2. Título: Salvando tomates con las propiedades antifúngicas del tomillo y del chile piquín.

Transcripción

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2 2. Título: Salvando tomates con las propiedades antifúngicas del tomillo y del chile piquín. En la actualidad, la resistencia de los microorganismos patógenos a los antibióticos ha causado grandes problemas a los cultivos en nuestro país. Mediante este proyecto, se emplearon extractos naturales que permiten mejorar el tiempo de vida del tomate, un cultivo exportado a nivel nacional, inhibiendo el desarrollo de uno de sus hongos más comunes, buscando así evitar pérdidas económicas. 3. Resumen A través del presente proyectó se realizó el análisis de las propiedades antifúngicas del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris), obtenido mediante una destilación por arrastre de vapor, y el extracto de capsicina obtenido del chile piquín (Capsicum annuum L.) a través de una extracción por medio de solventes orgánicos (acetona) y una destilación para separar la acetona de la capsaicina; con el fin de encontrar el porcentaje de concentración de dichas sustancias que inhibe de mejor forma el crecimiento del hongo Botrytis cinerea, mismo que es de las principales enfermedades que el tomate puede contraer durante el periodo de cosecha y postcosecha. Primero que nada, la investigación se llevó a cabo in vitro, observando el desarrollo del hongo mencionado en medios de cultivo agar papa-dextrosa con la presencia de distintas concentraciones de los extractos obtenidos. Basándonos en los resultados del análisis in vitro, se procedió a realizar una cera con el porcentaje que mostró un mejor factor inhibitorio de ambos extractos, para observar el comportamiento in vivo en los tomates protegidos por la cera. 4. Introducción 4.1. Marco teórico Generalidades del tomillo: Thymus vulgaris 2

3 Tomillo es el nombre común con el que se conocen a diversas plantas del género Thymus, de la familia de las lamiáceas. El más común y conocido es Thymus vulgaris, que se emplea como condimento y como planta medicinal. Este ejemplar principalmente se localiza en el norte de África (Argelia, Túnez) y en la Europa mediterránea (Fundación Española de la Nutrición, s.f.). Los antiguos egipcios utilizaban esta hierba en los embalsamamientos. Los griegos la utilizaban en sus baños y la quemaban como incienso en sus templos. Se cree que su extensión por toda Europa, se debe a los romanos y al uso que de ella hacían para purificar sus viviendas. En la Edad Media, las mujeres daban a sus caballeros y a los guerreros regalos en los que incluían hojas de tomillo, ya que creían que con esto aumentaban el coraje del portador. El tomillo también se usaba como incienso en los funerales y se ponía en el ataúd, con lo que suponían asegurar un buen tránsito a la próxima vida (Fundación Española de la Nutrición, s.f.) Propiedades antifúngicas del tomillo La infusión del Tomillo se puede utilizar como loción sobre heridas infectadas, infecciones de piel causadas por hongos y dermatosis, en tratamiento de forúnculos y herpes. En algunas del Mediterráneo se utiliza como repelente de los mosquitos y para tratar picaduras de insectos. Hay constancia de que los antiguos egipcios utilizaron ya el tomillo en la conservación de sus momias debido a sus propiedades bactericidas (Rovetto, et al., 2009). El aceite esencial de tomillo, Thymus vulgaris, presenta como componente mayoritario el timol y en algunas variedades su composición puede alcanzar valores hasta del 80%. Se comprueba además la presencia de carvacrol, gamma-terpineno y p-cimeno (precursor del timol). Tanto los aceites esenciales obtenidos de las especies de Thymus, como el timol, han sido reconocidos por su actividad antibacteriana y antifúngica, razón por la cual se emplean industrialmente en la preparación de desinfectantes de uso humano, enjuagues bucales y otros agentes antimicrobianos utilizados a nivel doméstico (Marqués, 2015). 3

4 En el aceite esencial de tomillo se ha encontrado una importante cantidad de compuestos fenólicos thymol (51,34%) y carvacrol (3,7%) y de sus precursores biogénicos p-cymene (35,16%) y γ-terpinene (3,53%). Este aceite ha mostrado en el presente trabajo una elevada actividad antifúngica frente a Alternaria alternata, Bipolaris spicifera, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporoides, Curvularia hawaiiensis, Fusarium oxysporum lycopersici, Fusarium equiseti, Fusarium graminearum, Penicillium expansum y Penicillium italicum, llegando incluso a valores de MGI del 100%. Resultados que concuerdan con los obtenidos por Bouchra et al., (2003, citado por Marqués, 2015) frente a Botrytis cinerea, y por los obtenidos por Bluma y Etcheverry (2008, citado por Marqués, 2015) en ensayos realizados frente a hongos productores de micotoxinas en maíz almacenado. Por otra parte, el thymol ha sido recientemente aprobado (Reg. (EU) Nº 568/2013 (Dossier completo 2011/266/EU) por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) como sustancia activa autorizada en la categoría de fungicida, con fecha de aprobación de 01/12/2013 hasta el 30/11/2023 (Marqués, 2015) Mecanismo de acción del aceite esencial En específico, los estudios demuestran que el carvacrol y el timol tienen varios sitios de acción dentro de las células, y dependiendo de las concentraciones utilizadas pueden causar la inhibición o inactivación de los microorganismos. Los blancos o puntos de ataque de estos agentes antimicrobianos dentro de las células incluyen la pared y membrana celular, enzimas metabólicas, síntesis de proteínas y sistema genético (Davidson y Branen, 1993, citados por García, et al., 2008) Considerando el gran número de diferentes grupos de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales, es importante decir que su actividad antimicrobiana no se atribuye a un mecanismo específico; sin embargo existen algunos sitios de acción en la célula, en dónde pueden ocurrir los siguientes efectos: daño a la membrana citoplásmica, degradación de la pared celular, daño a las proteínas, filtración del contenido celular, coagulación del citoplasma, y disminución de la fuerza motriz (Skandamis y Nychas, 2001, citados por García, et al., 2008) 4

5 4.1.4 El chile piquín (Capsicum annum L.) y sus propiedades El chile piquín (Capsicum annuum L var. aviculare Dierb.) es una planta que crece en forma silvestre en las regiones semiáridas del estado de Nuevo León, Laborde y Pozo (1982), mencionan que también se localiza en toda la zona costera de país, desde Sonora hasta Chiapas, por el Pacífico y desde Tamaulipas hasta la península de Yucatán, incluyendo Quintana Roo por el Golfo de México, donde es aprovechado por los habitantes de estos lugares y para los cuales reviste una gran importancia socioeconómica, el fruto es usado principalmente como alimento, en la elaboración de algunos platillos regionales (Almanza, 1993, citado por Moreno, et al., 2012). Otros atributos de los chiles incluyen algunas propiedades medicinales, cosmetologías, antisépticas y como repelentes de algunas plagas agrícolas, por lo que existe en la actualidad un interés por probar algunos componentes de los chiles como sinergistas de los insecticidas órgano-fosforados. Los poderes curativos del chile dependen de diferentes compuestos encontrados en las venas, las hojas y los tallos de las plantas. (Dewitt et al. 2000, citado por Moreno, et al., 2012), mencionan entre algunos de los componentes: la capsicina, la capsicidina, el capsidol, los capsianósidos y la capsicodendrina, compuestos que además de muchas otras propiedades han demostrado ser antibacteriales e incluso fungicidas (Moreno, et al., 2012) Pérdidas económicas por desarrollo de hongos en cultivos Las pérdidas económicas debidas a enfermedades de postcosecha en granos, frutas y hortalizas son provocadas principalmente por hongos y bacterias que causan la degradación de los tejidos y su consiguiente pudrición. El control de plagas y enfermedades dependen principalmente de la utilización de agroquímicos sintéticos, lo que ha incrementado la población de organismos fitopatógenos resistentes provocando un aumento significativo de los costos de producción y problemas graves de contaminación ambiental. A través del tiempo, los métodos de combate de microorganismos patógenos o deterioradores de alimentos, han tenido innovaciones significativas, las cuales han sido motivadas principalmente por la emergencia de 5

6 nuevos patógenos, la creciente demanda de alimentos y la necesidad de evitar la contaminación del medio ambiente. Tomando en cuenta estos tres factores, uno de los controles que ha adquirido mayor importancia en los últimos años, es aquel que basa su acción en el uso de sustancias de origen natural, esto es, extractos obtenidos de plantas con actividad como fungicidas, herbicidas bactericidas e insecticidas (Rovalo, 1983, citado por Moreno, et al., 2012) Cuál es uno de los hongos que más afecta al tomate? Agente causal: Botrytis cinerea. Distribución: En todo el mundo. Síntomas: Este hongo puede infectar todas las partes superficiales de la planta, y generalmente ingresa a través de lesiones. En el tallo, la infección inicial aparece como lesiones elípticas y acuosas. Bajo condiciones de humedad alta, estas lesiones crecen y se vuelven grises y mohosas, las cuales pueden rodear y matar a la planta. Este hongo comúnmente infecta la punta del cáliz de la fruta, en el cual se puede propagar rápidamente, formando lesiones esporulativas que van de gris a café y que después se vuelven pudrición acuosa. La mancha fantasma, un síntoma inusual en la fruta que se observa con frecuencia, se caracteriza por anillos pequeños que van de blanco a amarillo pálido que aparecen en fruta verde o roja. Éstas aparecen cuando el hongo infecta la fruta pero la enfermedad es detenida cuando la fruta se expone a la luz directa del sol o a las altas temperaturas. La mancha fantasma no se extiende, pero las manchas reducen la calidad comercial de la fruta (Seminis, s.f.). Condiciones para el desarrollo de la enfermedad: Este hongo tiene una amplia gama de hospederos, es un saprofito eficiente y puede sobrevivir en el suelo o en residuos vegetales infectados por largos periodos en forma de esclerocios. Es considerado un parásito débil, y típicamente infecta a las plantas a través de lesiones. Cuando la humedad es adecuada, se producen masas grises de esporas y se propagan inmediatamente a través del viento. Los climas nublados, fríos y húmedos son condiciones indispensables para el desarrollo de la enfermedad. La falta de espacio y la mala ventilación pueden causar problemas 6

7 severos de podredumbre gris. La actividad del hongo abarca un rango muy amplio de temperaturas comprendido entre 0 y 40º C, si bien la germinación de la conidias (propagadoras de la enfermedad) se activa con temperaturas próximas a 15º C (Seminis, s.f.). 4.2 Objetivo Objetivo general: Realizar una investigación experimental que nos permita conocer el factor inhibitorio del aceite esencial de tomillo y el extracto de capsicina del chile piquín ante uno de los hongos más comunes del tomate (Botrytis cinerea). Objetivos particulares: Conocer los mecanismos de acción de las sustancias presentes en el chile piquín y en el tomillo, que permiten inhibir el desarrollo de hongos y bacterias. Analizar en un cultivo del hongo mencionado, bajo distintos porcentajes del aceite esencial de tomillo y la capsicina, la capacidad de dichas sustancias para detener el desarrollo del hongo, en relación con su concentración. A partir de la investigación experimental del desarrollo del hongo in vitro, crear una cera que al cubrir los tomates, les otorgue mayor tiempo de vida y contribuya a evitar pérdidas económicas durante los periodos de exportación. 4.3 Problema Como se mencionaba anteriormente en el marco teórico, el desarrollo de microorganismos patógenos en el tomate, puede originar amplias pérdidas económicas al momento de exportar dicho producto, tanto internamente como externamente, sin embargo, nuestro país es tan rico en plantas con propiedades antifúngicas, que se debe comenzar a tomar provecho de ellas, por lo que ante tal situación se realizó el siguiente planteamiento del problema, bajo qué porcentaje de concentración, la capsicina y el aceite esencial de tomillo pueden inhibir el desarrollo del hongo Botrytis cinerea (uno de los hongos que más afecta al tomate)? 4.4 Hipótesis 7

8 Para realizar el proyecto, se planteó la siguiente hipótesis: Si al realizar el medio de cultivo, la concentración de la capsicina y del aceite esencial de tomillo presente en el mismo (cada sustancia en su respectivo medio), es del 50%; entonces se inhibirá el desarrollo del hongo Botrytis cinerea. 5. Desarrollo 5.1 Extracción del aceite esencial de tomillo Materiales y sustancias: Probeta de 250ml, vaso de precipitados de 250ml, 3 matraces Erlenmeyer de 250ml, mangueras de látex, embudo de vidrio, embudo de decantación, 3 pinzas de tres dedos con nuez, 3 soportes universales, 3 anillos de hierro, mechero de Bunsen, 3 tapones horadados, 2 varillas huecas de cristal, hojas de tomillo, agua, tubo refrigerante, papel filtro, 1 termómetro, sal. La obtención del aceite esencial de tomillo se realizó mediante una destilación por arrastre de vapor, lo primero que se pudo observar fue que conforme la temperatura del agua fue subiendo en el matraz que contenía los 400 ml de esta, el matraz con el tomillo se comenzó a empañar. Al momento en que la temperatura llegó a los 100 C, el agua comenzó a hervir y se produjo un burbujeo, por otra parte, la cantidad de vapor que se desprendía aumentó y se empezaron a notar gotas de agua caer poco a poco en el matraz con las hojas de tomillo; conforme el agua proveniente del primer matraz caía, se veía como se producía vapor en el segundo matraz, mismo que subía hasta llegar al tubo refrigerante, donde el flujo del agua provocaba que la temperatura cambiase, haciendo pasar al vapor de estado gaseoso a estado líquido. Conforme se producía la destilación por arrastre de vapor, se percibió un aroma fuerte, similar al de las infusiones, cuando dicho aroma dejó de percibirse, fue el momento en que se terminaron de arrastrar los compuestos del aceite esencial, y el mechero fue apagado para finalizar la extracción. La extracción funcionó gracias a que, cuando el vapor entró en contacto con el material vegetal, hizo que los compuestos aromáticos, que generalmente poseen un punto de ebullición más bajo que el agua, se vaporizaran y fueran arrastrados junto con el vapor hasta el tubo refrigerante, donde se condensaron junto con el vapor de 8

9 agua. También la temperatura del vapor hizo que las células y las estructuras vegetales se rompieran y liberaran más compuestos esenciales. En este caso el compuesto principal obtenido dentro del aceite esencial fue el timol, conocido como 2-isopropil-5-metilfenol. A continuación se puede observar la ruta crítica de dicha destilación Al finalizar la destilación, se dejo enfriar el aceite y se depositó a través de un embudo con papel filtro en un embudo de decantación, aplicando sal dentro del mismo para cambiar la densidad del agua y poder obtener el aceite en un grado de pureza mayor, Todo el proceso anterior se realizó tres veces para obtener una cantidad suficiente de aceite esencial para las pruebas, el total de aceite obtenido fue de 150 ml. 9

10 La destilación por arrastre de vapor se realizó basándose en los principios que marcan Peredo, et al., (2009). 5.2 Obtención de la capsicina del chile piquín Materiales y sustancias: 2 soportes universales, 1 termoagitador, 1 recipiente de vidrio para baño maría, 1 vaso de precipitados de 200 ml, 2 pinzas de tres dedos con nuez, 1 tubo refrigerante, mangueras de látex, 2 tapones horadados, 1 varilla hueca de cristal, 1 termómetro, 1 matraz erlenmeyer de 250 ml, 1 matraz de destilación, 1 licuadora, papel filtro, 1 embudo, agua, acetona pura, chile piquín, 1agitador de vidrio. Primero que nada, se molieron 500 gr de chile piquín seco en la licuadora hasta obtener un polvo homogéneo, los chiles se fueron depositando en varias tandas para evitar forzar el motor de la licuadora. Posteriormente, el polvo obtenido se fue colocando en el vaso de precipitados de 200 ml, en una relación de 1:5 (soluto-solvente) en masa con la acetona, por lo que primero se pesó el vaso de precipitados para después agregar 20 gr del polvo de chile piquín y posteriormente 100 gr de acetona pura, se agitó durante 15 minutos y se observó un cambio de color tanto en el polvo del chile piquín, como en la acetona que se había colocado, todo ello debido a que este proceso sirve para separar la capsicina mediante solventes orgánicos, al ser esta misma soluble en acetona. El líquido obtenido de la separación por solventes se colocó en el matraz de destilación mediante un embudo con papel filtro para proceder a separar la acetona y obtener un mayor grado de pureza de la capsicina mediante una destilación. Dicha destilación se llevo a cabo empleando la técnica de baño maría para transferir calor al matraz de destilación debido a que la acetona es un compuesto volátil, así que no podía estar en contacto directo con la fuente de calor, la temperatura a la que se colocó el termoagitador fue de 35 C ya que a esa temperatura la acetona se evapora. La destilación se efectuó durante 20 minutos. A continuación se puede observar la ruta crítica del proceso: 10

11 Todo lo indicado con anterioridad se repitió cinco veces para obtener la cantidad necesaria para las pruebas, con un volumen final total de 50 ml de extracto de capsicina. El proceso anterior se realizó de acuerdo a las especificaciones indicadas por Lobato, et al., (2014). 11

12 5.3 Cultivo del hongo Botrytis cinerea Materiales y sustancias: 200 gr de papa, 20 gr de agar, 10 gr de dextrosa, 1000 ml agua, 1 matraz de 1 litro, antibiótico de amplio espectro algodón con gasa, 2 mecheros de Bunsen, autoclave, incubadora, 24 cajas de petri, asa bacteriológica, 3 pipetas de plástico, aceite esencial de tomillo, extracto de capsicina, muestra del hongo, cinta parafilm, 1 torunda. La muestra del hongo fue obtenida gracias a que uno de los tomates que se habían comprado como parte de la despensa de uno de los integrantes del equipo comenzó a podrirse y se generó el hongo descrito con anterioridad en el marco teórico, por lo que dicho tomate fue aislado y colocado en una bolsa sellada para ser usado el día de la siembra del hongo en el cultivo. El medio de cultivo se preparó calentando los 200 gr de papas en 500 ml de agua hasta que estas estuvieran suaves, momento en el que se exprimieron con ayuda de una tela porosa para obtener el caldo rico en nutrientes. Posteriormente el caldo fue depositado en el matraz junto con los 20 gr de agar, 10 gr de dextrosa y 1 mg de clindamicina para inhibir el crecimiento de bacterias que puedan intervenir con los resultados del experimento. Se mezclaron todas las sustancias y se colocó la base del matraz cerca del mechero para clarificar la mezcla. Posteriormente se tapó la boquilla del matraz con una torunda y se colocó en autoclave para esterilizar a 15 libras de presión durante 15 minutos. Al terminar la esterilización, se vertió el medio de cultivo en las cajas de petri con distintos porcentajes de concentración de los extractos de las sustancias obtenidas en los procesos anteriores de la siguiente manera: Pruebas con el aceite esencial de tomillo Control: 0% 10% 30% 50% 20 ml de medio de cultivo. 18 ml de medio de cultivo, 2 ml de aceite esencial de tomillo. 14 ml de medio de cultivo, 6 ml de aceite esencial de tomillo. 10 ml de medio de cultivo, 10 ml de aceite esencial de tomillo. Pruebas con el extracto de capsicina 12

13 Control: 0% 10% 30% 50% 20 ml de medio de cultivo. 18 ml de medio de cultivo, 2 ml extracto de capsicina. 14 ml de medio de cultivo, 6 ml de extracto de capsicina. 10 ml de medio de cultivo, 10 ml de extracto de capsicina. Las cajas de petri con los medios de cultivo dejaron reposar durante 48 horas para comprobar que no se desarrollara algún microorganismo ajeno a la investigación. Al terminar el periodo de prueba, se procedió a realizar la siembra. La mesa de trabajo del laboratorio fue limpiada con jabón y alcohol y se prendieron dos mecheros para crear una zona de siembra estéril. El asa bacteriológica se esterilizó con el mechero antes y después de cambiar de caja de petri. Para colocar el hongo, se realizaron movimientos en zig-zag a lo largo de la superficie para formar estrías en la misma. Al finalizar, las cajas fueron selladas con cinta parafilm alrededor del borde y la mesa de trabajo se limpió nuevamente con jabón y alcohol. Las cajas de petri con la siembra del hongo se colocaron en una incubadora para mantenerlas seguras durante tres días a temperatura ambiente ya que tal como lo menciona la organización Seminis (s.f.), el hongo se desarrolla de mejor manera en temperaturas próximas a los 15 C y 24 C, temperatura que estuvo presente durante los días de la investigación, oscilando entre los 14 C y los 25 C. La preparación del medio de cultivo se realizó de acuerdo a lo indicado en el documento Anexo I: Preparación de Medios de Cultivo, ubicado en la biblioteca digital de tesis cuyo enlace se encuentra en la bibliografía. Figura 1.0 Tomate con el hongo Botrytis cinerea. Figura 1.1 Medios de cultivo con distintos porcentajes de los extractos. 13

14 Figura 1.2 Zona de siembra estéril. Figura 1.3 Se realiza la siembra del hongo con el asa bacteriológica previamente esterilizada. Figura 1.4 Se tapa la caja de petri. Figura 1.5 Se sella la caja de petri con cinta parafilm. Figura 1.6 Medios de cultivo con aceite esencial de tomillo: control, 10%, 30% y 50% (de izquierda a derecha). Figura 1.7 Medios de cultivo con extracto de capsicina: control, 10%, 30% y 50% (de izquierda a derecha). Figura 1.8 Las cajas de petri dentro de la incubadora. Figura 1.9 Se deposita el medio de cultivo en las cajas de petri. 5.4 Elaboración de la cera Materiales y sustancias: 2 tazas de azúcar blanca, ¼ de taza de jugo de limón, ¼ de taza de agua, 3 tazas, 1 cacerola, estufa, aceite esencial de tomillo, extracto de capsicina, 1 pala o agitador, 1 termómetro, 2 recipientes de 1 litro. 14

15 El proceso para realizar la cera fue sumamente sencillo, ya que consistió únicamente en mezclar todas las sustancias mencionadas anteriormente hasta que llegaran a los 120 C, agitando constantemente; en caso de que la consistencia sea muy espesa, se puede añadir más agua para cambiar su consistencia. La cera fue elaborada a partir de azúcar debido a que dicho componente orgánico es soluble en agua, por lo que al momento de que los tomates lleguen a los hogares de las personas, pueda ser sencillo lavarlos y quitarles dicha cera. Una cantidad de la cera obtenida fue mezclada en una relación 50/50 con el aceite esencial de tomillo, de igual forma, el resto fue mezclado con una relación 50/50 con el extracto de capsicina del chile piquín. La cera fue aplicada en los tomates y se dejaron en una zona done recibieran la luz del sol y el calor para observar su comportamiento. 6. Resultados 6.1 Pruebas in vitro Día uno: Los tres medios de cultivo control comenzaron a presentar un desarrollo del hongo que se podía observar como pequeños puntos. De los medios que contenían un 10% de concentración del aceite esencial de tomillo, uno de ellos mostró pequeños puntos en los cuales el hongo comenzaba a crecer. De igual forma, en uno de los cultivos que contenía un 10% de extracto de capsicina se comenzó a observar un punto pequeño. Los cultivos con el 30% y 50% de concentración, por parte de ambos extractos, no mostraron desarrollo del hongo. Muestra Control 15

16 10% aceite esencial de tomillo 30% aceite esencial de tomillo 50% aceite esencial de tomillo Control 10% extracto de capsicina 30% extracto de capsicina 50% extracto de capsicina Día dos: Los medios de cultivo que funcionaban como control comenzaron a tener un desarrollo más notorio del hongo sembrado. No se detectaron avances del crecimiento del hongo en los medios con la concentración del 10% por parte de ambas sustancias. En dos de los medios de cultivo con concentración del 30% de aceite esencial de tomillo se comenzó a desarrollar de manera poco perceptible el hongo, algo que también sucedió en uno de los medios de cultivo con extracto de 16

17 capsicina al 30%. Las muestras con concentraciones del 50% permanecieron sin mostrar crecimiento del hongo. Muestra Control 10% aceite esencial de tomillo 30% aceite esencial de tomillo 50% aceite esencial de tomillo Control 10% extracto de capsicina 30% extracto de capsicina 17

18 50% extracto de capsicina Día tres: Varias de las pruebas control tuvieron un desarrollo muy notorio del hongo. En los medios con el 10% de concentración de aceite esencial de tomillo, el desarrollo comenzó propagarse, a diferencia de la muestra con el 10% de capsicina, misma en la que el hongo casi no creció tanto desde el día dos. Los cultivos con concentraciones del 30% comenzaron a tener un desarrollo del hongo solo en algunas zonas. Los medios con el 50% continuaron sin mostrar desarrollo del hongo. Muestra Control 10% aceite esencial de tomillo 30% aceite esencial de tomillo 50% aceite esencial de tomillo 18

19 Control 10% extracto de capsicina 30% extracto de capsicina 50% extracto de capsicina 6.2 Pruebas in vivo Día uno: No hubo ningún cambio notable, sin embargo hay que destacar que los tomates que tienen la cera muestran una mejor presentación debido al brillo que les proporciona, a diferencia de los tomates que no tenían cera, que lucían menos. Muestra Control Tomates con cera del 50%de aceite esencial de tomillo. Tomates con cera del 50% de extracto de capsicina. 19

20 Día dos: Los tomates con la cera no mostraron cambios notables, al sentirlos su consistencia continuaba siendo firme, a diferencia de los tomates sin cera, que se sentían más blandos. Muestra Control Tomates con cera del 50%de aceite esencial de tomillo. Tomates con cera del 50% de extracto de capsicina. Día tres: Los tomates con cera se continuaron conservando de manera correcta y su presentación no cambió, los tomates sin cera que comenzaban a notarse con un tono menos fresco y su consistencia resultó ser un poco más blanda que el día anterior, además comenzaron a aparecer manchas negras en su cáscara. Muestra Control Tomates con cera del 50%de aceite esencial de tomillo. Tomates con cera del 50% de extracto de capsicina. 7. Análisis e interpretación de resultados Según Davidson y Branen (1993), citados por García, et al. (2008), hay estudios que demuestran que el carvacrol y el timol tienen varios sitios de acción dentro de las células, y dependiendo de las concentraciones utilizadas pueden causar la inhibición 20

21 o inactivación de los microorganismos. Los blancos o puntos de ataque de estos agentes antimicrobianos dentro de las células incluyen la pared y membrana celular, enzimas metabólicas, síntesis de proteínas y sistema genético. Además, según Skandamis y Nychas (2001), citados por García, et al. (2008), considerando el gran número de diferentes grupos de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales, es importante decir que su actividad antimicrobiana no se atribuye a un mecanismo específico; sin embargo existen algunos sitios de acción en la célula, en dónde pueden ocurrir los siguientes efectos: daño a la membrana citoplásmica, degradación de la pared celular, daño a las proteínas, filtración del contenido celular, coagulación del citoplasma, y disminución de la fuerza motriz. Nosotros concordamos con lo mencionado por dichos autores debido a que mediante las pruebas in vitro se logró determinar el porcentaje de concentración de el aceite esencial de tomillo que inhibe el desarrollo del hongo Botrytis cinerea, ello debido a las modificaciones celulares que dicho extracto puede llegar a generar en organismos patógenos, impidiendo procesos fundamentales para que la célula pueda realizar sus funciones vitales y por consiguiente propiciando su muerte. En el caso del aceite esencial de tomillo, la concentración que inhibió más el crecimiento de dicho hongo fue la del 50%, seguida de la del 30% y finalmente la del 10%. Gracias a lo anterior, la concentración usada para la cera fue la del 50%, dando un mayor tiempo de vida a los tomates en los que se colocó la cera, a diferencia del tomate control. Por otra parte, según Moreno, et al. (2012) los atributos de los chiles incluyen algunas propiedades medicinales, cosmetologías, antisépticas y como repelentes de algunas plagas agrícolas, por lo que existe en la actualidad un interés por probar algunos componentes de los chiles como sinergistas de los insecticidas órganofosforados. Los poderes curativos del chile dependen de diferentes compuestos encontrados en las venas, las hojas y los tallos de las plantas. Y según Dewitt et al. (2000) citado por Moreno, et al., (2012), mencionan entre algunos de los componentes: la capsicina, la capsicidina, el capsidol, los capsianósidos y la 21

22 capsicodendrina, compuestos que además de muchas otras propiedades han demostrado ser antibacteriales e incluso fungicidas. De igual manera, se concuerda con dichos autores debido a que la presencia de la capsicina en los medios de cultivo tuvo un efecto inhibitorio muy notorio en las concentraciones del 30% y del 50%, mientras que en la del 10% el desarrollo del hongo fue mayor. Debido a lo observado in vitro, se optó por usar la concentración del 50% de capsicina en la cera, mostrando resultados muy importantes ya que a diferencia del tomate control, los tomates con la cera se apreciaban mucho mejor conservados y con una mejor presentación. Finalmente, según Gómez (2011), los recubrimientos a base de ceras o de otros productos (como polisacáridos), juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la calidad organoléptica de frutas frescas durante sus procesos de comercialización, fundamentalmente cuando se exportan a largas distancias. La tecnología de la formulación de estos recubrimientos continúa avanzando para conseguir cada vez en mayor medida una optimización del producto por cultivo y objetivo pretendido. Nosotros concordamos con dicho autor debido a que el producto final al que se llegó después de la investigación en el laboratorio, es una cera que puede permitir aumentar el tiempo de vida de los tomates que son exportados a grandes distancias y por consiguiente, reducir las pérdidas económicas que puede generar su temprana descomposición. 8. Conclusiones El objetivo general planteado al comienzo de la investigación se cumplió de manera correcta, ya que a través de las pruebas in vitro de nuestra experimentación, logramos conocer el factor inhibitorio del aceite esencial de tomillo y el extracto de capsicina del chile piquín ante uno de los hongos más comunes del tomate (Botrytis cinerea). En cuanto a los objetivos particulares, todos se cumplieron de forma correcta, salvo por el hecho de que tras la investigación, no se logró conocer de 22

23 manera precisa el mecanismo de acción que la capsicina efectúa para inhibir el desarrollo de microorganismos patógenos. Por su parte, la cera elaborada fue un objetivo particular logrado correctamente dentro de este proyecto, debido a que muchas veces las investigaciones científicas se quedan como tales, sin sacar el máximo provecho de lo descubierto dentro de ellas; sin embargo el presente proyecto es muy completo debido a que con base en lo analizado en el laboratorio, se procedió a crear un bien que pueda contribuir a mejorar la economía de nuestro país, en este caso una cera que tiene la capacidad de aumentar el tiempo de vida del tomate, y otro aspecto importante de ello es que el hongo con el que se realizaron las pruebas, es muy común en las frutas, por lo que la cera creada puede servir también para otros tipos de cultivos. A pesar de lo anterior, se deben seguir realizando pruebas para mejorar la cera y hacer que tenga una mayor duración, además se deben buscar métodos eficientes para su producción en masa. En adición a lo anterior, la hipótesis fue comprobada ya que en los medio de cultivo cuya concentración del aceite esencial de tomillo y el extracto de capsicina era del 50%, no se desarrollo el hongo; en los del 30% tuvo un desarrollo más lento, pero finalmente se dio, especialmente en los medios que contenían el aceite esencial de tomillo, ya que los del extracto de capsicina casi no mostraron indicios del hongo; y en los que tenían una concentración del 10%, tanto de aceite esencial de tomillo como de capsicina, el hongo se desarrolló más fácilmente. Dentro de las pruebas control el hongo se desarrollo sin ningún problema. El presente proyecto representa una de las muchas formas en que la ciencia puede apoyar a ámbitos tan variados de la vida; siempre hay que tratar de buscar soluciones a los problemas que surgen y hacer lo mejor por ayudar a nuestro país, en este caso, los resultados generados pueden ser empleados para mejorar las exportaciones de México y fortalecer los ingresos, evitando pérdidas de productos sumamente valiosos como lo son los cultivos que producimos. 23

24 9. Fuentes de información Rodríguez, A., et al, (2015). Efecto antifúngico de extractos fenólicos y de carotenoides de chiltepín (Capsicum annum var. glabriusculum) en Alternaria alternata y Fusarium oxysporum. Revista argentina de Microbiología. Buenos Aires: Elsevier, p Autor anónimo, (s.f.). Anexo I: Preparación de medios de cultivo. Recuperado de: el 18 de diciembre a las 15:24. Fundación Española de la Nutrición, (s.f.). Tomillo. Recuperado de: el 17 de diciembre de 2016 a las 14:30. García, R., et al., (2008). Mecanismos de acción antimicrobiana de timol y carvacol sobre microorganismos de interés en alimentos. Recuperado de: el 20 de diciembre a las 19:27. Gómez, E. (2011). Recubrimientos para frutas y hortalizas. Recuperado de: as_hortalizas.pdf, el 10 de enero de 2017 a las 16:45. Lobato, C., et al., (2014). Manual de procedimiento para la extracción de capsaicina de chile habanero. Recuperado de: el 14 de diciembre de 2016 a las 20:13. Marqués, M. (2015). Composición química de los aceites esenciales de lavanda y tomillo. Determinación de la actividad antifúngica. Recuperado de: UES%20CAMARENA_ pdf?sequence=1, el 12 de diciembre de 2016 a las 18:24. Moreno, S., et al. (2012). Efecto antifúngico de capsaicina y extractos de chile piquín (Capsicum annuum l. var aviculare) sobre el crecimiento in vitro de Aspergillus flavus. Recuperado de: 24

25 el 16 de diciembre de 2016 a las 20:13. Peredo, H., et al. (2009). Aceites esenciales: métodos de extracción. Recuperado de: pdf, el 27 de diciembre de 2016 a las 17:12. Rosas, A. y Lópéz, A. (2011). Actividad antimicrobiana del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris). Recuperado de: pdf, el 15 de diciembre de 2016 a las 19:43. Rovetto, et al., (2009). Aplicaciones medicinales del tomillo. Recuperado de: el 21 de diciembre de 2016 a las 16:02. Seminis (s.f.). Guía de la enfermedad del tomate. Recuperado de: edades/guia%20enfermedad%20tomate.pdf, el 18 de diciembre a las 19:27. 25