EFECTIVIDAD BIOLÓGICA DE EXTRACTOS VEGETALES SOBRE LARVAS DE MOSQUITO Culex quinquefasciatus (SAY) (DIPTERA: CULICIDAE)

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1 EFECTIVIDAD BIOLÓGICA DE EXTRACTOS VEGETALES SOBRE LARVAS DE MOSQUITO Culex quinquefasciatus (SAY) (DIPTERA: CULICIDAE) Carlos Granados-Echegoyén 1, 2, Rafael Pérez-Pacheco 1, Sabino Martínez-Tomas 1, Nancy Alonso-Hernández 1 y Juan Delgado-Gamboa 1. 1 CIIDIR-OAXACA, Instituto Politécnico Nacional, Calle Hornos 1003, Santa Cruz, Xoxocotlán, Oaxaca, México. C.P Tel: (951) ext Universidad Nacional de Ingeniería (UNI), Managua, Nicaragua. P.O. Box 5595, Tel: (505) granados.echegoyen@yahoo.com RESUMEN. Se evaluaron 13 extractos vegetales acuosos y dos acetónicos para determinar la mortalidad de larvas de mosquito Culex quinquefasciatus (Say). Se colocaron 20 larvas de II instar en un vaso de plástico con 100 ml de agua destilada y se adicionó 1 ml de los extractos preparados. 24 horas después se registró la mortalidad de las larvas durante cinco días consecutivos. El extracto vegetal con mayor acción larvícida fue Ricinus communis, con el extracto de semillas se obtuvo un 100 % de mortalidad y con el extracto de hojas un 60 %, de manera similar las semillas de Azadirachta indica y Melia azedarach, ocasionaron un 95 y 65 % de mortalidad respectivamente. Las dos especies maceradas con acetona Waltheria indica y Clinopodium laevigatum; evaluadas a concentraciones de 0.3, 0.03 y % presentaron mortalidad mayor al 90, 45 y 25 % respectivamente. Palabras clave: extractos botánicos, mosquitos, larvas, Culex. ABSTRACT. Thirteen aqueous and two acetones vegetable extracts were evaluated to determine the mortality of larvae of mosquito Culex quinquefasciatus (Say). Twenty larvae of second instar were placed in a plastic glass with 100 ml of distilled water and there was added 1 ml of the prepared extracts. 24 hours later the mortality of the larvae was registered for five consecutive days. The vegetable extract with major larvicidal action was Ricinus communis, with the seeds extract provoke 100 % of mortality and with the sheets extract 60 %, much like the seeds of Azadirachta indica and Melia azedarach, caused 95 and 65 % of mortality respectively. The two species macerated with acetone Waltheria indica and Clinopodium laevigatum; evaluated to concentrations of 0.3, 0.03 and % they presented mortality bigger than 90, 45 and 25 % respectively. Key words: botanical extracts, mosquitoes, larvae, Culex. Introducción Los mosquitos son el grupo de insectos más importantes en salud pública, existen más de 300 especies de mosquitos en el mundo agrupados en 39 géneros, Cx. quinquefasciatus es vector de filaríasis linfática y se encuentra ampliamente distribuido en zonas tropicales y subtropicales afectando directamente a 120 millones de personas y 44 millones con manifestaciones crónicas cada año (Bernhard et al., 2003). La investigación de métodos alternos de control de insectos se ha incrementado recientemente (Choi et al., 2003). Las propiedades insecticidas de las plantas han sido utilizadas por el hombre desde antes de la aparición de los insecticidas organosintéticos, gracias a los principios activos que poseen (Aragón et al., 2002). Muchas especies de la familia Culicidae son importantes en salud pública por ser vectores de enfermedades, el manejo y control de los mosquitos se ha efectuado tradicionalmente con insecticidas químicos, que ocasionan contaminación al ambiente e intoxicación al hombre. El estudio de la actividad larvícida de extractos vegetales puede llevar al descubrimiento de un nuevo producto para el control de mosquitos, además de ser un recurso alternativo a los plaguicidas sintéticos. Según la Organización Mundial de la Salud, aproximadamente el 40 % de los 506 artrópodos de importancia médica presentan diferentes niveles de resistencia a insecticidas, de estas, aproximadamente el 50 % son especies de mosquitos vectores de malaria, dengue, fiebre amarilla y filaríasis. Una alternativa de menor impacto ecológico es el uso de insecticidas naturales. Aproximadamente de 344 especies de plantas se han obtenido sustancias orgánicas con actividad insecticida a mosquitos. Se han utilizado diversos solventes para la extracción de componentes 588

2 secundarios, desde muy polares extraídos con agua hasta los no polares extraídos con hexano (Deore y Khadabadi, 2009). Por estas razones, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto toxico de 13 extractos vegetales acuosos y dos extractos acetónicos sobre larvas de Cx. quinquefasciatus. Materiales y Método Esta investigación se realizó en el laboratorio de control de mosquitos del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), localizado en Santa Cruz Xoxocotlán; Oaxaca, México. Se utilizaron larvas de mosquito Cx. quinquefasciatus de II instar, las cuales se obtuvieron de la cría que se reproduce en el mismo laboratorio. Las especies vegetales evaluadas fueron seleccionadas por referencias bibliográficas que presentan efecto sobre insectos plaga (Mulla y Su, 1999, Wandscheer et al., 2004, Pérez-Pacheco et al., 2004, Bobadilla et al., 2005, Martínez-Tomas et al., 2010). En diferentes localidades de los Valles Centrales del estado de Oaxaca se recolectó flores, hojas y semillas (Cuadro 1). Cuadro 1. Especies vegetales evaluadas sobre larvas de II instar de Cx. quinquefasciatus. Nombre Científico Nombre Común Familia Botánica Sitio de Colecta Aloe barbadencis P. (Mill.) Sábila Asphodelaceae Santa Cruz Xoxocotlán Ambrosia artemisiifolia L. Artemisia Asteraceae Oaxaca de Juárez Annona squamosa L. Anona Anonaceae Cuilapam de Guerrero Azadirachta indica A. Juss. Nim Meliaceae Nazareno Chelidonium majus L. Golondrina Papaveraceae Santa Cruz Xoxocotlán Clinopodium laevigatum (Stand) Hierba de Borracho Lamiaceae Oaxaca de Juárez Cymbopogon citratus Stapf. Zacate Limón Poaceae Oaxaca de Juárez Melia azedarach L. Paraíso Meliaceae Santa Cruz Xoxocotlán Mentha rotundifolia Cl.Huds. Mastranzo Lamiaceae Mitla Piper auritum Kunth. Hierba Santa Piperaceae Villa de Zaachila Psidium guajava L. Guayaba Myrtaceae Villa de Zaachila Raphanus raphanistrum L. Rabanillo Brassicaceae Etla Ricinus cummunis L. Higuerilla Euphorbiaceae Santa Cruz Xoxocotlán Taraxacum officinale Weber. Diente de León Asteraceae Nazareno Waltheria indica L. Tapacola Sterculiaceae Mitla La preparación de extractos acuosos, se realizó agregando 22.5 g de hojas, flores y semillas molidas que fueron secadas en sombra en 150 ml de agua destilada contenidos en un matraz y se dejó reposar por 24 h, se separó el sólido del líquido filtrando con tela tricot fina, obteniendo el extracto acuoso del cual se elaboraron los tratamientos al 10 y 15 %. Para extractos acetónicos se agregaron 50 g de hoja seca molida en 500 ml de acetona, dejándolo reposar por tres días; se separó el material vegetal utilizando papel filtro Whatman y se eliminó el disolvente a presión reducida en un evaporador rotatorio (Yamato RE200), obteniéndose 4.91 g de extracto acetónico del cual se elaboraron los tratamientos al 0.3, 0.03 y % a través de dilución volumétrica en serie. Bioensayos. Se seleccionaron grupos de 20 larvas de segundo instar para depositarlos en un vaso de plástico con 100 ml de agua destilada, se aplicó 1 ml de los extractos acuosos y extractos acetónicos de cada especie vegetal. Se colocó un testigo sin aplicación de extractos con el objetivo de descartar la influencia de cualquier factor externo a los tratamientos. 589

3 Para cada dosis evaluada se utilizaron cuatro repeticiones. Los bioensayos se establecieron bajo un diseño experimental completamente aleatorio. 24 h después de la aplicación se registró la mortalidad de las larvas durante cinco días consecutivos, considerando larva muerta aquella que no presentaba movimientos normales al ser perturbadas con un pincel en el sifón o en la región cervical. A los datos de mortalidad se les realizó un análisis de varianza y comparación de medias Tukey (p<0.05) con el programa JMP versión 7.0 (SAS Inc., 2008). Resultados El tratamiento con mayor actividad biológica en los bioensayos realizados con extracción acuosa fue R. communis presentando un 100 % de mortalidad cuando se extrajeron sus compuestos secundarios de semillas y de 60 % a partir de hojas. Los resultados de mortalidad en la extracción acuosa reflejan mayor actividad biológica cuando se utilizan semillas en comparación con los extractos de hojas y flores, tal es el caso de los extractos de A. indica y M. azedarach pertenecientes a la misma familia botánica que presentaron 95 y 65 % de mortalidad respectivamente. El tratamiento acuoso de hojas de M. azedarach no presentó toxicidad (Cuadro 2). En los bioensayos realizados con extractos acetónicos de C. laevigatum y W. indica los mayores porcentajes de mortalidad se registraron a una concentración de 0.3 % con 95 y 90 % respectivamente (Cuadro 3). Cuadro 2. Porcentaje de mortalidad de larvas de Cx. quinquefasciatus causado por extractos acuosos evaluados a 10 % (semillas) y 15 % (hojas y flores). Tratamientos Parte utilizada Mortalidad Corregida (%) 10 % 15 % R. cummunis Semilla 100 a - A. indica Semilla 95 a - R. cummunis Hojas - 60 a M. azedarach Semilla 65 b - M. rotundifolia Hojas - 35 b P. auritum Hojas - 35 b A. barbadencis Hojas - 20 bc P. guajaba Hojas - 20 bc A. artemisiifolia Flores - 15 dc A. squamosa Hojas - 15 dc C. citratus Hojas - 15 dc C. laevigatum Hojas - 10 dc C. majus Hojas - 5 dc M. azedarach Hojas - 0 d R. raphanistrum Flores - 5 dc T. officinale Hojas - 5 dc Testigo - 0 c 0 d *Medias con letras distintas en columnas son significativamente diferentes (p<0.05). 590

4 Cuadro 3. Porcentaje de mortalidad de larvas con extractos acetónicos de dos especies vegetales sobre Cx. quinquefasciatus. Tratamientos Parte utilizada Concentración (%) Mortalidad (%) a C. laevigatum Hojas b b a W. indica Planta completa b b *Medias con letras distintas por tratamiento son significativamente diferentes (p<0.05). Discusión En diversas partes del mundo, un número importante de plantas se ha estudiado y se les conocen diferentes mecanismos de acción que pueden ser útiles para el manejo de plagas (Grainge y Ahmed, 1988; Simmonds et al., 2004). Parra et al. (2007) encontraron que los extractos que presentan mayor actividad sobre las larvas de culícidos del genero Aedes son R. communis con una concentración letal de 860 ppm. En los frutos de la especie vegetal R. communis se ha reportado la presencia del alcaloide ricinina y de la toxoalbúmina ricina, los cuales presentan una toxicidad muy alta para humanos, mamíferos e insectos (Farias y Tokarnia, 1996). La actividad insecticida de M. azedarach se debe a triterpenoides biológicamente activos los que le atribuyen su efecto antialimentario (Carpinella et al., 2003). Se han evaluado extractos de hojas y frutos de M. azedarach sobre diversas plagas, en los que se han alcanzado buenos resultados (Mazzonetto y Vendramim, 2003; Pérez-Pacheco et al., 2004). La actividad de azadiractina a partir de A. indica ha permitido investigar insecticidas naturales en la mayoría de los géneros cercanos, incluyendo Melia (Akhtar y Isman, 2004, González-Gómez et al., 2006). Entre los triterpenoides en las semillas de M. azedarach, la meliacarpina, similar a la azadiractina, tiene también actividad en la regulación del crecimiento de insectos (Schmutterer, 2002). La extracción de los productos secundarios de especies vegetales se realiza comúnmente con agua, pero con la necesidad de extraer compuestos activos de polaridad intermedia se utilizan otros solventes de mayor capacidad de arrastre como acetona, metanol y acetato de etilo. Considerando estas propiedades de extracción se evaluó C. laevigatum y W. indica como extracto acetónico, también tomando en cuenta que C. laevigatum fue evaluada por Pérez-Pacheco et al. (2004) sobre larvas de cuarto instar de Cx. quinquefasciatus con extractos acuosos al 5 y 15 % de concentración y no registró actividad biológica. Las especies del género Clinopodium contienen triterpenos y saponinas triterpenoides que pueden extraerse con diversos solventes (Dzhambazov et al., 2002) compuestos que manifiestan un efecto insectistático sobre artrópodos. El extracto de W. indica es usado como purgante, analgésico, para tratar la tos, la raíz es masticada para aliviar el dolor de garganta y se utiliza para el tratamiento de gonorrea y lepra en humanos (Burkill, 2000). Resultados de pruebas fitoquímicas realizadas en hojas, tallo y raíces han demostrado que contiene alcaloides, flavonoides, taninos y en mayor cantidad antraquinonas y saponinas (Olajuyigbe et al., 2011). Sin embargo, no se documenta su uso como extracto para el control de mosquitos, razón por la cual se consideró extraer sus principios intermedios con acetona. Por lo que se recomienda seguir evaluando especies vegetales sobre culícidos 591

5 extrayendo sus propiedades naturales con diferentes solventes para identificar cuáles son las sustancias que juegan un papel importante en el efecto toxico sobre estos insectos. Conclusión Los extractos acuosos a base de semilla de higuerilla (Ricinus communis) y nim (Azadirachta indica) son una opción para el control de larvas de mosquito Cx. quinquefasciatus, por lo que pueden integrarse como una alternativa en estrategias de control de este vector. Así como los extractos acetónicos de hierbas de borracho (C. laevigatum) y Tapacola (Waltheria indica). Literatura Citada Akhtar, Y. and M. B. Isman Comparative growth inhibitory and antifeedant effects of plant extracts and pure allelochemicals on four phytophagous insect species. J. Appl. Ent. 128: Aragón, G. A., J. F. López-Olguín, A. M. Tapia, V. G. Cilia y B. C. Pérez-Torres Extractos vegetales una alternativa para el control de plagas del amaranto Amaranthus hypochondriacus L. Memorias del VIII Simposio Nacional sobre Sustancias Vegetales y Minerales en el Control de Plagas. Colegio de Postgraduados. S.L.P., México. Pp Bernhard, L.; Bernhard, P.; Magnussen, P Management of patients with lymphoedema caused by filaríasis in North-eastern Tanzania: alternative approaches. Physiotherapy 89: Bobadilla, M., F. Zavala, M. Sisniegas, G. Zavaleta, J. Mostacero y L. Taramona Evaluación larvícida de suspensiones acuosas de Annona muricata Linnaeus «Guanábana» sobre Aedes aegypti Linnaeus (Diptera, Culicidae). Revista Peruana de Biología. 12: Burkill, H. M The useful plants of West Tropical Africa. Royal Botanic Gardens, Kew, UK, p Carpinella, C., T. Defagó, G. Valladares and M. Palacios Antifeedant and Insecticide Properties of a limonoid from Melia azedarach (Meliaceae) with potential use for pest management. J. Agric. Food Chem. 51: Choi, W. I., E. H. Lee, B. R. Choi, H. M. Park And &. J. Ahn Toxicity of plant essential oils to Trialeurodes vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae). Journal Of Economic Entomology. 96 (5): Deore, S. L. and S. S. Khadabadi Larvicidal activity of the saponin fractions of Chlorophytum borivilianum santapau and Fernandes. Journal of Entomology and Nematology. 1(5): Dzhambazov, B., S. Daskalova, A. Monteva and N. Popov In vitro screening for antitumor activity of Clinopodium vulgare L. (Lamiaceae) extracts. Biological Pharmacology. 25(4): Farias, B. M. and C. H. Tokarnia Intoxicacao experimental pelas sementes trituradas de Ricinus communis (Euphorbiaceae) em coelhos. Pesq. Vet. Bras., 16(4): 1-7. González-Gómez, R., G. Otero-Colina, J. A. Villanueva-Jiménez, J. A. Pérez-Amaro & R. M. Soto-Hernández Toxicidad y repelencia de Azadirachta indica contra Varroa destructor (Acari: Varroidae). Agrociencia 40:

6 Grainge, M. and S. Ahmed Handbook of plants with pest control properties. Ed. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. 470p. Martínez-Tomás, S. H., R. Pérez-Pacheco, C. Rodríguez-Hernández, C. A. Granados-Echegoyen, J. R. Delgado-Gamboa & G. F. Ambrosio Actividad tóxica de extractos de Ricinus communis en larvas de cuarto instar temprano de Culex quinquefasciatus. Entomología Mexicana p. Mazzonetto, F. and J. Vendramim Effect of powders from vegetal species on Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Bruchidae) in stored bean. Neotrop. Entomol. 32(1): Mulla, M. S. and T. Su Activity and biological effects of neem products against arthropods of medical and veterinary importance. J. Am. Mosq. Control Assoc. 15: Olajuyigbe, O. O., A. E. Babalola and A. J. Afolayan Antibacterial and phytochemical screening of crude ethanolic extracts of Waltheria indica Linn. African Journal of Microbiology Research 5(22): Parra, G. J.; C. M. García and J. M. Cote Insecticidal activity of vegetal extracts on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) dengue vector in Colombia. Rev. CES. Med., 21(1): Pérez-Pacheco, R., C. Rodríguez, J. Lara-Reyna, R. Montes & G. Ramírez Toxicidad de aceites, esencias y extractos vegetales en larvas del mosquito Culex quinquefasciatus (Say.) (Diptera: Culicidae). Acta Zool. Mex. 20(1): SAS (SAS Institute Inc.) SAS/JMP 7.0. User s Guide. Cary, NC. SAS Institute Inc. USA P. Schmutterer, H The Neem Tree. Neem Found. (Ed.) Mumbai. 892p. Simmonds, S. J., A. P. Jarvis, S. Johnson, G. R. Jones and E. D. Morgan Comparison of antifeedant and insecticidal activity of nimbin and saliannin photooxidation products with neem (Azadirachta indica) limonoids. Pest Management Science. 60(5): Wandscheer, C. B., J. E. Duque, M. A. N. Da Silva, Y. Fukuyama, J. L. Wohlke, J. Adelmann, and J. D. Fontana Larvicidal action of ethanolic extracts from fruit endocarps of Melia azedarach and Azadirachta indica against the dengue mosquito Aedes aegypti. Toxicon. 44: