Métodos y técnicas clásicas aplicadas al estudio de la regulación de la expresión de genes

Transcripción

1 BIOQUIMICA Biología molecular 2018 Bases Moleculares de la regulación de la Expresión génica en eucariontes Métodos y técnicas clásicas aplicadas al estudio de la regulación de la expresión de genes Bibliografía: Lodish, Molecular Cell Biology, 4ta-7ma Edición Watson, J. Molecular Biology of the gene, 5ta Edición, cap 17. Epigenetics and MicroRNAs PA L SÆTROM, OLA SNØVE JR, AND JOHN J. ROSSI. (Pediatr Res 61: 17R 23R, 2007). DOI: /pdr.0b013e e Kouzarides, T. Chromatin Modifications and their function, CELL (2007) 128: Karp s Cell And Molecular Biology 8th Edition ebook Free Download: CAP 12 Protocol Plant Gene Transfer and Expression Protocols. Volume 49 of the series Methods in Molecular Biology pp Nuclear Run-On Transcription Assays. John Gatehouse, Andrew J. Thompson. DOI: / X:229. The RNase Protection Assay. MF. Carey, CL. Peterson and ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc. DOI: /pdb.prot G-less Cassette In Vitro Transcription Using HeLa Cell Nuclear Extracts. MF. Carey, CL. Peterson and ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc; doi: /pdb.prot5387. Nuclear Run-on Assays. N Bates, H Hurst. ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002, DOI: /npg.els Nuclear Run-On Assay. ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc; doi: /pdb.prot5329 Edgardo Guibert

2 Organización de las clases de regulación 1: Bloque generalidades 2: regulación del inicio de la transcripción 3: organización de la cromatina 4: procesos post transcripcionales 5: control de inicio de síntesis proteica 6: epigenesis 7: integración BM-bioquimica2018 Guibert E 2

3 La expresión de genes puede ser silenciada por modificaciones epigenéticas (las cuales no cambian el codigo de bases del DNA, sino la accesibilidad al DNA para la transcripción). Esto se produce principalmente a través de la metilación del ADN, que pueden silenciar genes directamente al interferir con la unión de factores de transcripción a los elementos de reconocimiento de genes, o indirectamente por el cambio de la estructura de la cromatina alrededor del gen. Transcripción ocurre fuera de la cromatina condensada Epigenetico es definido como el estudio de los cambios en organismos llevados a cabo por modificaciones en la expresión de los genes, y no en alteraciones en el codigo genético en la forma del ADN. Los genes por sí solos no determinan los fenotipos. Tienen que existir mecanismos fenotípicos a nivel molecular para mediar en las interacciones entre genes y entorno. De esa manera, surge el término epigenetico. 3

4 El entendimiento de cómo la epigenética actúa sobre el desarrollo normal durante la especificación y diferenciación celular tiene grandes implicancias para prevenir una gran cantidad de trastornos provocados por el establecimiento y transmisión anómala de esa información durante el comienzo de la vida. El término ha sido acuñado por Conrad Weddington en 1942, aunque sólo cobró una mayor relevancia en los últimos años. Actualmente se define como el estudio de las modificaciones en la expresión de genes que no alteran la secuencia del ADN y que son hereditarios. Sin embargo, hoy en día el concepto se usa en un sentido más amplio y no siempre implica la heredabilidad de los cambios. En definitiva, esta rama de la biología demuestra que los genes no dictan de una manera directa e irreversible lo que seremos, sino que en cierto punto el medio ambiente tiene grandes influencias sobre nuestro destino Esto implica que para ser epigenético, debe: 1) ser heredable y 2) no ser atribuible a la secuencia del DNA. Epigenesis en un sentido amplio puede involucrar transducción de señales, regulación de la síntesis y degradación de proteínas y modulación transcripcional. Son fundamentales en procesos como desarrollo embrionario y en patologías como el cáncer. es el mecanismo para un mantenimiento estable de la expresión de genes que involucra hacer DNA o sus proteínas asociadas. Esto permite que células genotípicamente idénticas (las células 4 de un individuo) puedan ser fenotipicamente distintas (una neurona es distinto a un linfocito).

5 Remodelación de la cromatina: Los complejos remodeladores pueden causar el desplazamiento, expulsión o reestructura de los nucleosomas Modificadores o remodeladores los que incorporan o quitan marcas: HAT: pone acetilos en Lys, es decir aflojan ; reclutadas por TFs típicos, que ya de por sí desplazan a las histonas DHAC: quita acetilos en Lys, es decir compactan; reclutadas por grupos metilo HMT: pone metilos en Lys o Arg, aflojan o compactan, según la posición del aa. los que no dejan marca: tipo SW/SNF, que aflojan o compactan nucleosomas, recorriendo DNA con gasto de ATP Relación con transcripción: modelos naive sin histonas? No son útiles modelos con histonas totalmente desplazadas? Tampoco Relación con recombinación o transposición:?? (no estudiado) 5

6 Modificaciones en histonas: Código de histonas en animales Las Histonas modificadas pueden ser reconocidas por diferentes tipos de proteínas: BROMODOMINIO: Es un dominio existente en ciertas proteínas que muestra especificidad de unión con LIS acetiladas. Este dominio reconoce una secuencia de sólo 4 aminoácidos, incluyendo la llis acetilada. CROMODOMINIO: motivo de 60 aa que reconoce LIS metiladas o ARG metiladas. Cambios en las estructura de la cromatina por cambios en las histonas pueden ser analizados por digestión de bajas concentraciones de DNAsa I. Los sitios de hipersensibilidad revelan estructuras más aisladas del DNA, que no están protegidos por los nucleosomas. Esta especificidad de sitios puede ser célula específica. 6

7 Inmunoprecipitacion de la cromatina: Chip ChIP es un método utilizado para descubrir cuando una determinada proteína está unida a un gen determinado en la cromatina. ChIP utiliza un anticuerpo para precipitar una determinada proteína en un complejo con DNA y la reacción de tipo PCR para determinar un DNA cercano.

8 Regulación por proteólisis Ubiquitina es ampliamente conocida como polipeptido de marcaje para la destrucción proteolítica de determinadas proteínas por el complejo del proteosoma. Protein to be degraded Ubiquitin Ubiquitinated protein Proteasome Protein entering a proteasome Proteasome and ubiquitin to be recycled Protein fragments (peptides) Pero la unión covalente de Ubiquitina también puede regular localización y/o actividad proteica, independientemente del proceso proteolítico. 8

9 UBIQUITINACION: fenómeno originalmente descripto como un mecanismo de marcaje de proteínas para la destrucción por el proteosoma. Es una unión covalente de un residuo de 76 aa de la Ubiquitina a otras proteínas. Actualmente se sabe que además de degradar proteínas, puede regular al actividad de proteínas, su localización e incluso sus interacciones. Sumoilacion y ubiquitinacion son procesos reversibles Además existen las Proteínas similares a Ubiquitina (ubiquitin-like proteins UBLs-) que son relacionadas estructuralmente a la Ubiquitina e interaccionan con residuos de Gli en extremos C- Terminales por reaaciones enzimáticas mediadas por las ligasas E1, E2, y E3. La mas conocida es SUMO (small ubiquitin-related modifier). Las células de vertebrados poseen 2 tipos: SUMO-1 y SUMO- 2. La maquinaria enzimática que agrega y remueve SUMO es similar pero distinta de la maquinaria de ubiquitinación. Además, modificaciones post-traslacionales por SUMO no se asocian generalmente con un incremento en la degradación proteica. Proteinas modificadas por SUMO Ejemplo: RanGAP1 al ser modificada por SUMO pasa de ser citosólica a asociada al poro nuclear e interviene activamente en el transporte de macromoléculas a través del poro nuclear. Homologia 18% Similitud estructural 9

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11 Clave para epigenesis: metilación de Citosinas DETERMINACION DE PROCESOS DE METILACIÓN EN DNA POR REACCION DE PCR ESPECIFICA. En esta reacción de PCR, el DNA es modificado por tratamiento con bisulfito, que convierte las Citosinas nometiladas en Uracilo, sin alterar las Citosinas metiladas. Luego de completar la reacción química y de remover los remanentes de bisulfito, este DNA es utilizado como molde de la reacción de PCR. Se realizan 2 reacciones de PCR: una para el DNA metilado y otra para establecer el DNA no-metilado. Los productos de PCR son resueltos en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes y teñidos con bromuro de etidio

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13 Organización de las clases de regulación 1: Bloque generalidades 2: regulación del inicio de la transcripción 3: organización de la cromatina 4: procesos post transcripcionales 5: microrna 6: control de inicio de síntesis proteica 7: epigenesis 8: integración 13

14 La regulación de la expresión de genes sirve para decidir los eventos celulares LOCALIZACION Y TIPOS DE RECEPTORES HORMONALES Modelo de acción de la activación del genes mediada por IFN por un mecanismo de 14 fosforilación y dimerización de Stat1

15 Mecanismo de acción de hormonas solubles en lípidos Estructura de receptores nucleares Response elements are DNA sites that bind several major nuclear receptors 15

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18 Otras consideraciones regulatorias: Regulación en el desarrollo: Dr. Néstor Carrillo Regulación en el ciclo Celular: Dr. N. Cortez Regulación en patologías: Dr. Edgardo Guibert Otras regulaciones: MiRNAs y SiRNAs: Dra. Elena Orellano Silenciamiento génico: Dra. Elena Orellano 18