Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobiana y Técnicas de Biología Molecular

Transcripción

1 Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobiana y Técnicas de Biología Molecular Dr. Juan Carlos Hormazábal O. Subdepto. Enfermedades Infecciosas Agenda: Generalidades Biología a Molecular en Bacteriología: a: Diagnóstico Caracterización Vigilancia y confirmación K. pneumoniae productora de Carbapenemasa

2 Resistencia Antimicrobiana Una Amenaza Global Impacto Transversal Paciente Salud Pública Económico Social Inmigración, Viajes Uso Antimicrobianos Plasmodium Virus Fiebre Amarilla Rikettsia Vibrios SAMR Comunitario SARS MDR TBC E. Coli STEC Laboratorio HCV Coxiella burnetii Bartonella Brucella S pneumoniae Resistente Bartonella Virus Influenza Leptospira Ehrlichia Virus Nilo Occidental Cambio Climático Intercambio comercial Pob. Susceptible

3 Resistencia Antimicrobiana Visión Integrada Mundo Animal Hospital IAAS Comunidad Ambiente Nuevas formas de resistencia antimicrobiana como resultado del amplio uso de antimicrobianos. La determinación genética de los mecanismos de resistencia ha permitido el uso de métodos de Biología Molecular.

4 La bacteriología clínica clásicamente se subdivide en dos importantes componentes: Identificación (diagnóstico) Tipificación La biología molecular ha sido el gran responsable de una profunda revolución en el entendimiento del comportamiento de las poblaciones bacterianas teniendo un directo impacto en el diagnóstico y tipificación de agentes infecciosos. 1. Diagnóstico La ventajas de las técnicas moleculares radican en su sensibilidad, especificidad y bioseguridad. Este ultimo aspecto se fundamenta en que estas metodologías no requieren la presencia del agente infeccioso vivo, ya que las pruebas moleculares se pueden realizar en muestras o extractos sometidos a procesos químicos de inactivación

5 Tradicionalmente la identificación taxonómica de agentes bacterianos: Cultivo Microscopía o morfología Características bioquímicas y serológicas Genero y Especie Bacteriana Áreas de desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de agentes infecciosos bacterianos. Identificación rápida de agentes infecciosos en pacientes críticos. Identificación rápida de agentes infecciosos fastidiosos o de lento cultivo en que los métodos tradicionales no presentan un buen desempeño (microbiológicos y/o serológicos) Identificación de agentes no viables o no cultivables. Determinación rápida de resistencia antimicrobiana. Diagnóstico de agentes infecciosos de alto riesgo biológico

6 Técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico bacteriano Hibridación Amplificación, Reacción de la Polimerasa en Cadena PCR en Tiempo Real Hibridación Reversa Métodos Basados en secuenciación Espectrometría de Masas MaldiTof Métodos genéticos pueden entregar resultados en menor tiempo Útil en agentes de crecimiento lento. Solo útil si se conoce la genética del mecanismo de resistencia. Métodos convencionales detectan resistencia en forma global.

7 Potenciales Ventajas de Métodos Genéticos: Se pueden realizar directamente sobre muestras clínicas. Genotipo Expresión Fenotípica. Determinación genotípica mas veloz que la fenotípica (organismos de crecimiento lento). Estándares Calidad Utilidad en agentes no cultivables. Menor riesgo biológico frente a agentes peligrosos. Desventajas de Métodos Genéticos en Susceptibilidad. Métodos genéticos podrían detectar resistencia expresada a un nivel que no sea clínicamente relevante. Falsos positivos por contaminación de la muestra. Estandarización y control de calidad multicéntrico aún en etapas iniciales.

8 Desventajas de Métodos Genéticos en Susceptibilidad. Falta de sensibilidad si concentración de organismos es baja en la muestra. Diferentes pruebas son requeridas para cada antimicrobiano. Resistencia a un determinado antimicrobiano puede ocurrir por varios mecanismos asociados involucrando diferentes genes de resistencia. Para algunos agentes, los mecanismos genéticos son aún desconocidos. PCR en la Detección de Resistencia Antimicrobiana. Biología Molecular clave en el entendimiento de los mecanismos de resistencia bacteriana. PCR permite detectar resistencia en cepas y directamente en muestras clínicas. Presencia del gen v/s expresion.

9 PCR en la Detección de Resistencia Antimicrobiana. Agente Resist. Gen blanco S. aureus y coag. negat. Meticilina, meca Meticilino resist. atb Betalactam. Enterococcus spp. Vancomicina vana, vanb, vanc1, vanc2, VanC3. Enterobacterias product. Cefalosporinas SHV, TEM -lactamasas expectro expandido M. tuberculosis Isoniacida kat-g, inha, ahpc Rifampicina rpob PCR: Reacción de la Polimerasa en Cadena. La PCR es una herramienta integral en Biología Molecular, que debido a su versatilidad y fácil estandarización se ha convertido en una pieza clave tanto en el área de la investigación como en el diagnóstico.

10 Historia de la PCR: 1983 Kary Mullis inventa la PCR Primera Publicación Científica Cetus Corp. y Perkin Elmer inician desarrollos de reactivos e instrumentos para PCR Se publica el uso de la Taq Polimerasa en PCR. (Saiki et Al.) 1990/1993 Gran batalla por los derechos de fabricación de reactivos para PCR Kary Mullis recibe el Premio Nobel en Química. PCR. Buffer MgCl dntps 5 Primer 3 ADN polimerasa 3 5 Cadena libre ADN madre

11 Ciclos Térmicos de la PCR. Denaturación inicial 95ºC Ciclo 1 Ciclo 2 Etc., etc Temp. 72ºC 55ºC Tiempo Acumulación Teórica de Productos de Amplificación. N Ciclos N Copias doble hebra

12 PCR Gel Image Enterococcus spp. Detección de Genotipo Van

13 Enterobacteriaceae: E. coli, K. pneumoniae BLEE TEM SHV OXA CTX-M PER VEB TLA SFO GES Determinación BLEE: Punto isoeléctrico. Isoelectric focusing of SHV-25 and SHV-26 carriers and the E. coli strains into which SHV-25 and SHV-26 were cloned. Lane 1, TEM-1 and SHV-1 standard; lane 2, SHV-26 carrier; lane 3, SHV-25 carrier; lane 4, cloned SHV-26 carrier; lane 5, cloned SHV-25 carrier. The numbers indicate pi values

14 2. Las herramientas moleculares en tipificación bacteriana pueden clasificarse en cuatro principales categorías: Tipificación por patrones de restricción Tipificación por amplificación Tipificación por secuenciación Tipificación por hibridación Tipificación por patrones de restricción Esta metodología de tipificación discrimina las bacterias estudiadas en base a diferencias en el tamaño de los fragmentos de ADN generados por amplificación o por cortes producidos por enzimas de restricción. Electroforesis de campo pulsado (PFGE) Esta tecnica se basa en la digestión específica del ADN genómico de la bacteria por enzimas endonucleasas o de restricción, las cuales reconocen sitios específicos en el cromosoma generando largos fragmentos de ADN (10kb a 10Mb) La aplicación de un complejo sistema de pulsos electricos alternantes, en diversos angulos, permite separar en el gel de agarosa estos grandes fragmentos, generando un patron de bandas llamado huella digital bacteriana o fingerprinting

15 PFGE Modelo Criterios de Tenover para la interpretación de perfiles de PFGE Categoría Nº bandas diferentes Nº eventos genéticos Interpretación epidemiológica Indistinguible 0 0 Aislamiento es parte del brote Muy relacionado 2\3 1 Aislamiento probablemente es parte del brote Posiblemente relacionado 4\6 2 Aislamiento posiblemente es parte del brote Diferente >=7 >=3 Aislamiento no es parte del brote Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.

16 PFGE : Cambios en los patrones frente a eventos genéticos Cambios en el ganancia de \pérdida de inserción de \deleción de Fragmento de 400 kb ninguno sitio de restricción un fragmento de 50 kb Fragmentos resultantes Lane PFGE gel Kb \ A B C D E Nº of diferences Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP. PFGE de brote de Serratia marcescens Dr. J. C. Hormazábal, Bacteriología, ISP.

17 Ribotipificación Es una variante del RFLP, en que el area a analizar se circunscribe al operón ribosomal que se compone de tres genes (16S, 23S y 5S) y que codifican el RNA ribosomal (rrna). Debido a su rol vital en la síntesis polipeptídica bacteriana estos genes se caracterizan por presentar secuencias altamente conservadas Esta metodología incluye un proceso de digestión por enzimas de restricción de alta frecuencia de sitios de reconocimiento, seguido de separación de fragmentos por electroforesis, transferencia a membrana de nitrocelulosa o nylon y posterior hibridación con sondas marcadas. Esta metodología permite tipificar geneticamente los agentes bacterianos con un poder resolutivo menor que la PFGE. Tipificación por secuenciación Durante los últimos años, con la disponibilidad de secuenciadores automáticos cada vez más veloces y accesibles, las técnicas de tipificación basadas en secuencias nucleotídicas han alcanzado un mayor desarrollo Tipificación por secuenciación de multilocus MLST Esta metodología se basa en la secuenciación de fragmentos internos de siete housekeeping genes, es decir genes altamente conservados ya que codifican pasos metabólicos fundamentales para la vida de la bacteria Estos fragmentos de bp son secuenciados e ingresados a una base de datos en línea (

18 Confirmación y Caracterización Genética Herramientas Epi-Mol Tipificación Genética. MLST RIBOTIP. PFGE Tiempo evolutivo medido en cambios. MLST: Gold Standard para relaciones evolutivas PFGE: Gold Standard para análisis de brotes

19 RED DE VIGILANCIA ENFERMEDADES TRANSMISIBLES SUB SISTEMAS DE VIGILANCIA Vigilancia de Morbilidad Vigilancia Universal Caso a Caso Vigilancia Basada en Centinela Vigilancia de Brotes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos VIGILANCIA ENFERMEDADES TRANSMISIBLES Vigilancia de Laboratorio Vigilancia de Agentes Etiológicos Vigilancia de Resistencia Antimicrobiana Vigilancia Ambiental Control de Animales Control de Vectores Monitoreo Ambiental: agua, aire, suelo, vivienda.. Control de Alimentos

20

21 Confirmación de Carbapenemasas en Enterobacterias Aislamientos estudiados en el Instituto de Salud Pública Región Año XV I 1 4 II 2 20 III 0 2 IV 4 26 V RM VI 4 20 VII 2 26 VIII 10 9 IX X 3 50 XI 0 2 XIV Total aislamientos Al 31 de Diciembre del 2012, el Laboratorio de Referencia del ISP ha confirmado 7 aislamientos bla KPC (6 K. pneumoniae, 1 E. coli ) correspondientes a 6 casos Instituto de Salud Pública: Confirmación de Carbapenemasas en Enterobacterias 1. Detección de Carbapemasas por PCR: bla KPC E.coli K. p C (+) C (-) bla SME (831 pb) bla IMP (587 pb) bla VIM (261 pb) bla KPC (331 pb) Yigit et al AAC. 45 :

22 2. Determinación tipo bla KPC por amplificación y secuenciación 3. Subtipificación por PFGE 4. Determinación de linaje genético por Secuenciación de Multilocus (MLST), según protocolo y base de datos internacional Instituto Pasteur, Francia. ST: Tipo de Secuencia Diancourt L, J Clin Microbiol. 2005, Aug;43(8): MLST Tipificación por Secuenciación de Multilocus Secuenciación de fragmentos internos de 7 genes altamente conservados Fragmentos K. pneumoniae Secuenciar Perfil Alélico MLST DataBase ST Secuenciación de multilocus (MLST) revela ST relacionados a ST258

23 Instituto de Salud Pública Confirmación de Enterobacterias portadoras de KPC en Chile 14 de Marzo de 2012 Caso importado de Europa Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST de Abril de º Caso Autóctono en Chile Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST11 E. coli KPC-2 Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública Paciente 2 (Primer caso autóctono KPC) Paciente Sexo masculino Fecha informe: 14 de Abril de 2012 Muestra: Prótesis vía biliar Procedencia: Centro Hospitalario 2 Región Metropolitana. Resultados: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST 11 E. coli KPC-2 positivo Tipificación por MLST, en proceso. Paciente 3 Paciente sexo masculino Fecha de Informe: 19/04/2012 Muestra: Aspirado endotraqueal. Procedencia: Centro Hospitalario 2 Región Metropolitana. Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST 11

24 Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública Paciente 4 Paciente sexo femenino Fecha Informe: 26/04/2012 Muestra: Expectoración. Procedencia: Centro Hospitalario 3 Región Metropolitana Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST: ST258 Paciente 5 Paciente sexo masculino Fecha Informe: 26/04/2012 Muestra: Sangre. Procedencia: Centro Hospitalario 3 Región Metropolitana Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC-2 Tipificación por MLST:ST25 Casos Autóctonos Confirmados por Instituto de Salud Pública Paciente 6 Paciente sexo femenino Fecha informe: 01/06/2012 Muestra: Secreción Procedencia: Centro Hospitalario 1 Temuco Resultado: Klebsiella pneumoniae. KPC-2 positiva Tipificación MLST: ST11

25 Casos Autóctonos Confirmados por ISP Año 2013 Paciente 7 Paciente sexo masculino Fecha Informe: 27/03/2013 Muestra: Orina Procedencia: Centro Hospitalario 5 Región Metropolitana Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC (Pendiente) Tipificación por MLST: Pendiente Paciente 8 Paciente sexo masculino Fecha Informe: 27/03/2013 Muestra: Orina Procedencia: Centro Hospitalario 5 Región Metropolitana Resultado: Klebsiella pneumoniae KPC(pendiente) Tipificación por MLST (Pendiente) Paciente 9 Procedencia Centro Hospitalario RM Resultado K. pneumoniae KPC MLST ST Nuevo en curación n base de datos Subtipificación n Molecular K. pneumoniae KPC positivas por PFGE. ISP, Marzo 2013

26 El Instituto de Salud Pública Confirma la presencia de K. pneumoniae productora de carbapenemasa en 8 casos autóctonos La electroforesis de campo pulsado revela polimorfismo (bajo componente clonal) El aislamiento corresponde a Klebsiella pneumoniae KPC-2 y tipo de secuencia ST11, ST25, ST258 en el análisis de MLST (Multilocus Sequence Typing, según base de datos Instituto Pasteur, Francia) El clon de Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST258, ha sido reconocido internacionalmente como el mayor responsable de la diseminación mundial de Klebsiella pneumoniae productora de carbapenemasa En nuestro país se han detectado tres aislamientos ST11, los cuales se integran al complejo clonal ST258, es decir se establecen genéticamente cercanos a Klebsiella pneumoniae KPC-2 ST258

27 Gracias!