras recibidas son identificadas mediante la lectura de los códigos de barras de los tubos por medio de un lector láser. Esta herramienta permite identificar las muestras recibidas y confirmar su entrada en el laboratorio de modo automático. A continuación, el robot procede al alicuotado de las mismas, generando diferentes fracciones para banco de sangre y para el proceso de análisis que se lleva a cabo en la obtención del genotipo del animal. Extracción de ADN: Este proceso se realiza en una plataforma robótica Genesis freedom 200 (Tecan) equipada con dos brazos móviles, con diferentes soportes para las placas a utilizar y un sistema de centrífuga integrada. El procedimiento de extracción se basa en la lisis celular por agentes caotrópicos y digestión con proteinasa K seguido de purificación en placas especificas para la unión del ADN. Amplificación de fragmentos: A partir del ADN obtenido en la fase anterior, se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de 360 pb de la fase de lectura abierta del exón III del gen PRNP en el que están situadas todas las posiciones polimórficas que se pretenden analizar. Posteriormente se purifica el ADN amplificado mediante filtración selectiva, para lo cual se dispone de plataformas robóticas (Tecan multipipettors) con bomba de vacío integrada 5

6 Genotipado: El proceso de genotipado se basa en la técnica de primer extensión analysis, la cual permite el análisis de los 4 polimorfismos asociados a los codones 136, 154 y 171 del gen PRNP. Concretamente se genotipa la segunda base nucleotídica de los codones 136 y 154, y la segunda y tercera del codon 171. Los resultados obtenidos permiten identificar los cinco alelos previamente descritos. Recientemente, se han encontrado animales con polimorfismos en la primera posición del codon 171 y que daría lugar al alelo ARK. Para poder detectar dicha mutación de forma rutinaria, se ha rediseñado el método de genotipado utilizado en el LCV. Así, en la actualidad se emplean a la vez, en una reacción múltiple, 6 oligonucleótidos de distintos tamaños, específicos para las 5 posiciones polimórficas asociadas a los codones 136, 154 y 171 del gen. Análisis de fragmentos: Los productos de la reacción de primer extension son analizados por electroforesis capilar en un 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems) Interpretación de los resultados: Los datos generados son analizados e interpretados mediante el software GeneMapper (Applied Biosystems) y validados por el personal del laboratorio posteriormente. Envío de resultados: Los resultados obtenidos en el LCV son enviados a la base de datos ARIES desde donde pueden ser consultados, por las asociaciones ganaderas participantes en el programa, Comunidades Autonomas, MAPA y Laboratorios. Cada usuario tiene acceso restringido a ARIES mediante el uso de claves que limitan la información disponible para cada uno. El elevado grado de automatización del proceso mediante la utilización de robots y aplicaciones informáticas diseñadas específicamente para el mismo, asegura la obtención del resultado final en unos 3 días con una total trazabilidad de los mismos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la tabla I, se muestran las frecuencias genotípicas absolutas y relativas para el gen PRNP en el periodo de análisis comprendido entre el año 2002 y agosto de 2007 (se 6

7 analizaron en ese periodo un total de muestras). Se han considerado los 21 genotipos resultado de la combinación de los 6 alelos detectados; aquellos cuyo nivel de sensibilidad/resistencia a padecer la enfermedad es conocido y los que portan el alelo ARK con susceptibilidad aún por determinar. Se han encontrado animales con todos los genotipos posibles, aunque las frecuencias varían considerablemente de unas combinaciones a otras. Los valores más elevados se corresponden en todos los años muestreados, con los genotipos ARQ/ARQ y ARR/ARQ, los cuales presentan unas frecuencias medias del 46,138% y al 31,319% respectivamente. Con una frecuencia media significativamente menor (8,019%) aparece el genotipo ARR/ARR. El resto de los genotipos aparece con frecuencias iguales a 4,065% (es el caso del genotipo ARQ/AHQ) o inferiores a ese valor. En cuanto al genotipo VRQ/VRQ, considerado altamente susceptible, posee uno de los valores de frecuencia genotípica media más bajos (0,088%). Tabla I. Frecuencias genotípicas de los principales genotipos del gen PRNP en el ganado ovino estudiado en España desde el año 2002 hasta agosto de Genotipo Total % Total % Total % Total % Total % Total % ARR/ARR 593 8, , , , , ,133 ARR/AHQ 90 1, , , , , ,806 AHQ/AH Q 11 0, , , , , ,199 ARR/ARQ , , , , , ,464 ARR/ARH 66 0, , , , , ,308 ARQ/AHQ 219 3, , , , , ,161 AHQ/ARH 2 0, , , , , ,173 ARH/ARH 7 0, , , , , ,151 ARQ/ARH 178 2, , , , , ,960 ARQ/ARQ , , , , , ,480 ARR/VRQ 82 1, , , , , ,159 AHQ/VRQ 2 0, , , , , ,139 ARQ/VRQ 165 2, , , , , ,793 ARH/VRQ 3 0, , , , , ,092 VRQ/VRQ 9 0, , , , , ,069 ARK/ARK , , ,021 ARK/ARR , , ,026 ARK/ARQ , , ,586 ARK/AHQ , , ,025 ARK/ARH , , ,030 ARK/VRQ , , ,025 TOTAL Muestras analizadas desde hasta

8 En la tabla II aparece la frecuencia de cada uno de los grupos de riesgo según las frecuencias de cada uno de los genotipos detectados. El dato más destacable es que la proporción de animales con riesgo alto de padecer la enfermedad (R5) es de tan sólo un 2,58% del total de la población analizada. Tabla II. Frecuencia de los distintos grupos de riesgo. Grupos Genotipos Nº de animales Proporción (%) 1 Susceptibilidad R1 ARR/ARR ,02 MUY BAJO RIESGO R2 ARR/AHQ y AHQ/AHQ ,67 BAJO RIESGO R3 ARR/ARH, AHQ/ARQ y ,59 BAJO RIESGO ARR/ARQ R4 AHQ/ARH, ARH/ARH, ARQ/ARH, ARQ/ARQ, ,84 RIESGO OCASIONAL AHQ/VRQ y ARR/VRQ R5 ARQ/VRQ, ARH/VRQ y ,58 ALTO RIESGO SIN CLASIFICAR VRQ/VRQ ARK/ARK, ARK/ARR, ARK/ARQ, ARK/AHQ, ARK/ARH y ARK/VRQ ,30 DESCONOCIDA 1 Proporción calculada a partir de las frecuencias medias de cada genotipo desde hasta En la tabla III, se muestran las frecuencias alélicas obtenidas desde el año 2002 hasta agosto de 2007 correspondientes a los 5 alelos de susceptibilidad conocida y al alelo ARK. El valor más elevado lo presenta el alelo ARQ (66,742%). La frecuencia del alelo ARR, la cual debe tenderse a aumentar en los rebaños, está en segundo lugar, con un valor medio del 25,606%. En cuanto a los alelos AHQ, ARH, VRQ y ARK, los valores son significativamente menores a los anteriores, así, el alelo VRQ, considerado de alto riesgo y que debe ser eliminado de las poblaciones ovinas, presenta la segunda frecuencia media más baja (del 1,921%), y con una frecuencia similar aparece el alelo 8

9 ARH (2,498%). Por último, los valores medios para AHQ y ARK son de 3,079% y 0,154% respectivamente. Tabla III. Frecuencias alélicas del gen PRNP en el ganado estudiado en España desde el año 2002 hasta agosto de Alelo AHQ 2,484 2,831 3,258 3,570 2,977 3,351 ARH 1,950 2,053 2,557 3,305 2,691 2,433 ARQ 67,885 71,088 68,274 63,977 65,763 63,462 ARR 25,678 22,447 24,222 27,341 25,834 28,114 VRQ 2,002 1,580 1,688 1,732 2,351 2,173 ARK ,075 0,383 0,467 Se ha realizado además un análisis comparativo, referente al año 2006, entre los tres grandes grupos de razas establecidas en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado en España: razas de Fomento, razas de Protección Especial y razas Españolas, en el que se han calculado las frecuencias de cada uno de los alelos detectados. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV. Cabe destacar que la frecuencia del alelo ARR en las razas españolas es significativamente mayor al de las autóctonas, por lo que presentan una situación más favorable que el resto. Por otro lado, se aprecia que los grupos de razas autóctonas (Protección Especial y de Fomento) presentan un comportamiento muy similar entre sí, y muy diferenciado con respecto a las razas Españolas. Tabla IV. Frecuencias alélicas del gen PRNP en los tres grupos de razas: Fomento, de protección especial y españolas (año 2006) Alelo PROTECCIÓN ESPECIAL (%) FOMENTO (%) ESPAÑOLA (%) AHQ 4,130 3,134 3,364 ARH 2,264 2,155 0,141 ARQ 64,241 65,640 31,901 ARR 26,550 26,426 62,231 VRQ 2,744 2,229 2,324 ARK 0,072 0,416 0,039 De los resultados expuestos se puede concluir que los objetivos del Programa Nacional de Genotipado se están cumpliendo. La selección de animales para conseguir aumentar la presencia del alelo ARR en los ovinos de raza pura ha sido favorable, observándose un aumento de éste desde el 42.5% del año 2002 al 46.9% del No obstante es 9

10 importante tener en cuenta la difícil situación de partida y que las previsiones de incrementar la población de ovinos resistentes a la tembladera, mediante el establecimiento de programas de cría, deben ser establecidas a mayor plazo. Esto se observa especialmente en el incremento de los animales ARR homocigotos, que ha sido próximo al 0.5%. Así mismo se observa que la frecuencia del genotipo con mayor sensibilidad VRQ/VRQ es el segundo más bajo (0.069%). Por otro lado el alelo ARQ, el cual se considera como un genotipo no deseable en los rebaños, presenta aún la frecuencia más elevada. La velocidad en la consecución de los objetivos propuestos en el programa nacional de genotipado está muy influenciada por las frecuencias iniciales de los diferentes genotipos de cada raza. Así por ejemplo existen razas, denominadas ovinas españolas (razas no originarias de España pero que llevan más de veinte años explotándose en nuestro país) que presentan frecuencias del alelo ARR muy superiores a la del resto, por lo que es de esperar en ellas una evolución más favorable de las frecuencias alélicas de ARR y por tanto el establecimiento de rebaños resistentes en un menor tiempo. BIBLIOGRAFÍA: Bolton D. C., McKinley M.P., Prusiner S.B. (1982). Identification of protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218(4579): Bossers A., Schreuder B.E., Muileman I.H., Belt P.B., Smits M.A. (1996). Prp genotype contributes to determining survival times of sheep with natural scrapie. J Gen Virol. 77 (Pt 10): Bouzada J.A., Luque J., Vega M.O., Donado-Mazarron M.E., Gallego R., Pérez- Guzmán M.D.(2004). Susceptibilidad genética al scrapie en las variedades Blanca y Negra de la raza ovina Manchega. ITEA. 100 (2): Clouscard C., Beaudr P., Essen J.M., Milan D., Dussaucy M., Bounneau C., Schelcher F., Chaatelain J., Launay J.M., Laplanche J.L. (1995). Different allelic effects of the codons 136 and 171 of the prion protein gene in sheep with natural scrapie. J.Gen.Virol. 76: Decision 2002/1003/CE por la que se fijan los requisitos mínimos para un estudio de los genotipos de la proteína del prión de las especies ovinas. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. 24/12/2002: Decision 2003/1003/CE por la que se fijan los requisitos mínimos para el establecimiento de programas de cría de ovinos resistentes a las encefalopatías espongiformes transmisibles. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. 14/02/2003: Dawson, M., Hoinville, B., Hosie B.D., Hunter N. (1998). Guidance on the use of PrP genotyping as an aid to the control of clinical scrapie. Vet.Rec. 142:

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